專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雙膜結(jié)構(gòu)移植材料的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程和生物材料領(lǐng)域，涉及一種雙膜結(jié)構(gòu)移植材料，特別涉及一種干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)移植材料的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
目前，利用干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行組 織缺損修復(fù)通常采用干細(xì)胞懸液和外源性支架材料復(fù)合的方法，主要形式有三種:單純細(xì)胞懸液局部移植；細(xì)胞懸液接種于外源性支架材料；細(xì)胞懸液接種于支架材料后體外行三維培養(yǎng)。然而，上述移植方法存在諸多不足:首先，細(xì)胞在用胰酶消化獲得懸液的過(guò)程中，細(xì)胞間信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞本身的活性也受到了影響；其次，細(xì)胞移植的量難以控制，細(xì)胞量太少，細(xì)胞難以迅速定植于移植局部，細(xì)胞量太多，又會(huì)造成局部細(xì)胞堆積，不利于細(xì)胞伸展和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；最后，支架材料的移植和降解可能造成宿主毒性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，而未降解的支架材料會(huì)造成纖維包裹，影響血供和組織結(jié)構(gòu)重建。因此，需要尋找一種制備干細(xì)胞復(fù)合支架材料的新方法，減少干細(xì)胞的流失，提高其生物學(xué)活性，減少支架材料的吸收和宿主的免疫反應(yīng)，提高組織缺損修復(fù)的效果。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種CSF復(fù)合PRF的雙膜結(jié)構(gòu)的移植材料及其制備方法和用途，CSF (cell sheet fragment)即細(xì)胞膜片片段，PRF(platelet-rich fibrin)為富血小板纖維蛋白，本發(fā)明的移植材料能夠應(yīng)用于如軟骨、軟組織缺損的修復(fù)及牙髓、牙周膜組織的再生，有效提高組織修復(fù)的效果。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種雙膜結(jié)構(gòu)移植材料，其特征在于:由干細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜顆粒組成。優(yōu)選的，所述干細(xì)胞選自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞或牙周膜干細(xì)胞。優(yōu)選的，所述富血小板纖維蛋白膜片顆粒經(jīng)由血液離心后獲得。優(yōu)選的，細(xì)胞膜片采用六孔板進(jìn)行制備，細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細(xì)胞膜片數(shù)量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數(shù)=I: 3.5 4.0。優(yōu)選的，所述干細(xì)胞和富血小板纖維蛋白均來(lái)源于同一個(gè)體。優(yōu)選的，干細(xì)胞必須制備成細(xì)胞膜片片段的形式。一種移植材料的制備方法，其特征在于其制備過(guò)程包括以下步驟:第一步，干細(xì)胞膜片的培養(yǎng):原代干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于六孔板，待生長(zhǎng)融合至80%時(shí)以膜片誘導(dǎo)液予以培養(yǎng)，3天換液一次，待細(xì)胞膜片周?chē)霈F(xiàn)卷曲時(shí)認(rèn)為細(xì)胞膜片成熟；
第二步，制備干細(xì)胞膜片片段:用機(jī)械剝離的方法將細(xì)胞膜片從培養(yǎng)皿中剝離，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成細(xì)胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:根據(jù)所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無(wú)菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘后，無(wú)菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細(xì)胞端于無(wú)菌紗布上輕蘸以去除多余紅細(xì)胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細(xì)胞，將后者平鋪置于無(wú)菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅(jiān)韌膜狀結(jié)構(gòu)，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒；第四步，將制備的細(xì)胞膜片片 段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，按照比例手動(dòng)將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細(xì)胞膜片片段與富血小板纖維蛋白膜復(fù)合后形成的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料。優(yōu)選的，細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細(xì)胞膜片數(shù)量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數(shù)=I: 3.5 4.0。本發(fā)明的移植材料在口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明的移植材料在制備口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復(fù)用移植材料中的用途。本發(fā)明的移植材料與其他生物材料組成的復(fù)合材料在制備組織缺損修復(fù)用移植材料中的用途。一種干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料，由干細(xì)胞膜片片段、富血小板纖維蛋白膜顆粒組成。干細(xì)胞形式根據(jù)修復(fù)組織的類(lèi)型可不同，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞及牙周膜干細(xì)胞等，富血小板纖維蛋白膜為血液經(jīng)離心后制備獲得。體外進(jìn)行二者配比的篩選，以干細(xì)胞的增殖、分化作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定二者最佳體積比為:六孔板獲得細(xì)胞膜片:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液=I: 3.5 4.0。按照該配比進(jìn)行移植物的制備，再將其移植至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，結(jié)果證明，該配比下的雙膜結(jié)構(gòu)移植物具有良好的組織修復(fù)與組織再生作用。