專利名稱：包含芍藥甙的皮膚老化護理品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種包含芍藥甙作為活性成分的皮膚老化護理品，芍藥甙在顯著抑制和改善內在性皮膚老化、顯著抑制和改善由UV引起的DNA損傷和皮膚起皺以及改善原有皺紋方面有效。
背景技術：
人的皮膚是使人體免于受到外界環境的影響而起到屏障作用的重要組織。人在其一生都要經歷皮膚老化。皮膚老化可以分為內在性老化和光老化。內在性老化是由身體的內在因素、通常是遺傳因素引起的。其特征為皺紋和松弛的皮膚。光老化與內在性老化一起是由于反復地暴露于UV引起的。暴露于UV的皮膚會變得粗糙、出現深而密的皺紋，伴隨著無規律的色素沉著過度、血管擴張、角質化紊亂、角質層的異常生長、真皮彈性纖維的變化和退化產物的聚集。而且，UV能夠加速真皮內的膠原蛋白和其它彈性蛋白的分解，從而加重皮膚損傷，并且在嚴重的情況下能夠引起皮膚癌。另外，UV是引起皺紋、無彈性皮膚、干燥皮膚、皮膚光澤下降、粗糙皮膚、雀斑、毛細管破裂、皮膚變色等的原因(J.Pathol.，1997，180；80-89)。
皮膚老化伴隨著下面的變化一同發生。老化的皮膚與真皮之間的結合變緊。粒層(stratum granulosum)和表皮生發層變薄。膠原蛋白和彈性蛋白的含量會下降。細胞層的排列會變得無秩序。黑色素細胞、朗格罕氏細胞和肥大細胞的數量會下降。可以通過觀察細胞的組織結構確認這些現象(Optical microscopeOM，Electron microscopeEM，Agingskin(光學顯微鏡OM，電子顯微鏡EM，正在老化的皮膚)，edited byJLLeveque&PG Agache，1993，NY)。另外，老化的皮膚在生物化學、酶組織學等方面上經歷某些模式變化(pattern change)。具體而言，皮膚新陳代謝的酶活性會降低，氧化還原酶系統的活性會變弱(SOD，GSH-Px)，并且氧化損傷的產物(oxidation-damaged product)(MDA、自由基等)會增加。這些支持了如錯誤突變理論和自由基理論的老化理論。
到現在為止，對皮膚老化的研究主要集中在光老化上，對內在性老化沒有進行充分的研究。已經開發的用來防止光老化的抗UV還存在許多問題，包括缺乏穩定性。
芍藥甙(C23H28O11；M.W.480.45)是芍藥科根部的主要成分之一。其為無色結晶物質，并且還被稱為芍藥皂角苷。已知其在擴張血管、抵抗炎癥和過敏性以及促進免疫活性方面是有效的。
韓國專利公開號2005-0017066披露了一種包含得自芍藥的白藜蘆醇(resveratrol)的護膚組合物。韓國專利公開號2003-0004486披露了一種用于防止老化的包含芍藥莖皮提取物和合歡樹(silk-tree)提取物的化妝品組合物。韓國專利公開號2002-0044266披露了一種用于皮膚防護的包含白芍藥等的復合草本提取物的化妝品組合物。然而，到現在為止，仍沒有對芍藥甙防止皮膚老化的作用及其改進進行研究。

