專利名稱：一種治療肝纖維化的復(fù)方制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥復(fù)方制劑，具體涉及一種含仙靈脾、炙鱉甲等中藥的治療肝纖維化的復(fù)方制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝纖維化的發(fā)生是由于各種慢性肝損傷引起的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ExtraCellalur Matrx，ECM)合成增加和/或降解減少的結(jié)果，國內(nèi)外許多學(xué)者都在積極探索治療肝纖維化和肝硬化的有效方法，隨著細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，肝纖維化的基礎(chǔ)研究有了較大的進(jìn)展，然而，臨床治療學(xué)的研究明顯滯后于基礎(chǔ)研究，已報(bào)道的治療藥物幾乎均處于實(shí)驗(yàn)研究階段，就治療藥物的實(shí)驗(yàn)研究而言，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要集中于以下幾個(gè)方面(1)抑制膠原基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)換，如γ-干擾素，類視黃醇；(2)抑制膠原蛋白轉(zhuǎn)譯后的修飾，如4-脯氨酸羥化酶抑制物(HOE077)，賴氨酸羥化的酶抑制物如Minoxidil；(3)抑制膠原的分泌，如秋水仙堿；(4)抑制前膠原三股螺旋或膠原分子的交換，如β-氨基丙晴；(5)增加膠原降解，如二亞油酰磷脂酰膽堿，黃體馳緩素等。
迄今，大多數(shù)藥物在臨床實(shí)踐中均未得到預(yù)期的效果，就連一度認(rèn)為很有希望的抗肝纖維化藥物HOE077(Lufironil)也因其有嚴(yán)重的副作用而停止了臨床應(yīng)用，γ-干擾素對肝纖維化的療效尚須進(jìn)一步驗(yàn)證。
近年來，國內(nèi)應(yīng)用中醫(yī)中藥治療肝纖維化的研究有了一定的進(jìn)展，有關(guān)文獻(xiàn)主要集中在單味中藥(或其提取物)、固定復(fù)方、辨證論治等三方面，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)單味中藥(或其提取物)中的丹參，丹參酚丹酸B，葫蘆素B，齊墩果酸，漢防己甲素及復(fù)方中的鱉甲煎丸、強(qiáng)肝湯、烏雞白鳳丸、319膠囊、861等復(fù)方有一定的抗肝纖維化作用，辯證論治現(xiàn)尚無規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)，由于病例入選標(biāo)準(zhǔn)的差異，療效考核標(biāo)準(zhǔn)不一，特別是肝臟組織學(xué)檢查難以普遍開展，故迄今仍無成熟的治療方案或藥物在臨床普遍應(yīng)用。
我國是慢性乙型肝炎病毒感染的高發(fā)區(qū)域，也是血吸蟲感染嚴(yán)重地區(qū)，近年來酒精性肝炎、脂肪性肝炎的發(fā)病率也正在逐年提高。上述疾病導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生明顯上升。肝纖維化是一種可逆性的病理診斷，各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化，其中25％-40％最終發(fā)展為肝硬化及至肝癌。阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化對改善肝病的預(yù)后，降低肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生有著極其重要的意義，是防治慢性肝病的關(guān)鍵和難題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有改善肝纖維化、預(yù)防肝硬化作用的治療肝纖維化的中藥復(fù)方制劑及其制備方法。
中醫(yī)內(nèi)科認(rèn)為肝纖維化多屬于“積聚”“脅痛”、“瘀證”等范疇，其病機(jī)復(fù)雜。正虛血瘀、肝腎虧損是肝纖維化的主要病機(jī)特征，或可兼挾濕、熱等病邪，病變主要影響肝、脾、腎三臟。