移植材料兩組分混合的方式是:將干細(xì)胞制備成膜片片段形式，富血小板纖維蛋白膜制備成顆粒狀(大小約0.5mmX0.5mmX0.5mm), 二者于無(wú)菌培養(yǎng)皿中手動(dòng)機(jī)械混勻，使二組分充分混合。本發(fā)明還提供了所述干細(xì)胞膜片片段及富血小板纖維蛋白膜顆粒的制備方法，包括以下步驟:第一步，干細(xì)胞膜片的培養(yǎng):原代干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于六孔板，待生長(zhǎng)融合至80%時(shí)以膜片誘導(dǎo)液予以培養(yǎng)，3天換液一次，待細(xì)胞膜片周?chē)霈F(xiàn)卷曲時(shí)認(rèn)為細(xì)胞膜片成熟;第二步，制備干細(xì)胞膜片片段:用機(jī)械剝離的方法將細(xì)胞膜片從培養(yǎng)皿中剝離，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成細(xì)胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:根據(jù)所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無(wú)菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘后，無(wú)菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細(xì)胞端于無(wú)菌紗布上輕蘸以去除多余紅細(xì)胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細(xì)胞，將后者平鋪置于無(wú)菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅(jiān)韌膜狀結(jié)構(gòu)，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒；第四步，將制備的細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，按照比例手動(dòng)將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)移植材料。所述的干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜顆粒的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料可用于中小范圍的軟骨及軟組織缺損的修復(fù)，對(duì)于操作視野較好部位可直接將復(fù)合物置于缺損處，對(duì)于操作視野不佳或無(wú)法完全暴露缺損區(qū)的病例，亦可將移植材料置于注射器或采用內(nèi)窺鏡方法將其注射于缺損處。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具 有以下優(yōu)點(diǎn):現(xiàn)有組織工程技術(shù)使用的支架材料幾乎全部是外源性材料，而種子細(xì)胞則以細(xì)胞懸液的形式接種于外源性材料上，再添加一種或幾種外源性生長(zhǎng)因子，這種方法的不足之處在于:外源性的支架材料降解需要一定時(shí)間，且存在降解不充分的可能；而種子細(xì)胞以懸液形式接種并移植到組織局部后，極易流失，使得能夠局部定植穩(wěn)定發(fā)揮作用的細(xì)胞量明顯變少；而且，外源性添加的生長(zhǎng)因子種類(lèi)較少，與生理狀況下多種生長(zhǎng)因子比例協(xié)調(diào)、協(xié)同發(fā)揮作用的模式完全不同，這些都會(huì)影響組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用的效果。本發(fā)明最突出的特點(diǎn)是從根本上解決了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，具體表現(xiàn)在以下幾點(diǎn):I)低排斥。本法制備的復(fù)合移植材料中的兩種成分，即干細(xì)胞膜片片段(CSF)和富血小板纖維蛋白膜(PRF)來(lái)源充足，具有極佳的生物學(xué)活性，幾乎不存在免疫排斥反應(yīng)及毒性反應(yīng)。2)配比佳。本發(fā)明的重要特點(diǎn)之一是篩選出了干細(xì)胞數(shù)量和富血小板纖維蛋白膜的最佳配比。該配比條件下，細(xì)胞具有良好的增殖和分化能力，有利于組織修復(fù)和再生，且該配比以六孔板獲得細(xì)胞膜片數(shù)量和血液的毫升數(shù)作為配比的基本單位，容易準(zhǔn)確掌握，便于操作。3)高效率。富血小板纖維蛋白膜來(lái)自于血液，操作簡(jiǎn)單，極易獲得；其本身含有大量的生長(zhǎng)因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1 (TGF β-1)、血小板源性生長(zhǎng)因子(TOGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，上述三種生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖，誘導(dǎo)纖維蛋白基質(zhì)進(jìn)行重塑，并促進(jìn)膠原基質(zhì)的分泌，在最初的組織愈合中起到了重要的作用；除此而外，PRF還含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等與創(chuàng)傷愈合和骨再生相關(guān)的生長(zhǎng)因子。PRF本身就是纖維蛋白網(wǎng)狀交聯(lián)形成的三維支架結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以使得其中的生長(zhǎng)因子緩慢釋放。所以，PRF的組織修復(fù)和組織再生作用主要通過(guò)兩方面實(shí)現(xiàn)，即生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用和纖維蛋白支架作用。4)易操作。細(xì)胞膜片片段(CSF)的細(xì)胞類(lèi)型可以根據(jù)修復(fù)缺損的區(qū)域及組織類(lèi)型的不同而不同，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、脂肪干細(xì)胞(ASCs)、牙髓干細(xì)胞(DPSCs)、牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)等，上述細(xì)胞均已被證實(shí)有良好的組織再生能力，且獲得相對(duì)容易，易于體外短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)；細(xì)胞膜片技術(shù)本身由于保留了細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞活性而較懸浮細(xì)胞具有更強(qiáng)的組織再生潛能；同時(shí)，膜片片段技術(shù)又改變了傳統(tǒng)的膜片移植模式，將膜片制備成一定大小的片段，一方面可使細(xì)胞片段與支架材料充分混合，細(xì)胞快速定植于支架材料表面并伸出突觸延伸至支架間隙內(nèi)部，二者形成一個(gè)整體(圖7)，另一方面可將細(xì)胞注射至難以完全暴露操作視野的區(qū)域。5)抗感染。PRF的紅端濃縮了大量的白細(xì)胞，這些白細(xì)胞一方面在局部發(fā)揮良好的抗炎作用，另一方面調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能；同時(shí)，PRF在制備過(guò)程中還網(wǎng)羅了血液中大量免疫調(diào)節(jié)因子，如IL-1 β，IL-4，IL-6及TNF-α，共同發(fā)揮抗感染的作用，利于組織愈合。因此，本發(fā)明方法制備的復(fù)合移植材料具有來(lái)源豐富、適應(yīng)癥廣泛、制備簡(jiǎn)單、無(wú)免疫排斥反應(yīng)及毒性反應(yīng)、無(wú)倫理爭(zhēng)議、安全有效等優(yōu)點(diǎn)。該方法具有普遍意義，適用于每位患者。


