專利名稱：抗菌組合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及有抗菌活性的物質及其使用方法；特別涉及用于減少傷口感染的組合物，更特別涉及在惰性載體內的、經(jīng)驗證對減少和預防傷口細菌感染/超感染有效的、包括有機酸和EDTA混合物的組合物。
背景技術：
為預防疾病、減少感染以及減少食物和水源污染，一直以來控制微生物生長都是我們面對的一項挑戰(zhàn)。高溫和/或射線處理是已知的減少表面微生物污染的方法。另外，許多物質都有抗菌功效，包括酒精、漂白劑、酸、過氧化物和醋等等。
和酒精一樣，用醋作抗菌劑由來已久，到大約公元1000年，中國和阿拉伯的古代醫(yī)書上都推薦在尸體解剖時用醋洗手以防感染(Chan等，American Journal of Nephrology 14(4-6295-301)1994)。中世紀，醫(yī)生們嘗試用醋混合物來預防感染“黑死病”(腹股溝淋巴結鼠疫)(Fradin等，MedicineYesterday，Today and Tomorrow，Children′sPress，Chicago 1989)。目前醋仍是許多抗菌劑組合物中的添加劑。
醋是一種不純的有機酸(乙酸)，富含許多揮發(fā)性雜質(DeVincenzi等，F(xiàn)ood Additives and Contaminants 4(2)161-218 1987)。醋被批準用于人非食品用途，在作為陰道洗液的主用成分時略微有效，盡管其作用機理尚不清楚(Nyirjesy等，Obstetrics and gynecology 90(1)50-53 1997)。對純乙酸、乙酸鈉和醋的功效很少作過比較(Brighenti等，European Journal of Clinical Nutrition 49(4)242-247 1995)，對其抗菌活性更是從未比較過。雖然一些陰道洗液中使用了乙酸鈉，但一直未測定其功效(Chvapil等，Obstetrics and Gynecology 52(1)88-931978)。盡管細菌對酸敏感是抗菌活性的一個因素，但這并不足以解釋醋的抗菌作用，因為一些常見的食源性細菌對醋特敏感，而在胃酸中卻能存活并引發(fā)常見的腸道疾病(Nishikawa等，InternationalJournal of Food Microbiology 18(4)271-278 1993)。
有關醋可能具有抗菌作用的科學文獻為數(shù)不多(Larghi等，RevAsoc Argentina Microbiology 7(3)86-90 1975(Spanish)；Fasanella RMOphthalmalic Surgery 22(2)117-118 1991；Karapinar等，InternationalJournal of Food Microbiology 16(3)261-264 1992)。其中一些研究結果已發(fā)現(xiàn)在食品加工業(yè)應用的途徑(Dickens等，Poultry Science 73(4)576-581 1994；Entani等，Kansenshogaku Zasshi 71(5)443-450(Japanese)1997)。雖然在將宰殺后的雞冷凍前用醋處理的結果顯示細菌污染減少，但尚未見到有關醋對活性皮膚有抗菌作用的公開報道(Dickens等，Poultry Science 73(4)576-5811994)。