本發(fā)明采用中藥材以中藥材仙靈脾、炙鱉甲、炙黃芪、枸杞子、紫丹參、廣郁金、苦參為主藥，配以輔料，制成本發(fā)明治療肝纖維化的復(fù)方制劑。
本發(fā)明所涉及的藥材仙靈脾、炙鱉甲、炙黃芪、枸杞子、紫丹參、廣郁金、苦參為中國藥典2000年版一部所收載中藥，并符合藥典質(zhì)量要求。
本發(fā)明復(fù)方制劑其中所述組分的質(zhì)量/質(zhì)量百分比配比如下述，仙靈脾20-30％、炙鱉甲12-15％、炙黃芪8-10％、枸杞子8-10％、紫丹參8-10％、廣郁金8-10％、苦參3-5％，余為輔料。
優(yōu)選組分的質(zhì)量/質(zhì)量百分比配比是仙靈脾15-25％、炙鱉甲10-15％、炙黃芪5-10％、枸杞子5-10％、紫丹參5-10％、廣郁金5-10％、苦參1-5％，余為輔料。
所述的輔料包括微粉硅膠、糊精、β-環(huán)糊精包合物等。其比例在10％-20％時(shí)具有符合中國藥典2000年版一部片劑規(guī)定的崩解時(shí)限。
本發(fā)明復(fù)方制劑通過下述方法制備，本發(fā)明根據(jù)所采用的中藥材淫羊藿、炙黃芪、丹參均含有大量的脂溶性有效成分，選用乙醇作為溶媒提取；郁金含有揮發(fā)性有效成分，選用水蒸氣蒸餾法提取；同時(shí)，郁金、丹參還含有水溶性有效成分，且鱉甲、枸杞子、苦參的有效部位基本上能溶于水，確定將郁金水蒸氣蒸餾后的藥渣、丹參醇提后的藥渣與鱉甲、枸杞子、苦參加水提取。
根據(jù)本發(fā)明制劑中藥物的成分及劑型要求，選用干膏收率和丹參水溶性成分原兒茶醛的含量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行綜合評價(jià)。干膏收率作為選擇劑型的參考指標(biāo)，影響除雜方法的選擇，是膠囊劑日服量、單服量及包裝規(guī)格確定的重要參數(shù)。因此，以干膏收率作為評價(jià)指標(biāo)之一，但其與療效強(qiáng)度不成量效關(guān)系，故綜合評價(jià)時(shí)權(quán)重系數(shù)應(yīng)較小，以0.3為宜。本制劑中丹參所含原兒茶醛為主要藥效成分，因此可測定原兒茶醛的含量，作為評價(jià)指標(biāo)之一，且權(quán)重系數(shù)應(yīng)相對較大，以0.7為宜。
本發(fā)明復(fù)方制劑進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)和肝纖維化臨床研究，結(jié)果顯示(1)對CCl4所致小鼠急性肝損傷和小鼠免疫性肝損傷具有顯著防治作用，使兩種肝損傷小鼠升高的血清ALT和AST活性均有顯著降低作用；(2)對CCl4綜合因素所致大鼠肝纖維化模型和DMN所致大鼠肝纖維化模型，具有顯著的治療作用。主要表現(xiàn)在對升高的血清ALT和AST活性有降低作用，對血清總蛋白含量升高、球蛋白含量升高和白蛋白含量降低的代謝異常變化具有治療性的調(diào)節(jié)作用，對增高的血清透明質(zhì)酸、III型前膠原和層粘連蛋白含量均有降低作用，對增高的肝組織羥脯氨酸含量亦有降低作用，并顯著地減輕大鼠肝組織膠原纖維病變，使肝組織切片上的膠原纖維組織的面積總和、周長總和、平均光密度總和、積分光密度總和及平均黑度總和均顯著降低；(3)大樣本的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明制劑不僅可改善臨床癥狀、體征，對肝功能也有明顯的改善作用。其中血清肝纖維化指標(biāo)、B超的變化結(jié)果表明，本發(fā)明制劑具有較好的抗肝纖維化的作用。通過7例前后肝穿的病理學(xué)觀察結(jié)果表明，本發(fā)明制劑具有抗炎、抗纖維化的作用，對α-SMA、I、III型膠原的表達(dá)程度和面積有減輕作用，對HBsAg和HBcAg表達(dá)程度和類型有改善作用。
本發(fā)明制劑經(jīng)臨床實(shí)踐應(yīng)用證實(shí)，其對肝纖維化患者臨床癥狀，體征、血清生化學(xué)指標(biāo)及肝病理變化有較好的改善作用，其中肝功能及肝纖維化指標(biāo)改善率達(dá)60-75％，對肝纖維化大鼠的組織學(xué)有明顯的改善作用；體外原代肝細(xì)胞的血清藥理學(xué)研究結(jié)果顯示本發(fā)明制劑具有抑制肝細(xì)胞膠原合成和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖等作用；體外原代肝星狀細(xì)胞的血清藥理學(xué)研究結(jié)果顯示本發(fā)明制劑具有抑制HSC增殖及其膠原合成作用。