圖1為細(xì)胞膜片培養(yǎng)成熟后大體觀(以牙髓干細(xì)胞為例)。圖2為細(xì)胞膜片顯微結(jié)構(gòu)的HE染 色(以牙髓干細(xì)胞為例)。圖3為細(xì)胞膜片掃描電鏡結(jié)構(gòu)(以牙髓干細(xì)胞為例)。圖4為富血小板纖維蛋白大體觀，其中A為離心后靜置5分鐘大體觀；B為PRF凝膠；C為PRF膜；D為PRF顆粒。圖5為富血小板纖維蛋白膜顯微結(jié)構(gòu)的HE染色，其中A為40倍放大，B為100倍放大。圖6為富血小板纖維蛋白膜掃描電鏡結(jié)構(gòu)，其中A為其上端，為纖維蛋白三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)出為其下端，可見(jiàn)大量血小板、白細(xì)胞聚集。圖7為牙髓干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜顆粒后形成的雙膜結(jié)構(gòu)移植物的掃描電鏡，可見(jiàn)細(xì)胞牢固粘附于PRF表面，并伸出細(xì)胞突觸至PRF三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙中，二者牢固結(jié)合，形成整體。圖8為不同配比條件下細(xì)胞增殖情況，其中A為PRF對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響，B為PRF對(duì)牙周膜干細(xì)胞增殖的影響。圖9為不同配比條件下牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)DMPl的表達(dá)水平。圖10為不同配比條件下牙周膜干細(xì)胞向牙周膜細(xì)胞分化時(shí)CP23的表達(dá)水平。圖11為分別采用單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片片段、單純PRF顆粒、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜顆粒的雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)兔髁突軟骨缺損的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該圖為實(shí)驗(yàn)2、4、8周后髁突組織大體觀察結(jié)果。圖12為圖11組織行HE染色結(jié)果。圖13為圖11組織行甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果。圖14為圖13中新生軟骨區(qū)甲苯胺藍(lán)異染著色強(qiáng)度分析的統(tǒng)計(jì)圖，橫坐標(biāo)代表組別及時(shí)間，縱坐標(biāo)代表異染區(qū)著色強(qiáng)度的平均光密度值。圖15為分別采用單純PRF顆粒、單純牙髓干細(xì)胞膜片片段、牙髓干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜顆粒雙膜結(jié)構(gòu)行犬牙髓再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該圖為I月、2月后HE染色結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳盡的說(shuō)明。干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料的制備方法，包括體外配比篩選和體內(nèi)驗(yàn)證兩部分。第一部分:體外配比篩選1.材料與設(shè)備1.1主要試劑a-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó));0.25%胰酶(Hyclone公司，美國(guó));胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)。1.2儀器設(shè)備多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(TD25-WS，湖南湘儀 實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeuc Hearcell, Thermo公司，中國(guó));六孔板(Nunc公司，美國(guó));超凈工作臺(tái)(B10BASE，美國(guó))。2.操作步驟2.1干細(xì)胞的培養(yǎng):I)將原代干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照1: 2 1: 3比例進(jìn)行傳代；2)取第三代干細(xì)胞接種于六孔板中，常規(guī)培養(yǎng)(10% FBS的a -MEM培養(yǎng)液)至細(xì)胞融合80%。2.2富血小板纖維蛋白制備:I)將根據(jù)所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無(wú)菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘；2)無(wú)菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細(xì)胞端于無(wú)菌紗布上輕蘸以去除多余紅細(xì)胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細(xì)胞，將后者平鋪置于無(wú)菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一長(zhǎng)方形淡黃色堅(jiān)朝月吳狀結(jié)構(gòu)；3)將其平鋪于無(wú)菌紗布上，無(wú)菌剪刀沿其長(zhǎng)軸剪開(kāi)，將其制備成1/8和1/4的PRF,置于培養(yǎng)液中備用。2.3干細(xì)胞與富血小板纖維蛋白膜共培養(yǎng):I)按照1/8、1/4、3/8、1/2張PRF的比例，將剪好的PRF置于第三代干細(xì)胞的六孔板培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)7日，3天換液一次；2) 二者共培養(yǎng)7天后去掉PRF，干細(xì)胞則繼續(xù)正常培養(yǎng)，3天換液一次；2.4干細(xì)胞增殖、分化的檢測(cè):I)分別于二者共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)后的I 7天進(jìn)行干細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)，觀察PRF對(duì)細(xì)胞增殖的影響；2) 二者共培養(yǎng)后的7、14、21天行干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的Real-time PCR檢測(cè)，觀察PRF對(duì)細(xì)胞分化的影響。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1干細(xì)胞增殖PRF對(duì)牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，且呈一定的時(shí)間依賴(lài)性。兩種干細(xì)胞共同的特點(diǎn)是:PRF濃度從1/8 3/8，其對(duì)細(xì)胞增殖的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性，且以3/8PRF對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最為明顯，1/2PRF對(duì)細(xì)胞增殖的雖有一定促進(jìn)作用，但不及3/8PRF作用明顯(如圖8所示)。