發明內容
本發明的一個技術方案提供了一種包含能夠安全有效地改善皮膚老化的芍藥甙作為活性成分的皮膚老化護理品。
本發明的另一個技術方案提供了一種包含芍藥甙作為活性成分的化妝品組合物和/或藥物組合物。
具體實施例方式
為了實現所述技術方案，本發明提供了包含芍藥甙作為活性成分的皮膚老化護理品。
本發明還提供了一種用于防止皮膚老化的化妝品組合物。基于干重，其包含0.001～10.0wt％的芍藥甙。
本發明進一步提供了一種用于防止皮膚老化的藥物組合物，基于干重，其包含0.001～10.0wt％的芍藥甙。
由于芍藥甙增強皮膚細胞的活力和性能，促進膠原蛋白纖維的合成從而有助于皮膚組織的韌性和彈性，減少脂質過氧化物的產生從而顯著防止內在性皮膚老化，防止由UV引起的DNA損傷和皮膚起皺，并且有效改善原有皺紋，所以包含芍藥甙的化妝品組合物可以是非常有效的皮膚老化護理品。
下文，對本發明進行詳細的描述。
本發明人通過發現芍藥甙對人體安全、不僅能夠防止并改善內在性皮膚老化、而且還能夠防止并改善由UV引起的皮膚光老化而完成了本發明。
當將芍藥甙涂敷在無毛老鼠的皮膚上時，當將芍藥甙制成外用的軟膏或洗液時，芍藥甙增強皮膚細胞的活性和性能，促進膠原蛋白纖維的合成從而有助于皮膚組織的韌性和彈性，減少脂質過氧化物的產生從而顯著防止內在性皮膚老化，顯著防止由UV引起的DNA損傷和皮膚起皺，并且有效改善原有皺紋。其也是安全的，而且沒有副作用。
可以購買或通過任何已知的方法提純和分離芍藥甙。在本發明的優選實施方式中，直接從中國芍藥的根部分離出芍藥甙。芍藥甙的提純方法包括以下步驟(a)向中國芍藥(Paeonia lactiflora Pallas)的根中加入1～10體積當量的乙醇或50～95％的乙醇水溶液用于提取；(b)濃縮該提取液，除去殘留的乙醇，并加入等量的水；(c)向制得的懸浮液中加入同體積的乙醚用于相分離，并分離水層；(d)濃縮該水層，將其倒入硅膠柱，并用氯仿和丙酮的混合物進行色譜分離；(e)將洗脫液倒八十八烷基甲硅烷基化(octadecylsilylated)硅膠柱，并用三氟乙酸和甲醇的混合物進行色譜分離；以及(f)分離洗脫液，并在減壓下進行蒸餾，以獲得芍藥甙。本領域的技術人員可以容易地實施該方法。在本發明的范圍內，可以對本發明進行部分的修改或替換。
本發明的皮膚老化護理品可以單獨包含芍藥甙。然而，根據劑型和施用方法，其可以進一步包含制藥上可接受的賦形劑。在那種情況下，基于干重，芍藥甙的含量為0.001～10.0wt％，優選為0.01～1.0wt％。如果活性成分的含量低于0.001wt％，則不可能期待有明顯的皮膚老化防護或改善效果。另外，如果其超過10.0wt％，則雖然含量增加了但效果沒有提高，所以這是不經濟的。然而，需要根據施用方法和使用皮膚老化護理品的目的調節活性成分的含量。制藥上可接受的賦形劑可以是甘油、淀粉、乳糖、水、醇、丙二醇、水楊酸、二氫乙酸(dihydroacetic acid)或/和生理鹽水，但不限于這些。
本發明的皮膚老化護理品可以經口給藥或非經口給藥。優選的是，其為非經口給藥，例如經皮給藥。根據給藥的方式，將其制成合適的劑型。例如，可以將其制成膏藥、微粒、洗液、粉末、糖漿、液體或溶液、噴霧劑、軟膏、流浸膏、乳液、懸浮液、輸液、片劑、注射劑、膠囊、丸劑等，但不限于這些。
優選的是，考慮使用的目的，給藥的身體部位，給藥的方法，患者的年齡、性別和身體情況，身體對活性成分的吸收率，非活性的比率，相容的藥物等，確定本發明的皮膚老化護理品的給藥劑量。例如，基于活性成分，每天的給藥劑量可以為0.01mg/kg(體重)～500mg/kg(體重)。