本發(fā)明制劑服用方便，長期服用無任何毒副作用。本發(fā)明的制備方法，能高效率地保留藥材中的有效成分，簡化中藥制劑的制備，保護(hù)環(huán)境，有利于大生產(chǎn)的操作。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取上述配比組分淫羊藿、炙黃芪加入10倍量70％的乙醇回流提取兩次，每次1小時(shí)，靜置，濾過，合并濾液備用；丹參用6倍量70％乙醇回流提取兩次，第一次1小時(shí)，第二次0.5小時(shí)，濾過，藥渣備用，合并兩次提取液，再與淫羊藿、炙黃芪醇提液合并，回收乙醇，減壓濃縮成相對密度為1.08(60℃)的清膏；郁金加6倍量水浸泡2小時(shí)，用水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油6小時(shí)，收集揮發(fā)油，每1ml揮發(fā)油用4g β-環(huán)糊精在30℃的條件下超聲包合45分鐘，抽濾，所得包合物在40℃干燥4小時(shí)，備用；蒸餾后的藥液濾過，濾液另器保存，備用；蒸餾后的郁金藥渣與醇提丹參藥渣、鱉甲、枸杞子、苦參共煎二次，每次加8倍量水，第一次煎煮1小時(shí)，第二次煎煮0.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液與蒸餾后的郁金藥液合并，濃縮至相對密度為1.15(60℃)的清膏，放冷，加入乙醇使含醇量達(dá)70％，靜置12小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度1.08(60℃)的清膏，合并兩種清膏，在進(jìn)液速度50～60ml/min、進(jìn)風(fēng)溫度160～170℃、出風(fēng)溫度80～90℃的條件下噴霧干燥，收集干浸膏粉末，過篩，加入適量微粉硅膠、糊精、β-環(huán)糊精包合物混合均勻，填充0號膠囊，即得。
實(shí)施例2采用本發(fā)明制劑進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，對CCl4綜合因素所致大鼠肝纖維化和DMN所致大鼠肝纖維化多方面的指標(biāo)均具有顯著的治療作用，對CCl4所致小鼠急性肝損傷和小鼠免疫性肝損傷亦具有較好的防治保護(hù)作用。其中，用CCl4對小鼠注射造成急性肝損傷模型后，血清ALT和AST活性均比正常對照組顯著升高，分別升高463.93％和766.36％，P均＜0.01。本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量均可使急性肝損傷小鼠血清升高的AST活性顯著降低，降低率可達(dá)28.05％～56.09％，P均＜0.01；本發(fā)明制劑高劑量和中劑量可使升高的血清ALT活性顯著降低，降低率分別為50.93％和31.64％，P均＜0.01。表明本發(fā)明制劑對CCl4所致的小鼠急性肝損傷有顯著的防治作用。高、中、低三種劑量組5.50、3.67、1.83g生藥/kg(藥液濃度分別為0.275、0.183、0.092g生藥/mL，給藥體積均為0.4mL/20g體重，分別為臨床成年人每日擬用劑量的15倍、10倍、5倍。結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明制劑對肝纖維化具有較好的治療作用。
其中，C57BL/6J小鼠在復(fù)制形成免疫性肝損傷模型后，血清ALT和AST活性均比正常對照組顯著升高，分別升高481.82％和313.59％，P均＜0.01。本發(fā)明制劑對小鼠免疫性肝損傷具有顯著的治療作用，表現(xiàn)在高、中、低三種劑量均可使升高的血清ALT活性顯著降低(P＜0.01)；而高劑量和中劑量對升高的血清AST活性也具有顯著降低作用(P＜0.05～0.01)。