3.2干細(xì)胞分化二者共培養(yǎng)21天后，PRF對(duì)牙髓干細(xì)胞 向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化的特異性蛋白DMPl的表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用，且呈明顯的濃度依賴(lài)性，以1/2PRF最好，但其與3/8PRF之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9) ;PRF對(duì)牙周膜干細(xì)胞特異性蛋白CP23的表達(dá)也具有明顯的上調(diào)，以3/8PRF的濃度最好(如圖10所示)。綜合PRF對(duì)兩種不同類(lèi)型的干細(xì)胞增殖分化的影響的結(jié)果，我們認(rèn)為3/8PRF對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化均有明顯的促進(jìn)作用，故選擇該濃度作為最佳濃度。由于每張PRF膜所需血液為10mL，故最終確定二者配比關(guān)系為:每張六孔板細(xì)胞膜片數(shù)量:血液毫升數(shù)=I: 3.75，為了簡(jiǎn)化操作，我們認(rèn)為1: 3.5 4.0均可。為了驗(yàn)證該配比條件下的移植物的體內(nèi)移植效果，我們進(jìn)行體內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)。第二部分:移植物體內(nèi)驗(yàn)證第一步，干細(xì)胞膜片的培養(yǎng):原代干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于六孔板，待生長(zhǎng)融合至80%時(shí)以膜片誘導(dǎo)液予以培養(yǎng)，3天換液一次，待細(xì)胞膜片周?chē)霈F(xiàn)卷曲時(shí)認(rèn)為細(xì)胞膜片成熟;第二步，制備干細(xì)胞膜片片段:用機(jī)械剝離的方法將細(xì)胞膜片從培養(yǎng)皿中剝離，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成細(xì)胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:具體方法同體外實(shí)驗(yàn)部分，將制備所得的PRF膜用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒；第四步，將制備的細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，按照比例手動(dòng)將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)移植材料。對(duì)于操作視野較好的部位，使用時(shí)可將制備好的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料直接置于缺損處，對(duì)于操作視野不佳或無(wú)法完全暴露缺損區(qū)的病例，亦可將移植材料置于注射器或采用內(nèi)窺鏡方法將其注射于缺損處。為了驗(yàn)證本發(fā)明所述干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料的功效，我們分別進(jìn)行了不同種類(lèi)干細(xì)胞細(xì)胞膜片復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)分別以“兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)兔髁突軟骨缺損”和“犬牙髓干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)用于牙髓再生治療”為例，進(jìn)行如下試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)一:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)兔髁突軟骨缺損1.材料與設(shè)備1.1主要試劑a-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó));0.25%胰酶(Hyclone公司，美國(guó))；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；維生素C(Sigma公司，美國(guó))；戊巴比妥鈉(德國(guó)，科昊生物工程有限責(zé)任公司分裝)。
1.2儀器設(shè)備多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(TD25-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeuc Hearcell, Thermo公司，中國(guó));六孔板(Nunc公司，美國(guó));超凈工作臺(tái)(B10BASE，美國(guó))；尼康顯微鏡成像系統(tǒng)(XTJ30，日本)，分析電子天平(FA1004，中國(guó))，掃描電鏡(日立S-4800,日本)。2.操作步驟2.1兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)兔原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用含10%胎 牛血清的a -MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時(shí)按照1: 2 1: 3的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每2 3天換液一次；2.2BMSCs膜片的制備DBMSCs培養(yǎng)至第三代時(shí)，傳代至6孔板；更換膜片培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、20mg/ml維生素C的a -MEM培養(yǎng)基)，常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)兩周，膜片培養(yǎng)液每2 3天更換一次，換液時(shí)注意避光；2)待細(xì)胞膜片生長(zhǎng)至周邊細(xì)胞膜片稍卷曲時(shí)，即認(rèn)為細(xì)胞膜片已成熟，將成熟的細(xì)胞膜片用眼科鑷自一端剝離(如圖1，圖2，圖3所示)，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，采用無(wú)菌眼科剪將其剪成大小約0.5mmX 0.5mm的片段，備用。2.3PRF 的制備I)根據(jù)所需比例，以IOml為單位，將兔血液(不加任何抗凝劑)置于無(wú)菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘；2)此時(shí)可見(jiàn)離心管中血液分為三層:下層為紅細(xì)胞層，上層為極少量的淡黃色清液，中間層為淡黃色半透明富血小板纖維蛋白凝膠(如圖4A所示)；3)用無(wú)菌眼科鑷將中間部分凝膠完整取出，將其底部紅細(xì)胞端于無(wú)菌紗布上輕蘸以去除多余紅細(xì)胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細(xì)胞(如圖4B所示)，將后者平鋪置于無(wú)菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅(jiān)韌膜狀結(jié)構(gòu)，即為富血小板纖維蛋白膜，即PRF膜(如圖4C，圖5，圖6所示)；4)用無(wú)菌眼科剪將其剪碎,制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒，備用(如圖4D所示)。