本發明的皮膚老化護理品還可以用作化妝品組合物或藥物組合物。因此，本發明提供了一種用于防止皮膚老化的包含芍藥甙作為活性成分的化妝品組合物或藥物組合物。
基于干重，所述化妝品組合物或藥物組合物可以包含0.001～10.0wt％、優選0.01～1.0wt％的芍藥甙。然而，需要根據劑型或其它成分的含量調節該含量。如果在化妝品組合物或藥物組合物中芍藥甙的含量低于0.001％，則難于指望有實效的皮膚老化的防護或改善。另外，如果其超過10.0wt％，則芍藥甙的量對于其效果過量，所以這是不經濟的。除芍藥甙之外，該化妝品組合物或藥物組合物可以包含常規的化妝品成分或任何制藥上可接受的成分，如賦形劑、稀釋劑等。例如，其可以包含癸二酸二乙酯、鯨蠟、凡士林、聚氧乙烯油烯基醚磷酸酯(polyoxyethyleneoleyl ether phosphate)、苯甲酸鈉、硬脂酸、鯨蠟醇、失水山梨糖醇單硬脂酸酯(sorbitan monostearate)、礦物油、三辛酸酯(trioctanoate)、三乙醇胺、卡波姆(carbomer)、甘油、丙二醇、凈化水、乙醇、聚氧乙烯硬化的蓖麻油(polyoxyethylene-hardened caster oil)、對羥基苯甲酸甲酯、1，3-丁二醇、透明質酸鈉等。
本發明化妝品組合物可以用于基本化妝品、化妝化妝品(makcupcosmetics)、身體化妝品、頭發化妝品、頭皮化妝品、刮胡須用化妝品或口腔化妝品。基本化妝品的例子為面霜、精華素、美容涂敷劑、按摩霜、乳液等。化妝化妝品的例子為粉底、化妝底霜、唇膏、眼影、眼線筆、睫毛膏、眉筆等。身體化妝品的例子為肥皂、液體清潔劑(liquidclcaner)、沐浴護理劑(bath treatment)、防曬霜、潤滑油等。頭發化妝品的例子為洗發香波、染發水、頭發護理劑(hair treatment)、摩絲、舉發液(hair liquid)、潤發油、染發劑、頭發漂白劑、彩色染發劑等。頭皮化妝品的例子為生發油、頭皮護理劑(scalp treatment)等。刮胡須用化妝品的例子為須后水、刮胡膏等。口腔化妝品的例子為牙膏、漱口劑等。
下文，參考實施例，對本發明進行詳細的描述。然而，下面的實施例僅用于理解本發明，而沒有限制本發明。
實施例<制備例1>芍藥甙的分離和提純將中國芍藥(Paeonia lactiflora Pallas)的根研磨成粉。向磨成粉末的根加入5體積當量的含有75％乙醇和水的萃取溶劑。進行萃取3次，每次3小時，然后濃縮該萃取液。從該濃縮液中除去殘留的乙醇，并加入等體積的水。加熱該混合物以使其溶解。然后，加入等體積的乙醚，以使該溶液分配3次。濃縮該水層。將該濃縮物倒入200～300目的硅膠柱中。使用包含氯仿和丙酮(4∶1)的流動相分離該濃縮物。濃縮該洗脫液，并進行干燥。所得到的干燥產物包含約70％的芍藥甙。將其懸浮于水中，并倒入用十八烷基甲硅烷基化硅膠填充的10mm(直徑)×250mm(長度)、4μm的柱子中。使用包含0.5％TFA(三氟乙酸)和甲醇(體積比＝75∶25)的混合溶劑作為流動相。用UV檢測器(230nm)進行芍藥甙的檢測。以2.5mL/min的速度加入該流動相。在18～20分鐘范圍內檢測到的主峰反復進行分離。在減壓下蒸餾所得到的分離物，從而得到芍藥甙。
用LCQ質譜儀(Finnigan，U.S.)和NMR波譜儀(Bruker)分析制得的芍藥甙。
下表1示出了質譜分析結果，以及下表2示出了NMR分析結果。由這些結果(化學式1，C23H28O11)確定芍藥甙的結構。
表1