其中，在CCl4所致大鼠肝纖維化模型形成后，肝纖維化模型對照組大鼠血清ALT和AST活性比正常對照組大鼠均顯著升高。其中ALT活性升高77.44％(P＜0.01)，AST活性升高114.93％(P＜0.01)。而經(jīng)本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，對升高了的血清ALT活性具有顯著的降低作用，分別使ALT降低43.24％、40.94％和32.71％，P均＜0.01；對升高的血清AST活性僅有高劑量具有顯著的降低作用，降低率為35.83％(P＜0.05)，而中劑量和低劑量對AST活性僅有降低作用趨勢。表明本發(fā)明制劑對CCl4所致大鼠肝纖維化具有顯著的保肝降酶作用。同樣，復(fù)方鱉甲軟肝片在高劑量(臨床人用劑量的10倍)時(shí)，僅對CCl4所致肝纖維化大鼠血清ALT活性具有顯著降低作用，對AST活性有降低作用趨勢。
其中，在CCl4所致大鼠肝纖維化模型形成后，大鼠肝纖維化模型形成后，肝纖維化模型對照組大鼠血清總蛋白(TP)含量比正常對照組大鼠略為升高(可能由于血清球蛋白含量增加所致)，增加3.63％(P＞0.05)。經(jīng)本發(fā)明制劑三種劑量治療4周后，對增高的TP含量具有不同程度的降低作用趨勢，分別降低12.50％、8.95％和13.39％，P均＞0.05。在大鼠肝纖維化模型形成后，肝纖維化模型對照組大鼠血清白蛋白(Alb)含量比正常對照組大鼠顯著降低，降低41.84％(P＜0.01)。經(jīng)本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，對降低的Alb含量均具有不同程度的回升作用，其中高劑量組具有顯著回升Alb的作用，比模型對照組回升增加55.87％(P＜0.01)。在大鼠肝纖維化模型形成后，肝纖維化模型對照組大鼠血清球蛋白(Glob)含量比正常對照組大鼠顯著增高，增高20.68％(P＜0.01)。經(jīng)本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，對增高的Glob含量均具有不同程度的降低作用，分別降低28.07％(P＜0.01)、11.17％(P＞0.05)和16.66％(P＞0.05)。表明在CCl4所致的肝纖維化大鼠血清總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和球蛋白(Glob)的代謝發(fā)生了異常變化(血清TP含量略升高，血清Glob含量顯著升高，而Alb含量顯著降低)，而本發(fā)明制劑具有治療性的調(diào)節(jié)作用，尤其在高劑量時(shí)作用顯著。同樣，復(fù)方鱉甲軟肝片在高劑量(臨床人用劑量的10倍)時(shí)，對肝纖維化大鼠具僅有降低血清TP、降低血清Glob和升高血清ALP含量的作用趨勢，P均＞0.05。
其中，在CCl4等復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化模型形成后，大鼠血清中的肝纖維化標(biāo)志物HA(透明質(zhì)酸)、PCIII(III型前膠原)和LN(層粘連蛋白)含量，均比正常對照組大鼠顯著增高。其中，使HA含量增加256.72％(P＜0.01)，使PCIII含量增加40.51％(P＜0.01)，使LN含量增加100.73％(P＜0.01)。經(jīng)本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，可使升高的血清HA、PCIII和LN含量有不同程度的降低作用。其中，三種劑量分別使HA含量分別降低31.09％(P＜0.05)、12.12％(P＞0.05)和12.12％(P＞0.05)；分別使PCIII含量分別降低5.77％(P＞0.05)、18.59％(P＜0.05)和15.07％(P＜0.05)；分別使LN含量分別降低27.46％(P＜0.01)、25.51％(P＜0.05)和17.23％(P＜0.05)。可見，本發(fā)明制劑給藥對CCl4所致肝纖維化大鼠血清升高了的PCIII和LN的含量均有顯著降低作用，在高劑量時(shí)對升高的HA含量也具有顯著的降低作用。表明本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化具有顯著的治療作用。同樣，陽性對照藥物復(fù)方鱉甲軟肝片在高劑量(臨床人用劑量的10倍)時(shí)，亦可顯著降低CCl4所致肝纖維化大鼠血清PCIII和LN的含量(分別降低20.97％和19.01％，P均＜0.05)，表明復(fù)方鱉甲軟肝片對CCl4所致肝纖維化亦具有顯著的治療作用。