太平洋周邊國家普遍使用皮膚用醋制藥膏，在那兒醋被用作刺絲囊抑制劑，是輔助治療有可能致命的海蜇刺的首選推薦品(Fenner等，Medical Journal ofAustralia 143(12-13)550-551，554-555 1985；Beadnell等，MedicalJournal of Australia 156(9)655-658 1992；Fenner等，Medical JournalofAustralia 158(7)498-5011993)。體外組織培養(yǎng)研究表明，乙酸濃度超過0.025％會對人成纖維細胞和角質形成細胞產生毒性。這一數(shù)據(jù)與醋洗液的頻繁使用形成鮮明對比，因為陰道內長時間使用醋洗液并無不適(Nyirjesy等，Obstetrics and Gynecology 90(1)50-53 1997)。
除醋之外，用檸檬酸作潛在的抗菌劑也是可行的，但是有關其抗菌功效報道的出版科技文獻還不多見。不過檸檬酸是食品和飲料，如軟飲料中常用的防腐劑。在例如牙科手術的醫(yī)療過程中，還使用檸檬酸進行消毒(Smith等，American Association of Endodontists，AAE，Volume 12，number 2；2004年6月4日從AAE網(wǎng)站摘錄)。
雖然能用于抗菌的方法和物質很多，但大多數(shù)方法和手段并不適用所有情況，而且效果有限、有毒并且/或者產生微生物耐受性。所以考慮到微生物滋生是持久性問題，就不斷需要有新的抗菌方法和物質。
現(xiàn)有技術描述回顧現(xiàn)有技術，有大量的抗菌組合物和方法。這里列舉幾例。
美國專利4,308,293公開了包括焦木酸和焦木酸絡合物、用作動物飼料的抗真菌、抗細菌防腐劑的組合物。
美國專利6,110,908公開了包括消毒酒精、抗菌脂質體及其組合、用于局部消毒的組合物。
美國專利6,106,773公開了一種用于生物流體消毒的水性碘化基質材料。
美國專利5,308,611公開了含組合物、用作消毒劑的氯已定。
美國專利5,336,432公開了一種有消毒、漂白特性的微乳凝膠，它由含水和丙二醇的水相和通常含至少一種表面活性劑、潤膚劑和油的油相混合制成。該微乳中還加入了過氧化氫。
美國專利4,035,483公開了一種包含次氯酸鹽與蛋白質反應產物的抗菌組合物。
美國專利5,785,972公開了一種含膠銀、helichrysum angusifolium或helichrysum italicum油和水溶性卵磷脂乳化原蜜(raw honey)的消毒液。
美國專利5,855,922公開了含金屬氯酸鹽、用于治療皮膚病的抗菌組合物。
美國專利6,589,513公開了一種包括辣椒和其他天然成分、用作口腔消毒劑的組合物。辣椒對該組合物中其他組分起增效作用。
Lauman等(American Journal of Surgery 157359 1989)發(fā)表了有關皮膚消毒劑的綜述。
盡管已有許多已知的抗菌制劑，但仍然需要在多種情況下都易使用的更有效制劑。本發(fā)明提供一種包括弱有機酸和EDTA混合物、具有抗菌作用且不依賴于H+濃度(pH)的組合物。該組合物在受損部位施用10-20分鐘即可去除，去除后仍提供保護/傷口清潔作用。這與現(xiàn)有抗菌制劑需要長時間持續(xù)保留在受損部位截然不同?，F(xiàn)有技術中沒有公開這種特性的組合物。所以，本發(fā)明組合物使人們對強效抗菌制劑的渴望得以滿足。
雖然并不想限定成任何特定的操作模式，但理論上在EDTA存在時弱有機酸組合使微生物蛋白變性的作用被增強。

發(fā)明內容