表2


制得的芍藥甙的HPLC分析顯示，其具有至少99％的純度。
<測試例1>對成纖維細胞的作用測試芍藥甙對細胞活性的作用。
角質化細胞和成纖維細胞主要位于真皮和表皮中，并且參與表皮和真皮的重要功能。因此，使用角質化細胞和成纖維細胞作為細胞生理毒理學(physiotoxicology)和抗老化研究中的測試細胞。
從3天或更小的紅皮膚老鼠上取下皮膚組織。除去皮下組織，并用0.25％的胰蛋白酶處理該皮膚12小時。將該皮膚分離成表皮和真皮。在表皮培養基(K-SFM)中培養該表皮至75％的匯合(confluence)。在37℃下用胰蛋白酶進一步處理該真皮2小時。從該真皮中取出成纖維細胞，并將其在含有10％血清的DMEM培養基中培養至75％的匯合。
將制備例1中制備的芍藥甙溶于培養的角質化細胞和成纖維細胞中，并處理至0.0004M。通過MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)]分析測定細胞計數，以測定細胞活性。無處理的組和用0.002M維生素C處理過的組作為對照組進行測試。芍藥甙對成纖維細胞的作用示出在下表3中。
表3


如表3可見，芍藥甙能夠顯著促進成纖維細胞的細胞增殖。
<測試例2>防止皮膚細胞的死亡和老化通過特定染色的細胞DNA證實細胞生長和分裂情況。
β-Gal為一種特定標記老化的皮膚細胞的材料。使初期細胞和靜止期細胞保持原樣，而只對老化的細胞進行特定的染色。分別用極少量的X-Gal處理培養的角質化細胞和成纖維細胞，并在37℃下進行染色24小時。在2～4小時內將老化的皮膚細胞染成深藍色，并在12～16小時內給出最好的結果(參見Proc.Natl.Acad.Sci .USA，1995，929363-7)。然后，用流動血細胞計數器計數染色的細胞(老化的細胞)、活細胞和死細胞。其結果示于下表4中。表4中，“空白”是指不含有細胞的對照組。
表4


如表4可見，證實芍藥甙能夠降低角質化細胞和成纖維細胞的細胞死亡率及細胞老化率。特別地，與維生素E相比，證實芍藥甙能夠更好地提高細胞生長率。因此，可以確認，芍藥甙在防止皮膚細胞的老化上優于維生素E。
<測試例3>脂質過氧化物和膠原蛋白含量的變化對于動物皮膚，測量脂質過氧化物的產生和膠原蛋白含量的變化，以確認芍藥甙的皮膚老化效果。
1)樣品的制備將各加熱至80℃的10g硬脂酸(C18H36O2)、70mL水和20mL甘油均勻混合。攪拌約1分鐘之后，加入3(w/v)％的芍藥甙或維生素E(陽性對照組)。加入0.1(w/v)％的羥苯甲酸甲酯之后，攪拌1分鐘。緩慢加入1mLKOH。進行相當程度的乳化之后，進行攪拌直至溫度達到約50℃。
2)測試將豚鼠分組，每組包括3只雄性和3只雌性。從每只豚鼠的背部刮下3×3cm2的面積。每只豚鼠，用上述制備的樣品處理其左側，處理其右側作為陰性對照組和陽性對照組。每天在8:00H和16:00H進行涂敷。以每次約5mg/cm2進行涂敷30天。在第31天，從每只動物的背部取下皮膚。除去皮下脂肪組織，并用電子顯微鏡和光學顯微鏡測量膠原蛋白和脂質過氧化物的含量。
3)結果a)用肉眼觀察用所述樣品處理的組表現出顯著的外觀改進，如柔軟且有光澤的皮膚。與用維生素E處理的陽性對照組相比，其效果是顯著的。相反，空白對照組和沒有用芍藥甙處理的陰性對照組沒有表現出外觀上的改進。
b)組織學上的觀察-膠原蛋白的含量用石蠟浸漬背部皮膚組織，并用HE(蘇木精-曙紅)染色。觀察皮膚組織的變化。通過向皮膚加入6N的鹽酸并根據氯胺-T氧化法測量HYP(羥基脯氨酸)而確定皮膚膠原蛋白的含量。
涂敷芍藥甙的組在表皮中沒有表現出顯著的變化，但在真皮中觀察到膠原纖維束的增加。下表5示出了芍藥甙對真皮中膠原纖維束的作用。可以看出，芍藥甙能夠提高真皮中膠原蛋白的含量，從而改善皮膚的彈性。
表5