其中，在CCl4所致大鼠肝纖維化模型形成后，肝纖維化模型對照組大鼠血清羥脯氨酸(Hyp)含量比正常對照組大鼠顯著增高，增加了691.08％(增加6.9l倍)。而經(jīng)本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，對升高了的血清羥脯氨酸含量均具有顯著的降低作用，分別比肝纖維化比模型對照組降低30.03％、37.51％和26.29％，P均＜0.05～0.01。表明本發(fā)明制劑對CCl4所致大鼠肝纖維化具有顯著的治療作用。同樣，復(fù)方鱉甲軟肝片在高劑量(臨床人用劑量的10倍)時(shí)，亦可使肝纖維化大鼠血清羥脯氨酸含量顯著降低，降低23.50％(p＜0.05)。
其中，在CCl4所致大鼠肝纖維化模型形成后，肝纖維化模型對照組大鼠肝組織中所含的羥脯氨酸含量比正常對照組大鼠顯著增高，增高77.40％(P＜0.01)。而經(jīng)本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，對升高的肝組織羥脯氨酸含量均具有顯著的降低作用，分別比肝纖維化比模型對照組降低23.84％、20.86％和24.50％，P均＜0.01。表明本發(fā)明制劑對CCl4所致大鼠肝纖維化具有顯著的治療作用。同樣，復(fù)方鱉甲軟肝片在高劑量(臨床人用劑量的10倍)時(shí)，亦可使肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸含量顯著降低，降低15.51％(p＜0.05)。
其中，在使用注射CCl4和飼喂高脂飼料的復(fù)合因素條件共6周，可以成功地復(fù)制大鼠肝纖維化模型。與正常對照組大鼠肝組織比較，肝纖維化模型對照組大鼠肝組織切片上的膠原纖維組織的面積總和、周長總和、平均光密度總和、積分光密度總和及平均黑度總和均極大程度地增加。其中，模型組肝膠原纖維組織的面積總和比正常對照組增加413.90％(增加了4.139倍，P＜0.01)；模型組肝膠原纖維組織的周長總和比正常對照組增加118.36％(P＜0.01)；模型組肝膠原纖維組織的平均光密度總和比正常對照組增加86.58％(P＜0.01)；模型組肝膠原纖維組織的積分光密度總和比正常對照組增加418.58％(增加了4.19倍，P＜0.01)；模型組肝膠原纖維組織的平均黑度總和比正常對照組增加156.96％(P＜0.01)。表明應(yīng)用CCl4等復(fù)合因素能夠成功地復(fù)制大鼠肝纖維化模型。在經(jīng)過應(yīng)用本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量治療4周后，可以顯著地減輕大鼠肝組織膠原纖維病變，表現(xiàn)為三種劑量能使大鼠肝膠原纖維組織的面積總和分別縮小75.17％、66.98％和59.38％(P均＜0.01)；使肝膠原纖維組織的周長總和分別縮短30.47％、24.50％和21.64％(P均＜0.01)；使肝膠原纖維組織的平均光密度總和分別降低38.73％、39.14％和40.45％(P均＜0.01)；使肝膠原纖維組織的積分光密度總和分別降低70.47％、62.05％和55.21％(P均＜0.01)；使肝膠原纖維組織的平均黑度總和分別降低48.11％、49.33％和54.20％(P均＜0.01)。表明本發(fā)明制劑對CCl4復(fù)合因素所誘發(fā)的大鼠肝膠原纖維病變具有較好的治療作用，能夠顯著地減輕肝膠原纖維病變程度。同樣，陽性對照藥物復(fù)方鱉甲軟肝片在高劑量(臨床人用劑量的10倍)時(shí)，對CCl4復(fù)合因素所誘發(fā)的大鼠肝膠原纖維病變亦具有顯著的治療作用。本發(fā)明制劑質(zhì)量比范圍為仙靈脾20-30％、炙鱉甲12-15％、炙黃芪8-10％、枸杞子8-10％、紫丹參8-10％、廣郁金8-10％、苦參3-5％，余為輔料，療效更好。
表1是本發(fā)明制劑對CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響(x±s)。
表2是本發(fā)明制劑對免疫性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響(x±s)。
表3是本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化大鼠血清ALT和AST活性的影響(x±s)。
