專利名稱：篩選與皮膚老化有關的基因和防止皮膚老化的材料的方法
技術領域：
本發明涉及篩選表現出與皮膚老化有關的特性變化的基因的方法以及通過控制這些基因的表達篩選防止皮膚老化的物質的方法。
背景技術：
到目前為止，主要在皮膚真皮層(dermal layer)的變化方面進行了關于皮膚老化的研究，且主要集中于調節膠原蛋白和膠原酶MMP (基質金屬蛋白酶，matrixmetal1proteinase)的生物合成。而且,抗老化化妝品中的唯一活性成分是視黃醇,眾所周知，該活性成分能夠有效地促進膠原蛋白的生物合成。然而，通過簡單的促進膠原蛋白合成不能充分實現皮膚老化的預防，而且，皮膚老化的癥狀和相關因素隨著導致老化的原因不同而不同。因此，為了下一代功能性化妝品的發展，需要研究全面考慮了各種不同因素的新方法。另外，必需通過綜合分析與皮膚老化有關的特性基因的變化以確定引起皮膚老化的原因和理解皮膚老化的機理，從而開發預防和治療皮膚老化的技術，控制與皮膚老化有關的靶基因的表達。

發明內容
技術問題相應地，為獲得與防止老化有關的新的靶基因，本發明的發明人利用基因芯片，通過全面篩選顯示出與皮膚老化有關的特性變化的基因而進行了大量的嘗試。因此，本發明的目的是提供新的與防止老化有關的靶基因。本發明的另一個·目的是提供篩選新物質的方法，所述物質通過控制以上基因的表達而表現出抑制皮膚老化和治療皮膚疾病的效果。技術方案為了實現上述目的，本發明提供了一種篩選與皮膚老化有關的基因的方法，該方法包括以下步驟:1)從皮膚組織中提取總RNA，并將提取到的RNA進行微陣列分析；2)利用生物信息學技術(bioinformatics technique)分析隨老化而改變的基因；3)選擇與皮膚老化有關的候選基因；以及4)通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)確認所述候選基因。本發明還提供了一種用于篩選防止皮膚老化的物質的方法，該方法包括以下步驟:1)用控制細胞內基因表達的候選物質處理皮膚細胞樣品；2)將皮膚細胞樣品暴露于具有皮膚老化因子的環境中，以誘導細胞內基因的表達；以及3)測試步驟2)中皮膚老化因子誘導的細胞內基因的表達。有益效果根據本發明的篩選方法，可以根據引起皮膚老化的不同原因而篩選與皮膚老化有關的基因。此外，不僅可以研究與UV輻射引起的光老化有關的基因，而且還可以研究引起與更年期相關的自然老化(intrinsic aging)的基因，而且根據靶基因的不同，可以開發差異化產品(differentiated products)。因此,可以從根本上防止皮膚老化。


圖1顯示了對年輕人和老年人的皮膚中甘丙肽前體肽源(galaninprepropeptide)進行的微陣列分析和定量RT-PCR的結果。圖2和3顯示了通過SiRNA方法抑制甘丙肽前體肽源的表達，然后測試抗老化標記(MMP)和炎癥因子的表達中UV誘導的變化，以分析甘丙肽前體肽源的功能而獲得的結
果O圖4顯示了甘丙肽前體肽源和膠原蛋白的表達之間的關系，應用與圖2和3所示的相似方法，通過抑制甘丙肽前體肽源的表達而確定的該關系。圖5顯示了對年輕人和老年人的皮膚中骨甘氨酸(osteoglycin)進行的微陣列分析和定量RT-PCR的結果。圖6顯示了甘丙肽前體肽源和膠原蛋白的表達之間的關系，通過抑制骨甘氨酸的表達而確定的該關系。圖7顯示了 16個脂溢性角化病中表達增強的基因。
具體實施例方式盡管皮膚老化是由不同因素引起的，但是將著重從以下方面對本發明進行描述。1、由于時間推移而引起的自然老化
2、由激素引起的更年期老化3、脂溢性角化病