授予本發(fā)明人、其內容在此引入作為參考的美國專利6,469,066B1(2002年10月22日)涉及組合物、其使用方法及環(huán)境，其中這些組合物包括置于膠狀載體內的弱有機酸和EDTA混合物，用于靶定傷害感受器，特別是TRPV-1(transient receptor potential vanilloid，辣椒素受體)，并且緩解尤其因灼傷引起的疼痛感。在施用這些組合物時意外發(fā)現(xiàn)它們有廣譜殺菌劑功效。本說明書公開了使用這些組合物減少和預防細菌感染/超感染的方法。該組合物尤其適合戰(zhàn)區(qū)使用，因為那里外傷很普遍，而且傷員經(jīng)常不能及時撤離。
本申請還涉及2002年8月30日提交的美國專利申請10/232,080，其內容在此引入作為參考。
本發(fā)明組合物包含至少兩種置于膠狀載體內、根據(jù)特定工藝參數(shù)混合的弱有機酸，這些弱有機酸例如優(yōu)選為但不限于醋、檸檬酸和乙酸。該組合物無論是感染后立即施用還是延誤后施用，均觀察有殺菌功效。該組合物可以凝膠或噴霧形式使用。以創(chuàng)傷敷料、吸收繃帶、女性衛(wèi)生用品、尿布等形式制成各種可發(fā)揮本組合物功效的物品也屬于本發(fā)明的范圍。
所以，本發(fā)明的一個目的是提供對減少和/或預防細菌感染/超感染，特別是傷口的細菌感染/超感染有效的組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種減少和/或預防細菌感染/超感染、包含治療有效量的至少兩種弱有機酸和EDTA的組合物。
本發(fā)明的再一目的是從包括但不限于乙酸、醋、檸檬酸或其組合的組中選用置于藥理有效載體內的治療有效的弱有機酸，其中該組合物的pH約為2.5-4.5。
本發(fā)明的再一目的是提供一種優(yōu)選為使用卡波普(Carbopol)膠凝劑或其等同物的水基凝膠形式的、用于弱有機酸的藥理有效載體。
本發(fā)明的再一目的是提供一種減少和/或預防傷口細菌感染/超感染的方法，其包括在受損部位施用一種組合物，該組合物包括置于藥理有效載體內的、治療有效量的、至少兩種選自包括但不限于乙酸、醋、檸檬酸及其組合的弱有機酸和EDTA，其中所述組合物的pH約為2.5-4.5；所述治療有效量能減少和/或預防所述傷口的細菌感染/超感染。
本發(fā)明的再一目的是傷口暴露在外后盡速施用本說明書公開的組合物。
本發(fā)明的再一目的是受損部位施用本說明書公開的組合物后預定時間內，優(yōu)選但不限于5-20分鐘，從受損部位去除該組合物。
本發(fā)明的再一目的是提供一種用于減少和/或預防細菌感染/超感染的試劑盒，其包括一種用于減少和/或預防傷口細菌感染/超感染的組合物，該組合物包括置于藥理有效載體內的、治療有效量的、至少兩種選自乙酸、醋、檸檬酸及其組合的弱有機酸和EDTA，其中所述組合物的pH約為2.5-4.5；選自傷口敷料、吸收繃帶、女性衛(wèi)生用品和尿布的包裹或包扎材料；以及使用說明書。
結合下面以說明和舉例、本發(fā)明特定實施例方式進行闡述的說明及附圖中可顯而易見的了解本發(fā)明的其他目的和有益效果。附圖構成本說明書的一部分，包括本發(fā)明的典型實施例，并示出本發(fā)明的各項目的及其特征。
縮略語和定義本說明書所用術語、短語和縮略語定義如下，雖然以下術語、短語和縮略語以單數(shù)形式列出，但其定義包括所有的語法形式。
本文所用術語“微生物的”是指微生物的或與微生物相關的。
本文所用術語“微生物”是指借助顯微鏡才能看到的任何微生物。本發(fā)明組合物尤其抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有效。本文所用術語“微生物(microorganism)”和“微生物(microbe)”可互換使用。