表4是本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化大鼠血清TP、Alb和Glob含量的影響(x±s)。
表5是本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化大鼠血清HA、PCIII和LN含量的影響(x±s)。
表6是本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化大鼠血清羥脯氨酸(Hyp)含量的影響(x±s)。
表7是本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量的影響(x±s)。
表8是本發(fā)明制劑對CCl4所致肝纖維化大鼠肝膠原纖維含量的影響(x±s)。
表1

注與肝損傷模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2

注與肝損傷模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3

注與肝損傷模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4

注與肝纖模型對照組比較，**P＜0.01。
表5

注(1)與肝纖模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
(2)括號內(nèi)數(shù)值為與肝纖模型對照組比較的抑制(降低)百分率。
表6

表7

表8


注(1)與肝纖維化模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
(2)括號內(nèi)數(shù)值為與肝纖維化模型對照組比較的抑制(降低)百分率。
實(shí)施例3本發(fā)明制劑對小鼠灌胃在一日內(nèi)分2次給予的最大給藥量為175g生藥/kg體重，此劑量為臨床成年人擬用劑量的477倍。即表明小鼠能耐受灌胃給予本發(fā)明制劑的劑量為175g生藥/kg體重(為臨床成年人擬用劑量的477倍)。由于在一日內(nèi)分2次灌胃給予較大體積的濃稠藥物，使動物攝食量減少，動物的體重增長稍慢(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05)，但在給藥后7天內(nèi)不致引起明顯中毒癥狀和死亡。表明本發(fā)明制劑對動物灌胃給藥的急性毒性較小，口服用藥安全。
以本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量(18.33、9.17、4.59g生藥/kg，分別為成年人臨床擬用日服劑量的50倍、25倍和12.5倍)對大鼠連續(xù)灌胃給藥6個(gè)月。在給藥3個(gè)月后，各組隨機(jī)抽取活殺10只大鼠(雌雄各5只，第一批次)；在給藥6個(gè)月后，各組隨機(jī)抽取活殺14只大鼠(雌雄各7只，第二批次)；余下每組6只大鼠停藥觀察6周后再行活殺(雌雄各3只，第三批次)。收集大鼠腹股溝髂外靜脈血，進(jìn)行血液學(xué)和血液生化學(xué)檢測；取動物重要臟器稱重(計(jì)算臟器重量系數(shù))和進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明制劑高、中、低三種劑量對大鼠的外觀行為、生長(體重增長)、血液學(xué)(造血功能，WBC、RBC、HGB、RC、PLT、HCT、MCV、MCH、MCHC、W-SCR、W-LCR、W-SCC、W-LCC、RDW-CV、PDW、MPV)、血液生化學(xué)(主要為肝臟功能和腎臟功能，ALT、AST、TP、ALB、BU、Cre、AKP、TBil、Glu、T-CHO)等均未見明顯毒性影響。本發(fā)明制劑三種劑量對大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、胸腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪、前列腺等13種器官的重量系數(shù)均無明顯毒性的影響；上述器官組織，未發(fā)現(xiàn)有明顯的出血、瘀血、腫脹、潰爛或色澤異常等病變情況。經(jīng)與空白對照組比較，本發(fā)明制劑高劑量(18.33g生藥/kg)對大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、胸腺、胃、十二指腸、前列腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢等15種器官組織的形態(tài)亦未發(fā)現(xiàn)有明顯的病理學(xué)損害性變化。