在真皮中還觀察到RER(粗糙型內質網)的擴張和線粒體的增加，這證實了芍藥甙能夠增強皮膚細胞的活性和性能。
c)組織學上的觀察-脂質過氧化物的含量SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-Px(總谷胱甘肽過氧化物酶)是活體中重要的具有抗氧化特性的酶。其在氣態氧化和抗氧化平衡上起到重要的作用。由于其能夠通過除去氧自由基而提供抗氧化作用，所以可以根據除去體內氧自由基的能力而說明SOD和GSH-Px的活性。MDA(丙二醛(malondialdehyde))為一種脂質過氧化物。
使用硫代巴比妥酸檢測MDA。分別通過DNTB(5，5′-二硫代-二-2-硝基苯甲酸)和硝酸鹽還原法測量GSH-Px和SOD的含量。其結果示于下表6中。
公式1含量＝(處理組的吸收率-空白組的吸收率)/(空白組的吸收率)×100
表6


如表6可見，芍藥甙能夠提高皮膚組織中SOD和GSH-Px的活性，并且能夠抑制脂質過氧化物的產生。
<測試例4>由UV引起的DNA損傷的防護對于正常人體皮膚角質化細胞，測定制備例1制備的芍藥甙對由UV引起的DNA損傷的防護作用。
用濃縮的芍藥甙處理培養的正常人體角質化細胞12小時。除去培養基，并用PBS沖洗該細胞。輻照60mJ UVB，并檢查細胞的DNA損傷。如果在細胞核內存在DNA鏈斷裂，則在電泳期間，朝陽極方向出現拖尾。因此，可以通過電泳容易地檢測DNA的損傷。50個隨機挑選的細胞的尾矩(tail moment)的平均值用作對照值。對芍藥甙處理的細胞的尾矩進行平均。將對照值和得到的測試值代入下列公式2，以計算芍藥甙對由UV引起的DNA損傷的防護作用。
公式2防護作用(％)＝(對照值-測試值)/(對照值)×100
表7


表7示出了芍藥甙對由UV引起的DNA損傷的防護作用。芍藥甙在處理濃度為0.0001％～0.1％的范圍內表現出至少16.9％的DNA損傷防護作用。
<測試例5>由UV引起的DNA損傷(體內)的防護通過動物試驗證實芍藥甙對由UV引起的DNA損傷的防護。
將溶于80％乙醇的芍藥甙涂敷在無毛老鼠的背部。6天之后，輻照1JUVB。取皮膚細胞，并測定DNA損傷。其結果示于下表8中。
表8


如表8可見，DNA損傷的防護作用隨著芍藥甙的濃度提高而增強。然而，在動物試驗中，超過特定濃度，其結果可能不與濃度成比例。也就是說，盡管防護作用成比例最高至0.01％，但是其不可能因此超過0.01％。
在動物試驗中證實，芍藥甙能夠有效防護由UV引起的DNA損傷。這意味著芍藥甙能夠在活的動物中以及培養的細胞上表現出強的DNA損傷防護作用。
<測試例6>由UV引起的皺紋的防護使用無毛老鼠，按照如下所述評價制備例1中制備的芍藥甙對由UV引起的皺紋的防護作用。用太陽激勵器以2MED(最小紅斑量)向無毛老鼠輻照UV。輻照進行12周，每周3天。在全部10只老鼠中，對樣品處理組涂敷溶于1，3-丁二醇的0.2％的芍藥甙，而對對照組僅涂敷1，3-丁二醇。12周后比較各組的皺紋。用三個等級進行評價(與對照組相比)無改善；輕微改善；和顯著改善。其結果示于下表9。
表9