本文所用術語“革蘭氏陽性菌”是指革蘭氏染色試驗中染成藍紫色(陽性)的細菌細胞。革蘭氏染色劑能與革蘭氏陽性菌細胞壁中富含的肽聚糖結合。相反，“革蘭氏陰性菌”的細胞壁中肽聚糖含量低，所以在革蘭氏染色試驗中革蘭氏陰性菌吸收復染劑。
本文所用術語“細菌污染”是在物質含有＜104細菌/ml時使用。
本文所用術語“細菌感染”是指細菌侵入機體組織內繁殖而導致組織損傷和疾病。
本文所用術語“細菌超感染”是指前一次感染后又發(fā)生第二次感染；第二次感染通常比第一次感染更具破壞性，這往往是由于細菌對第一次感染治療時所用抗生素產生抗性所致。本發(fā)明組合物能減少細菌感染(和/或超感染)并阻止感染惡化。
本文所用術語“CFU”是指菌落形成單位(colony forming unit)，是用來確定活細菌數(shù)量的度量單位。
本文所用術語“浮游生長”是指細菌體懸浮在液體培養(yǎng)基中自由游動的生長。
本文所用術語“生物膜生長”是指細菌集合體在固體表面上生長。
本文所用術語“弱酸”是指在水中不完全電離的酸；某一時間點這類酸多數(shù)都以非電離分子形式存在?！坝袡C”酸是指含碳原子、通常含碳鏈的酸。醋是不純的弱有機酸乙酸。
本文所用首字母縮寫詞“EDTA”是指乙二胺四乙酸，一種金屬螯合劑。
本文所用術語“pH”是指溶液中氫離子濃度的度量單位。
本文所用術語“增效作用”是指至少兩種物質在一起作用，導致總效果增加，這種結合比其中任一種物質單獨作用的效果更強。
本文所用術語“無效對照劑”是指人為進行的無效治療。臨床上使用無效對照劑來比較治療相對于不治療的結果。試驗性治療必須相對于無效對照劑獲得結果才能視為有效。
本文所用短語“有效量”是指足以使微生物污染減少的弱酸量。
本文所用短語“藥理有效載體”是指準許在人和動物中使用、有助于輸送本發(fā)明組合物中弱酸、并且不影響療效的載體。本發(fā)明的載體是一種沒有藥理或治療作用的惰性載體。
本文所用術語“治療”是指任何有益的醫(yī)治結果，特別是減少和/或預防細菌感染/超感染。
本文所用縮略語“AA”是指乙酸(acetic acid)。
本文所用縮略語“CA”是指檸檬酸(citric acid)。
本文所用縮略語“PBS”是指磷酸緩沖鹽(phosphate-bufferedsaline)。


圖1是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分別在含本發(fā)明組合物和含無效對照劑組合物的肉湯中生長的比較圖；圖2是另一張銅綠假單胞菌分別在含本發(fā)明組合物和含無效對照劑組合物的肉湯中生長的比較圖；圖3是銅綠假單胞菌分別在三塊聚氨酯海綿上生長的比較圖；第一塊海綿含有本發(fā)明組合物，第二塊海綿含無效對照劑組合物，第三塊海綿含有熟知的臨床準用抗菌劑(5％醋酸磺胺米隆)。將銅綠假單胞菌接種到聚氨酯海綿上之后立即分別施加各組合物1次。
圖4是比較銅綠假單胞菌在兩塊聚氨酯海綿上生長的對照圖；一塊海綿包含無效對照劑組合物，另一塊海綿含有熟知的臨床準用抗菌劑(5％醋酸磺胺米隆)。
圖5是銅綠假單胞菌分別在三塊聚氨酯海綿上生長的比較圖；第一塊海綿含有無效對照劑組合物，第二塊海綿含有本發(fā)明組合物，第三塊海綿也含有本發(fā)明組合物。所有海綿上施加1次；5分鐘后去除第二塊海綿上的組合物，20分鐘后去除第三塊海綿上的組合物。
圖6是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)分別在三塊聚氨酯海綿上生長的比較圖；第一塊海綿含有無效對照劑組合物，第二塊海綿含有本發(fā)明組合物，第三塊海綿也含有本發(fā)明組合物。所有海綿上施加1次；5分鐘后去除第二塊海綿上的組合物，20分鐘后去除第三塊海綿上的組合物。