實(shí)施例4本發(fā)明制劑在臨床試用的基礎(chǔ)上，選慢性乙型肝炎肝纖維化患者62例，觀察本發(fā)明制劑治療慢性乙型肝炎肝纖維化，結(jié)果顯示治療后患者絕大多數(shù)癥狀明顯改善，其中以乏力、脅痛、食欲不振、腰膝酸軟、口干咽燥、目干澀、腹脹、舌象脈象改善尤為明顯(P＜0.05)。主要體征有改善，其中脾腫大、肝病面容、爪甲不榮改善較為明顯。本發(fā)明制劑治療后，ALT、AST、GGT、SB下降顯著(P＜0.01)，AKP、G也有較明顯的下降(P＜0.05)。各指標(biāo)中HA在治療后下降顯著，CIV下降較顯著，PIIINP下降較明顯，AGA也有一定程度的下降，而LN、ApoAI、TRF在治療后均有所上升。上述研究結(jié)果表明，HA、CIV、PIIINP、AGA與肝纖維化呈正相關(guān)關(guān)系，而LN、ApoAI、TRF與肝纖維化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明本發(fā)明制劑具有較明顯的抗纖維化作用。治療結(jié)束時(shí)，乙肝病毒學(xué)的主要指標(biāo)中HBeAg、HBV DNA轉(zhuǎn)陰率分別為20％、26.47％。上述結(jié)果表明，本發(fā)明制劑不僅可改善臨床癥狀、體征，對肝功能也有明顯的改善作用。血清肝纖維化指標(biāo)、B超的變化結(jié)果表明，本發(fā)明制劑具有較好的抗肝纖維化的作用，其中，ALT、AST、GGT、SB下降非常顯著(P＜0.01)，AKP、G也有較明顯的下降(P＜0.05)，A雖有上升，但未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各項(xiàng)指標(biāo)復(fù)常率中以ALT、AST、G、SB較高。表9是治療前后血清肝功能主要指標(biāo)的變化。表10是治療前后血清HA、CIV、PIIINP、LN、AGA、ApoAI、TRF治療前后的變化表9

治療前后比較**P＜0.01，*P＜0.05
表10

結(jié)果顯示，各指標(biāo)中HA在治療后下降非常顯著，CIV下降較顯著，PIIINP下降較明顯，AGA也有一定程度的下降，而LN、ApoAI、TRF在治療后均有所上升。上述研究結(jié)果表明，HA、CIV、PIIINP、AGA與肝纖維化呈正相關(guān)關(guān)系，而LN、ApoAI、TRF與肝纖維化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明本發(fā)明制劑具有較明顯的抗纖維化作用。
病理學(xué)療效通過7例前后肝穿組織學(xué)觀察，7例患者治療前后肝穿切片比較，鏡下觀大多數(shù)患者有不同程度的好轉(zhuǎn)，按95標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級分期炎癥活動度，1例由G3降為G2，1例由G4轉(zhuǎn)為G3，其余5例肝組織標(biāo)本雖鏡下可見改善，但尚達(dá)不到降一級的標(biāo)準(zhǔn)，如匯管區(qū)炎癥細(xì)胞由較多變?yōu)樯倭浚∪~內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死每視野計(jì)數(shù)減少等；纖維化程度，1例由S4降為S3，1例由S3降為S2，1例由S2降為S1，1例由S3升為S4，1例由S2升為S3，其余2例部分可見纖維化程度下降，如纖維隔變少、變細(xì)、變短，但尚達(dá)不到降一級的標(biāo)準(zhǔn)。治療后，炎癥活動度由8.44±4.21降至7.11±5.03，纖維化程度計(jì)分由7.55±5.05降至5.92±4.21，本發(fā)明制劑對α-SMA、I、III型膠原的表達(dá)程度和面積有減輕作用，對HBsAg和HBcAg表達(dá)程度和類型有改善作用。
權(quán)利要求