2.4BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)的制備將制備的BMSCs細(xì)胞膜片片段和PRF膜片顆粒置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，按照六孔板獲得細(xì)胞膜片:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液=I: 3.5 4.0的比例，手動(dòng)將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜顆粒的雙膜結(jié)構(gòu)移植材料，備用(如圖7所示)。2.5兔顳下頜關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的建立I)麻醉:無(wú)菌條件下，3%戊巴比妥鈉(lmL/kg)耳緣靜脈麻醉，另用I %利多卡因于建模側(cè)施以局麻；2)術(shù)前準(zhǔn)備:術(shù)側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒，鋪巾；3)于外目此外側(cè)5mm處至外耳道方向作約2cm長(zhǎng)的皮膚切口 ；4)分離皮下組織，切開(kāi)關(guān)節(jié)囊；5)暴露髁突關(guān)節(jié)，用電動(dòng)鉆于髁突前斜面中央鉆取I個(gè)直徑約3mm的孔；
6)行關(guān)節(jié)復(fù)位，縫合關(guān)節(jié)囊，縫合皮膚層。2.6實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將待植入髁突軟骨缺損處的移植物分為4組:①空白對(duì)照組:髁突軟骨缺損處不植入移植物；②單純PRF顆粒組；③單純BMSCs細(xì)胞膜片片段組；@ BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)組。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別于各組植入后的2w、4w、8w時(shí)使用 戊巴比妥鈉麻醉后取材，4 %多聚甲醛固定。15% EDTA脫鈣后進(jìn)行大體觀察，以及HE、甲苯胺藍(lán)染色后組織顯微結(jié)構(gòu)的觀察，結(jié)果如下:I)大體觀察可見(jiàn):BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)組修復(fù)情況要好于同時(shí)間點(diǎn)的其它組(如圖11所示)；2)HE染色結(jié)果:空白對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)缺損區(qū)凹陷，均未見(jiàn)有軟骨樣物質(zhì)充填；單獨(dú)PRF組與單獨(dú)細(xì)胞膜片組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)缺損修復(fù)區(qū)逐漸有新生軟骨生成，但軟骨層次排列紊亂；雙膜結(jié)構(gòu)組，第8周時(shí)損傷區(qū)基本齊平，修復(fù)軟骨層較薄、層次較清晰，與鄰近正常軟骨各層較連續(xù)(如圖12所示)；3)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果:各組新生軟骨區(qū)域呈異染現(xiàn)象(如圖13所示)，采用IPP
6.0軟件對(duì)各組甲苯胺藍(lán)染色圖片進(jìn)行著色強(qiáng)度分析，計(jì)算平均光密度值。結(jié)果得出:除空白對(duì)照組外，其余3組在術(shù)后2、4、8周平均OD值呈逐漸增加趨勢(shì)(P < 0.05)，并顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照組(P < 0.05);單獨(dú)PRF組與單獨(dú)細(xì)胞膜片組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均OD值均無(wú)顯著性差異。雙膜結(jié)構(gòu)組4、8周平均OD值顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的其它組(P < 0.05)(如圖14所示)。實(shí)驗(yàn)二:犬牙髓干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)用于牙髓再生治療1.材料與設(shè)備1.1主要試劑a-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))；1型膠原酶(GIBC0公司，美國(guó))；0.25%胰酶(Hyclone公司，美國(guó))；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；維生素C(Sigma公司，美國(guó))；戊巴比妥鈉(德國(guó)，科昊生物工程有限責(zé)任公司分裝)。1.2儀器設(shè)備多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(TD25-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeuc Hearcell, Thermo公司，中國(guó));六孔板(Nunc公司，美國(guó));超凈工作臺(tái)(B10BASE，美國(guó))；尼康顯微鏡成像系統(tǒng)(XTJ30，日本)，分析電子天平(FA1004，中國(guó))，掃描電鏡(日立S-4800,日本)。2.操作步驟2.1犬牙髓干細(xì)胞(DPSCs)的分離與培養(yǎng)犬原代牙髓干細(xì)胞采用含10% FBS的a-MEM常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 5天后的出現(xiàn)多個(gè)克隆細(xì)胞團(tuán)，待克隆團(tuán)內(nèi)部細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，以1: 2 1: 3的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每2 3天換液一次；2.2DPSCs膜片的制備
同實(shí)驗(yàn)一。2.3PRF 的制備同實(shí)驗(yàn)一。2.4犬牙髓干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)移植材料的制備同實(shí)驗(yàn)一。2.5犬牙髓再生模型的建立I)犬(約6月齡)常規(guī)麻醉，方法同 前；2)術(shù)前準(zhǔn)備:犬口內(nèi)所有前磨牙采用牙周刮治器械行齦上下手動(dòng)刮治，去除牙石及軟垢，口腔內(nèi)外碘伏嚴(yán)格消毒，鋪巾；3)經(jīng)隨機(jī)化分組后，上下頜前磨牙(除第一前磨牙)開(kāi)髓，揭髓頂，暴露牙髓組織，拔髓針完整拔除牙髓后，采用30#K確定根尖孔開(kāi)放后，擴(kuò)大根尖孔至70#Κ銼，使根尖開(kāi)放區(qū)直徑達(dá)0.7mm ；4) 一次性注射器吸取大量無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行根管沖洗，確定根管內(nèi)無(wú)牙髓組織及牙體組織碎屑?xì)埩簦?)