本發明提供了一種篩選與皮膚老化有關的基因的方法，該方法包括以下步驟:1)從皮膚組織中提取總RNA，并將提取到的RNA進行微陣列(miCToarray)分析；2)利用生物信息學技術分析隨老化而改變的基因；3)選擇與皮膚老化有關的候選基因；以及4)通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)確認所述候選基因。參與或者不參與皮膚老化的基因、男性或女性中表達增強或減弱的基因，隨引起皮膚老化的原因不同而不同，而且表達改變的基因可被確定為與皮膚老化有關的基因。因此，可以挑選這些基因作為與皮膚老化有關的候選基因。在本發明中，通過篩選方法發現:甘丙肽前體肽源、Wnt3、TNS4、骨甘氨酸等可以作為與皮膚老化有關的新的靶基因，但是，本發明的范圍并不局限于此。本發明還提供了一種篩選物質的方法，所述物質通過控制以上靶基因的表達而具有防止皮膚老化的能力。具有防止皮膚老化作用的候選物質可以通過使用細胞搜索系統搜索，然后利用志愿者的皮膚評估其對人體的作用而進行篩選。本發明還提供了一種用于篩選防止皮膚老化的物質的方法，該方法包括以下步驟:1)用控制細胞內基因表達的候選物質處理皮膚細胞樣品；2)將皮膚細胞樣品暴露于具有皮膚老化因子的環境中，以誘導細胞內基因的表達；以及3)測試步驟2)中皮膚老化因子誘導的細胞內基因的表達。關于本發明所述方法的步驟I)中的細胞樣品，可以使用任何細胞，只要將它們置于導致皮膚老化的環境中時，能誘導與皮膚老化有關的基因的表達即可。具有皮膚老化因子的環境的實例包括但并不限于各種引起皮膚老化的因子，包括:紫外線、熱和激素。在本發明所述方法的步驟3)中，皮膚老化因子誘導的細胞內基因的表達可以通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行測試。根據以上所述的方法，我們可以找到與皮膚老化有關的新的靶基因，并開發新的和差異化產品，根據皮膚老化有關的基因的不同原因，所述產品作用于與皮膚老化有關的基因。實施例下文中，將結合實施例進一步詳細地描述本發明。但是，應當理解的是，這些實施例是以說明為目的的，在不脫離本發明范圍和精神的情況下，各種修改、添加和替換都是被允許的。測試實施例1:自然老化模型的微陣列分析為了篩選與由于時間推移而引起的自然老化有關的基因，在人皮膚上進行測試。挑選18-25歲的年輕人(4男4女)和78_82歲的老年人(4男4女)作為受試者，從每個受試者身上通過4-8mm的穿刺活檢(punch biopsy)采集4_6個臀部皮膚樣品。從采集的皮膚樣品中提取總RNA并進行微陣列分析(Affymetrix GeneChipHuman HG-U133 Plus2.0),利用生物信息學技術(DAVID Bioinformatics Resources/Genespring)分析隨年齡而改變的基因。根據分析結果選擇與皮 膚老化有關的候選基因，并通過定量RT-PCR的結果進行確認。下表I顯示了在男性或女性中表達增強或減弱的基因數。表I
只在男性中存在共同的只在女性中存在
男性女性
總數 497200200123
增強的 405%3856
減弱的 92 6216267(Ρ〈=0.05，2 倍變換 U133-2 探針(probes)，無 FDR)因為沒有在男性中增強、女性中減弱的探針，因此，共同基因中不存在在男性和女性之間具有差異的探針。下表2顯示了在老年男性和老男女性皮膚中表達都增強的基因。表權利要求
1.一種篩選與皮膚老化有關的基因的方法，該方法包括以下步驟: O從皮膚組織中提取總RNA，并將提取到的RNA進行微陣列分析； 2)利用生物信息學(bioinformatics)技術分析隨老化而改變的基因； 3)選擇與皮膚老化有關的候選基因；以及 4)通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)確認所述候選基因。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，皮膚老化是由于時間推移而引起的自然老化、由激素引起的更年期老化或者脂溢性角化病。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述自然老化與選自由LPL、ADIPOQ、PLN、AL0X15B、SPRR1A、STP12A、INSIGl和GAL組成的組中的一種或多種基因有關。
4.根據權利要求2所述的方法，其中，所述更年期老化與選自由MMP3、FIGF,CMAl、RSP03、DPP4、C0L1A1、LPHN3、GREBl和OGN組成的組中的一種或多種基因有關。
5.根據權利要求2所述的方法，其中，所述脂溢性角化病與選自由L0XL2、WNT3、C0L17A1、CIDEB、H0XA7、CDH3、SILV、MXl、PLAT、CCL2、ID1、AQP3、TNS4、ISG15、FGFR3 和 pl6組成的組中的一種或多種基因有關。
6.一種用于篩選防止皮膚老化的物質的方法，該方法包括以下步驟: 1)用控制細胞內基因表達的候選物質處理皮膚細胞樣品； 2)將皮膚細胞樣品暴露于具有皮膚老化因子的環境中，以誘導細胞內基因的表達；以及 3)測試步驟2)中皮膚老化因子誘導的細胞內基因的表達；
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述細胞內基因是指與由于時間推移而引起的自然老化、由激素引起的更年期老化或者脂溢性角化病有關的基因。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述自然老化與選自由LPL、ADIPOQ、PLN、AL0X15B、SPRR1A、STP12A、INSIGl和GAL組成的組中的一種或多種基因有關。
9.根據權利要求7所述的方法，其中，所述更年期老化與選自由MMP3、FIGF,CMAURSP03、DPP4、C0L1A1、LPHN3、GREBl和OGN組成的組中的一種或多種基因有關。
10.根據權利要求7所述的方法，其中，所述脂溢性角化病與選自由L0XL2、WNT3、C0L17A1、CIDEB、H0XA7、CDH3、SILV、MXl、PLAT、CCL2、ID1、AQP3、TNS4、ISG15、FGFR3 和 pl6組成的組中的一種或 多種基因有關。
全文摘要
本發明涉及一種篩選皮膚老化特異性基因的方法以及通過控制基因表達篩選抗老化材料的方法。本發明能夠提供一種新材料，所述新材料通過獲得與皮膚老化有關的新靶基因和控制基因的表達而具有防止皮膚老化和治療皮膚疾病的功效。
文檔編號C12N15/12GK103249842SQ201180056031
公開日2013年8月14日 申請日期2011年11月25日 優先權日2010年11月30日
發明者孫義東, 李真锳, 羅勇柱, 金惠暻, 金知賢, 安秀美, 金漢坤, 鄭振鎬, 樸致炫, 徐銀英, 李玟政, 吳仁憬, 尹鉉善 申請人:株式會社愛茉莉太平洋, 首爾大學校產學協力團