1.一種治療肝纖維化的復(fù)方制劑，其特征是以中藥材仙靈脾、炙鱉甲、炙黃芪、枸杞子、紫丹參、廣郁金、苦參為主藥，配以輔料，制成治療肝纖維化的復(fù)方制劑，所述的主藥在制劑中的質(zhì)量百分比含量是仙靈脾15-30％、炙鱉甲10-15％、炙黃芪5-10％、枸杞子5-10％、紫丹參5-10％、廣郁金5-10％、苦參1-5％，余為輔料分的質(zhì)量/質(zhì)量百分比配比是仙靈脾15-25％、炙鱉甲10-15％、炙黃芪5-10％、枸杞子5-10％、紫丹參5-10％、廣郁金5-10％、苦參1-5％，余為輔料。
2.按權(quán)利要求1所述的治療肝纖維化的復(fù)方制劑，其特征是所述的主藥在制劑中的質(zhì)量百分比含量是仙靈脾20-30％，炙鱉甲12-15％，炙黃芪8-10％，枸杞子8-10％，紫丹參8-10％，廣郁金8-10％，苦參3-5％，余為輔料。
3.按權(quán)利要求1或2所述的治療肝纖維化的復(fù)方制劑，其特征是所述的輔料包括微粉硅膠、糊精和β-環(huán)糊精包合物。
4.按權(quán)利要求1所述的治療肝纖維化的復(fù)方制劑的制備方法，其特征是采用乙醇作為溶媒提取淫羊藿、炙黃芪、丹參的脂溶性有效成分，采用水蒸氣蒸餾法提取郁金，含有揮發(fā)性有效成分；將郁金水蒸氣蒸餾后的藥渣、丹參醇提后的藥渣與鱉甲、枸杞子、苦參加水提取，加入輔料微粉硅膠、糊精和β-環(huán)糊精包合物混合均勻，填充膠囊，即得。
5.按權(quán)利要求4所述的制備方法，其中所述的制備方法包括下述步驟，1)取上述配比組分淫羊藿、炙黃芪加入10倍量70％的乙醇回流提取兩次，靜置，濾過，合并濾液備用；2)用6倍量70％乙醇回流提取丹參兩次，濾過，合并兩次提取液，再與淫羊藿、炙黃芪醇提液合并，回收乙醇，減壓濃縮成相對密度為1.08的清膏；3)郁金加6倍量水浸泡2小時(shí)，用水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油6小時(shí)，收集揮發(fā)油，每1ml揮發(fā)油用4gβ-環(huán)糊精在30℃的條件下超聲包合45分鐘，抽濾，所得包合物40℃干燥4小時(shí)，備用；蒸餾后的藥液濾過，備用；4)蒸餾后的郁金藥渣與醇提丹參藥渣、鱉甲、枸杞子、苦參共煎二次，每次加8倍量水，合并煎液，濾過，濾液與蒸餾后的郁金藥液合并，濃縮至相對密度為1.15的清膏，放冷，加入乙醇使含醇量達(dá)70％，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度1.08的清膏，合并兩種清膏，噴霧干燥，收集干浸膏粉末，過篩，加入微粉硅膠、糊精、β-環(huán)糊精包合物混合均勻，填充膠囊，即得。
6.按權(quán)利要求5所述的制備方法，其中所述的噴霧干燥條件為，進(jìn)液速度為50～60ml/min，進(jìn)風(fēng)溫度為160～170℃，出風(fēng)溫度為80～90℃。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，具體涉及一種的治療肝纖維化的復(fù)方制劑及其制備方法。本發(fā)明采用中藥材仙靈脾、鱉甲、炙黃芪、枸杞子、紫丹參、廣郁金、苦參為主藥，配以輔料制成。經(jīng)體外和動物實(shí)驗(yàn)表明，具有抑制肝細(xì)胞膠原合成，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和抑制HSC增殖作用，對大鼠的肝纖維化有明顯改善作用；經(jīng)臨床實(shí)踐證實(shí)，對肝纖維化患者臨床癥狀，體征、血清生化學(xué)指標(biāo)及肝病理變化有較好的改善作用，其中肝功能及肝纖維化指標(biāo)改善率達(dá)60－75％，本發(fā)明服用方便，長期服用無任何毒副作用。本發(fā)明制備方法，能高效率地保留藥材中的有效成分，簡化中藥制劑的制備，保護(hù)環(huán)境，有利于大生產(chǎn)的操作。
文檔編號A61P1/00GK1682868SQ20051002391
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月7日
發(fā)明者王靈臺, 陳建杰, 高月求, 趙剛, 張斌 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院