可以證實，芍藥甙能夠有效防止由UV引起的活的無毛老鼠的皮膚起皺。
<實施例1和比較例1>皮膚軟膏的制備如表10制備含有芍藥甙的皮膚軟膏。
表10


<實施例2和比較例2>面霜的制備如表11制備含有芍藥甙的化妝品面霜。
表11


<實施例3和比較例3>柔膚精華素的制備如表12制備含有芍藥甙的柔膚精華素。
表12


<實施例4和比較例4>精華素的制備如表13制備含有芍藥甙的精華素。
表13


<實施例5和比較例5>美容涂敷劑的制備如表14制備含有芍藥甙的美容涂敷劑。
表14


<實施例6和比較例6>營養精華素的制備如表15制備含有芍藥甙的營養精華素。
表15


<測試例7>起皺改善效果測試實施例1和比較例1的軟膏以及實施例2和比較例2的面霜對35～50歲的健康女人的起皺改善效果。
將40個35～50歲的女人分為2組，每組20人。對第一組，在每個人的半側臉上涂敷實施例1和比較例1的軟膏。對第二組，在每個人的半側臉上涂敷實施例2和比較例2的面霜。隨機確定涂敷在左側臉或右側臉上。研究人員和受實驗者均不知道將軟膏或面霜涂敷在臉的哪一側上。受實驗者使用試驗化妝品8周，每天在洗臉后兩次。
8周后，用肉眼和圖像分析法評價起皺的改善。用肉眼觀察起皺的改善和在彈性上的改善，并評價為無改善、輕微改善或顯著改善。其結果示于表16中。
表16


通過比較在測試前后在眼睛下攝取的拷貝的圖像進行圖像分析(Xantopren，Bayer)。通過2維圖像分析測量皺紋密度。皺紋密度的平均下降率示于表17中。
表17


如表16和17可見，含有芍藥甙的軟膏和化妝品面霜，在用肉眼觀察中在20人中至少16位受實驗者表現出起皺改善效果。在無副作用的情況下，其在圖像分析中表現出優異的皺紋減少作用。因此，可以看出，芍藥甙在起皺的改善上是顯著有效的，而且是安全的。
從上述描述清楚表明，芍藥甙能夠增強皮膚細胞的活性和性能，并且能夠促進膠原蛋白纖維的合成，從而有助于皮膚組織的韌性和彈性的改善。另外，其能夠減少脂質過氧化物的產生，從而顯著防止內在性皮膚老化，顯著防止由UV引起的DNA損傷和皮膚起皺，并且在改善原有皺紋上是有效的。因此，包含芍藥甙的化妝品組合物可以成為非常有用的皮膚老化護理品。
權利要求
1.一種皮膚老化護理品，其包含作為活性成分的芍藥甙。
2.根據權利要求1所述的皮膚老化護理品，所述芍藥甙防止由UV引起的DNA損傷和皮膚起皺或改善原有皺紋。
3.根據權利要求1所述的皮膚老化護理品，基于干重，其包含0.001～10.0wt％的芍藥甙。
4.一種防止皮膚老化的化妝品組合物，基于干重，其包含0.001～10.0wt％的芍藥甙。
5.根據權利要求4所述的化妝品組合物，其選自包括面霜、精華素、美容涂敷劑、按摩霜、乳液、粉底、化妝底霜、唇膏和眼影的組。
6.一種防止皮膚老化的藥物組合物，基于干重，其包含0.001～10.0wt％的芍藥甙。
全文摘要
本發明涉及一種包含芍藥甙作為活性成分的皮膚老化護理品。由于芍藥甙在顯著抑制并改善內在性皮膚老化、顯著抑制并改善由UV引起的DNA損傷和皮膚起皺以及改善原有皺紋方面有效，所以包含芍藥甙的化妝品組合物和藥物組合物可以成為非常有用的皮膚老化護理品。
文檔編號A61K8/97GK1984637SQ200580023335
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月10日 優先權日2004年5月10日
發明者樸炯國, 林埈滿, 李相和, 姜常真, 趙完九 申請人:株式會社Lg生活健康