依照2.6中分組，將移植物置于根管中，采用螺旋輸送器將移植物送至整個(gè)根管中，達(dá)根管口處；移植物上端輕置氫氧化鈣(Dycal，登士柏公司)，厚度約1mm，待氫氧化鈣結(jié)固后，修整洞壁，采用玻璃離子墊底，厚度約1mm，缺損處采用光固化樹(shù)脂充填；2.6實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將待植入髓腔的移植物分為4組:①空白對(duì)照組:髓腔內(nèi)不植入任何移植物；②單純PRF顆粒組；③單純DPSCs細(xì)胞膜片片段組；@ DPSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)組。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果HE染色結(jié)果:正常對(duì)照組可見(jiàn)牙髓組織、成牙本質(zhì)細(xì)胞、前期牙本質(zhì)及成熟牙本質(zhì)有序排列，成牙本質(zhì)細(xì)胞呈高柱狀有序排列；各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)血管及染色較淺的前期牙本質(zhì)形成，但血管數(shù)量、牙本質(zhì)厚薄及細(xì)胞排列情況各組間存在差異:DPSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)組細(xì)胞呈疏松的星網(wǎng)狀復(fù)層排列，且細(xì)胞形態(tài)由遠(yuǎn)離牙本質(zhì)的平行生長(zhǎng)逐漸向靠近牙本質(zhì)的垂直極性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，形態(tài)類(lèi)似成牙本質(zhì)細(xì)胞，髓腔內(nèi)見(jiàn)較多新生血管形成；單純DPSCs細(xì)胞膜片組牙髓細(xì)胞較雙膜結(jié)構(gòu)組排列疏松、無(wú)序，且牙本質(zhì)層較薄，但髓腔內(nèi)亦可見(jiàn)較多的血管形成；單純PRF顆粒組細(xì)胞大多呈圓形，無(wú)明顯伸展，排列無(wú)序且牙本質(zhì)壁薄，但髓腔內(nèi)亦可見(jiàn)少量血管形成(如圖15所示)。4.機(jī)理分析4.1干細(xì)胞膜片片段(CSF)的作用干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類(lèi)具有自我復(fù)制能力和多向分化能力的細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，故目前作為種子細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于組織工程中。細(xì)胞膜片技術(shù)是通過(guò)體外誘導(dǎo)的方式促使種子細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，將細(xì)胞緊密連結(jié)成為一種片狀結(jié)構(gòu)。ECM不僅為細(xì)胞和組織提供連接、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及力學(xué)性能的支持，更為重要的是能調(diào)節(jié)細(xì)胞間的溝通，對(duì)細(xì)胞的基本生命活動(dòng)發(fā)揮全方位的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。ECM具有結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，其結(jié)構(gòu)和成分的變化將影響細(xì)胞骨架的構(gòu)建，從而決定細(xì)胞的形狀和活性，影響細(xì)胞的生存，參與和控制細(xì)胞的分化與遷移，在組織器官的發(fā)生、發(fā)育、再生及維持組織器官的結(jié)構(gòu)和功能的生理活動(dòng)中均具有極其關(guān)鍵的作用。細(xì)胞膜片技術(shù)這種能夠保存細(xì)胞間自分泌信號(hào)分子性能的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可以減少無(wú)效移植細(xì)胞的數(shù)量，有利于組織的重建或再生。而膜片片段技術(shù)改變了傳統(tǒng)的膜片移植模式，將完整的細(xì)胞膜片制備為一定大小的片段，一方面保存了種子細(xì)胞的活性，并且最大程度保存了 ECM及細(xì)胞間自分泌信號(hào)分子的性能，另一方面使細(xì)胞能最大程度地與支架均勻混合，便于細(xì)胞迅速定植于支架表面，使二者形成的移植物成為具有良好生物功能的整體。4.2富血小板纖維蛋白膜(PRF)的作用富血小板纖維蛋白(PRF)是全血經(jīng)一次快 速離心后形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。PRF的主要特點(diǎn)在于富含大量比例接近生理狀況的生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowth factor β , TGF β )、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowth factors,F1DGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors, IGF),上述三種生長(zhǎng)因子在最初的組織愈合中起到了重要的作用，它們可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖，誘導(dǎo)纖維蛋白基質(zhì)進(jìn)行重塑，并且促進(jìn)膠原基質(zhì)的分泌；除此而外，PRF中還含有與創(chuàng)傷愈合和骨再生相關(guān)的多種生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)等。作為血小板濃縮物的第二代產(chǎn)品，與第一代產(chǎn)品富血小板血漿(plateIet-richpIasma, PRP)相比，PRF 具有以下特點(diǎn):I)制備簡(jiǎn)單。PRP的制備需要添加抗凝劑，以防止血液凝固；其制備需要兩次離心，需要將離心后的上清進(jìn)行轉(zhuǎn)移，操作繁瑣，且目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的離心速度和時(shí)間，不同學(xué)者對(duì)其制備的方法持有不同觀點(diǎn)。PRF的制備則很簡(jiǎn)單，抽取全血后立即以3000rprm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘，即可得到PRF凝膠。2)安全性好。PRP在制備時(shí)首先需要加入抗凝劑，其次在兩次離心結(jié)束后需要添加牛凝血酶及氯化鈣加以激活，才可形成凝膠狀以便體內(nèi)移植，而且PRP只有在激活以后才能使得其中的血小板α鏈脫顆粒釋放生長(zhǎng)因子；然而，添加外源性物質(zhì)有可能引起宿主的免疫反應(yīng)，且過(guò)多的操作步驟也增加了污染的幾率。PRF的制備不需要添加任何外源性物質(zhì),且一步操作完成,安全性好。3)生長(zhǎng)因子緩釋。PRP是通過(guò)加入較多的凝血酶進(jìn)行人為激活后迅速形成凝膠狀的。大量的外源性的凝血酶使得纖維蛋白迅速聚合，形成雙向致密連接結(jié)構(gòu)，這就使得血小板釋放出來(lái)的生長(zhǎng)因子不能被網(wǎng)羅其中，而是存留在纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之外的懸液中，從而呈現(xiàn)出快速、大量釋放的特點(diǎn)。而PRF是在自身凝血酶作用下產(chǎn)生的緩慢的聚合方式，這種漸進(jìn)性的聚合方式更大程度上將外周血中游離的生長(zhǎng)因子網(wǎng)羅至PRF的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。游離生長(zhǎng)因子和血小板中的生長(zhǎng)因子在這種三維結(jié)構(gòu)中的分布必然會(huì)導(dǎo)致其緩釋效應(yīng)，因?yàn)樗鼈冎粫?huì)在其所在纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改建時(shí)才得以釋放，而且PRF中的纖絲和纖維蛋白形成四方形的連接方式，這種彈性基質(zhì)結(jié)構(gòu)也更有利于細(xì)胞遷移和可溶性分子保留。4)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可作為支架材料。PRP中的纖維蛋白形成的是雙向的致密連接結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)不利于細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的遷移。PRF中的纖維蛋白則形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)不但利于細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的遷移，還為組織修復(fù)相關(guān)細(xì)胞提供了增殖分化的場(chǎng)所，發(fā)揮了重要的支架作用。
5)含有大量的白細(xì)胞。PRF經(jīng)由全血離心得到，在離心過(guò)程中，血液中絕大多數(shù)白細(xì)胞均分布于PRF下端，即紅端(如圖6中B圖所示)；因此，在雙膜結(jié)構(gòu)移植至體內(nèi)時(shí)，一方面濃縮的白細(xì)胞于局部發(fā)揮良好的抗炎作用，另一方面調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，發(fā)揮良好的抗炎功能和免疫調(diào)節(jié)功能；同時(shí)，PRF在制備過(guò)程中還網(wǎng)羅了血液中大量免疫調(diào)節(jié)因子，如IL-Ιβ，IL-4，IL-6及TNF-α等，這些因素在組織缺損修復(fù)后防止感染、促進(jìn)愈合等方面均發(fā)揮著重要作用。4.3干細(xì)胞膜片片段復(fù) 合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結(jié)構(gòu)動(dòng)物移植效果的分析本發(fā)明的第一部分應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)對(duì)干細(xì)胞細(xì)胞膜片與富血小板纖維蛋白膜的配比關(guān)系進(jìn)行了研究，得到了二者之間最佳配比關(guān)系。第二部分，按照該配比關(guān)系制備雙膜結(jié)構(gòu)移植物，將其植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，探究雙膜結(jié)構(gòu)移植物對(duì)組織修復(fù)的影響。4.3.1實(shí)驗(yàn)一中，富血小板纖維蛋白膜PRF顆粒作為細(xì)胞支架及生長(zhǎng)因子供體，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片片段進(jìn)行復(fù)合，將其按照一定比例混合后置于組織缺損處，進(jìn)行軟骨缺損的修復(fù)。PRF膜片極具韌性，剪碎成為顆粒狀后極易操作，可將其置于任何形狀的組織缺損中；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制作成膜片形式后，由于存在細(xì)胞外基質(zhì)的連接，避免了以往的懸浮細(xì)胞易流失的缺點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與自然恢復(fù)組、單純的PRF以及單純的細(xì)胞膜片組相比，雙膜結(jié)構(gòu)組修復(fù)軟骨缺損的效果最好，在第8周時(shí)損傷區(qū)基本齊平，修復(fù)軟骨層較薄、層次較清晰，與鄰近正常軟骨各層較連續(xù)。這就證明了我們的猜想，即:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在局部發(fā)揮了種子細(xì)胞的作用，在局部微環(huán)境中能夠增殖分化成特定的細(xì)胞類(lèi)型，而PRF膜片顆粒一方面提供了大量的膠原基質(zhì)成分，為細(xì)胞提供了支架結(jié)構(gòu)，另一方面其中含有的血小板隨著基質(zhì)成分的改建而不斷被激活，釋放出大量比例接近生理狀況的生長(zhǎng)因子，為干細(xì)胞的增殖和分化及組織的修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)支持。4.3.2實(shí)驗(yàn)二中，以PRF膜片作為細(xì)胞支架及生長(zhǎng)因子供體，與牙髓干細(xì)胞膜片片段進(jìn)行復(fù)合，將其按照一定比例混合后置于牙髓缺如的根管腔內(nèi)，進(jìn)行牙髓再生的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙膜結(jié)構(gòu)組較單純細(xì)胞膜片及單純PRF組再生效果好。正常對(duì)照組犬牙縱切面HE染色觀察可見(jiàn)牙髓、成牙本質(zhì)細(xì)胞、前期牙本質(zhì)及成熟牙本質(zhì)有序排列，牙本質(zhì)經(jīng)脫礦處理后呈紅色的嗜伊紅膠原基質(zhì)染色，靠近髓腔的前期牙本質(zhì)部分染色較淺，沿牙本質(zhì)層排列，單層成牙本質(zhì)細(xì)胞緊接前期牙本質(zhì)呈高柱狀排列。DPSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)組HE染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈疏松星網(wǎng)狀復(fù)層排列，且細(xì)胞形態(tài)由遠(yuǎn)離牙本質(zhì)的平行生長(zhǎng)逐漸向靠近牙本質(zhì)的垂直極性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，形態(tài)類(lèi)似成牙本質(zhì)細(xì)胞，髓腔內(nèi)見(jiàn)較多血管形成。單純細(xì)胞膜片組細(xì)胞呈疏松星網(wǎng)狀復(fù)層排列，但較雙膜結(jié)構(gòu)組排列疏松、無(wú)序，未表現(xiàn)出明顯的近牙本質(zhì)垂直極性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)，且牙本質(zhì)層較薄，但細(xì)胞形態(tài)伸展明顯，髓腔內(nèi)亦可見(jiàn)較多的血管形成。單純PRF顆粒組細(xì)胞大多呈圓形，無(wú)明顯伸展，排列無(wú)序，無(wú)明顯垂直極性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，牙本質(zhì)壁薄，但髓腔內(nèi)亦可見(jiàn)少量血管形成。上述結(jié)果說(shuō)明，在牙髓再生過(guò)程中，牙髓干細(xì)胞是理想的種子細(xì)胞，將其制成細(xì)胞膜片片段的形式，一方面最大程度上保留了細(xì)胞外基質(zhì)，使得細(xì)胞間相關(guān)信號(hào)分子得以完整保存，另一方面，擺脫了細(xì)胞懸液的束縛，膜片的形式更加便于操作，保證牙髓腔局部有足夠量的且不易流失的種子細(xì)胞。根尖孔開(kāi)放后，保證了髓腔內(nèi)有足夠血運(yùn)，使得種子細(xì)胞有一定的營(yíng)養(yǎng)支持，這樣，即使沒(méi)有PRF提供大量的生長(zhǎng)因子和支架作用，髓腔中也有牙髓組織再生。另一方面，根尖孔開(kāi)放后，血液會(huì)充滿(mǎn)髓腔，而循環(huán)血中本身存在未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，干細(xì)胞歸巢至牙髓腔中，在PRF顆粒釋放的大量的生長(zhǎng)因子的作用和髓腔局部微環(huán)境的雙重作用下，歸巢的干細(xì)胞在髓腔局部得以增殖、分化，達(dá)到牙髓再生的目的，這可能也就是在單純PRF顆粒組也能見(jiàn)到排列較好的再生牙髓的原因。而髓腔中缺少了 PRF提供生長(zhǎng)因子和膠原支架，即使有歸巢的干細(xì)胞，也未必能形成較好的牙髓組織。而將牙髓干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜顆粒雙膜結(jié)構(gòu)的移植材料置于髓腔中，即同時(shí)滿(mǎn)足了種子細(xì)胞、三維支架以及生長(zhǎng)因子的要求，因此可以得到較為理想的牙髓再生，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)機(jī)理分析，本發(fā)明 所示的干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜片的新型生物材料，能夠顯著促進(jìn)組織缺損的修復(fù)及組織再生效果。本發(fā)明方法制備的生物移植材料配比合適，來(lái)源豐富，具有普遍的適用性，適用于每位患者個(gè)體。通過(guò)該方法制備的生物移植材料，可廣泛用于不同類(lèi)型組織缺損的修復(fù)，還具有良好的組織再生效果，為組織工程相關(guān)實(shí)驗(yàn)的展開(kāi)和臨床修復(fù)組織缺損及組織再生提供了新思路。
權(quán)利要求
1.一種雙膜結(jié)構(gòu)移植材料，其特征在于:由干細(xì)胞細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜顆粒組成。
2.如權(quán)利要求1所述的移植材料，其特征在于:所述干細(xì)胞選自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、月旨肪干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞或牙周膜干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的移植材料，其特征在于:所述富血小板纖維蛋白膜片顆粒經(jīng)由血液離心后獲得。
4.如權(quán)利要求1所述的移植材料，其特征在于:細(xì)胞膜片采用六孔板進(jìn)行制備，細(xì)胞細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細(xì)胞膜片數(shù)量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數(shù)=I: 3.5 4.0。
5.如權(quán)利要求1所述的移植材料，其特征在于:所述干細(xì)胞和富血小板纖維蛋白均來(lái)源于同一個(gè)體。
6.如權(quán)利要求1所述的移植材料，其特征在于:干細(xì)胞必須制備成細(xì)胞膜片片段的形式。
7.權(quán)利要求1所述移植材料的制備方法，其特征在于其制備過(guò)程包括以下步驟: 第一步，干細(xì)胞膜片的培養(yǎng):原代干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于六孔板，待生長(zhǎng)融合至80%時(shí)以膜片誘導(dǎo)液予以培養(yǎng)，3天換液一次，待細(xì)胞膜片周?chē)霈F(xiàn)卷曲時(shí)認(rèn)為細(xì)胞膜片成熟； 第二步，制備干細(xì)胞膜片片段:用機(jī)械剝離的方法將細(xì)胞膜片從培養(yǎng)皿中剝離，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成細(xì)胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；` 第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:根據(jù)所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無(wú)菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘后，無(wú)菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細(xì)胞端于無(wú)菌紗布上輕蘸以去除多余紅細(xì)胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細(xì)胞，將后者平鋪于無(wú)菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅(jiān)韌膜狀結(jié)構(gòu)，用無(wú)菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX0.5mmX0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒； 第四步，將制備的細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，按照比例手動(dòng)將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜結(jié)構(gòu)移植材料。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:細(xì)胞細(xì)胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細(xì)胞膜片數(shù)量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數(shù)=1: 3.5 4.0。
9.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的移植材料在口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復(fù)中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的移植材料在制備口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復(fù)用移植材料中的用途。
11.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的移植材料與其他生物材料組成的復(fù)合材料在制備組織缺損修復(fù)用移植材料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于組織工程和生物材料領(lǐng)域，為一種雙膜結(jié)構(gòu)移植材料的制備方法及用途，移植材料由干細(xì)胞膜片片段、富血小板纖維蛋白膜顆粒組成，干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后采用膜片誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)得到干細(xì)胞膜片，剪碎后制備成細(xì)胞膜片片段；富血小板纖維蛋白凝膠擠壓后去除其中液體成分，即可得富血小板纖維蛋白膜，后者剪碎成為顆粒形式；將細(xì)胞膜片片段與富血小板纖維蛋白膜顆粒按照體外篩選的最佳配比關(guān)系進(jìn)行混合后，即制得所需移植材料。本材料可廣泛用于口腔及全身其他部位中小范圍缺損的組織修復(fù)及再生，提高了組織修復(fù)的效果。
文檔編號(hào)A61L27/22GK103100112SQ20121052509
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者張旻, 陳永進(jìn), 趙寅華, 李軼杰, 劉南霞, 程百祥, 杜靜, 陳慧, 李強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)