圖7是銅綠假單胞菌分別在兩塊聚氨酯海綿上生長的比較圖；第一塊海綿含有無效對照劑組合物，第二塊海綿含有本發(fā)明組合物。將細菌接種到海綿上之后4小時施加各組合物1次。
圖8是銅綠假單胞菌分別在兩塊聚氨酯海綿上生長的比較圖；第一塊海綿含有無效對照劑組合物，第二塊海綿含有本發(fā)明組合物。將細菌接種到海綿上之后24小時施加各組合物。施加3次10分鐘，第三次施加的凝膠保留到實驗結束。
圖9是銅綠假單胞菌在聚氨酯海綿上生長的比較圖；海綿含有無效對照劑組合物或本發(fā)明組合物。將細菌接種到海綿上之后24小時施加各組合物1次。10分鐘后去除各組合物。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種新型并極其有效的抗菌組合物。該組合物不受pH影響，能有效抵抗廣譜革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌。目前使用的抗菌組合物需要在受損的傷口部位持續(xù)保留較長時間以便發(fā)揮效用，相反，本發(fā)明組合物即使從受損的傷口部位去除，仍然繼續(xù)發(fā)揮保護作用。
本發(fā)明組合物含有一種需謹慎控制濃度的酸，典型地是來自人皮膚能耐受的弱有機酸，優(yōu)選地是選自乙酸、醋、檸檬酸或其組合的有機酸。在一個優(yōu)選實施例中，該組合物包含乙酸終濃度約0.5-5％的乙酸或醋酸和約2-8％的檸檬酸。在一個最優(yōu)選實施例中，該組合物包含乙酸終濃度約1％的乙酸或醋酸和5％的檸檬酸。該組合物可以是液體、凝膠、洗液、氣霧劑形式、或者是施用在皮膚上的敷料形式。
本組合物的pH約為2.5-4.5。該組合物的pH選擇取決于所用制劑和該制劑中其他組分對酸性pH的耐受能力。基于卡波普的凝膠制劑的pH優(yōu)選為約4.2，該pH值對凝膠制劑有利。
將本組合物制成凝膠或洗液形式，可在皮膚的受損部位產生較長時間的持續(xù)作用。該凝膠或洗液可以是使用合適的膠凝劑或增稠劑的水基凝膠。該洗液也可以是乳劑——水包油乳劑或油包水乳劑。典型的這類乳劑是使用包括硬化劑、潤膚劑、乳化劑和保濕劑的常規(guī)成分制成。硬化劑通常是油溶性的脂肪醇，如硬脂醇、鯨蠟醇、月桂醇和肉豆蔻醇。潤膚劑通常是異丙基豆蔻酸酯、羊毛脂、羊毛脂衍生物、異丙基棕櫚酸酯、異丙基硬脂酸酯和對應的癸二酸酯。乳化劑優(yōu)選為非離子物質，通常是山梨糖酐單油酸酯和硬脂酸聚烴氧(40)酯。保濕劑通常是丙二醇、山梨醇、甘油及其混合物。選用的乳劑成分能耐受最終的約2.5-4.5的pH。典型的制劑組成按重量百分比如下組分 重量％凡士林0-25硬化劑7-45潤膚劑0-15乳化劑4-16保濕劑7-40弱有機酸 5水q.s.100本發(fā)明組合物優(yōu)選為制成弱酸濃度穩(wěn)定的水溶性凝膠。例如，該凝膠制劑可使用卡波普作膠凝劑。卡波普是食品、化妝品、處方藥和OTC藥中常用的膠凝劑，高度親水，用自來水可快速去除。這一特點便于再次施用以延長本組合物的抗菌作用。
所用的卡波普聚合物購自B.F.Goodrich公司，是高分子量的丙烯酸交聯(lián)聚合物?？úㄆ站畚锸潜┧崤c烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)的聚合物?？úㄆ展簿畚锸潜婚L鏈烷基(C10-C30)丙烯酸酯修飾、并與烯丙基季戊四醇交聯(lián)的丙烯酸聚合物。通常使用的樹脂是松軟的白色干燥粉末(100％有效)。聚合物的烯丙酸主鏈上的羧基決定著產品的多數(shù)優(yōu)點?？úㄆ諛渲拿總€羧基的平均當量為76。
外觀松軟、白色、略微酸性粉末體積密度約208kg/m3(13lbs ft3)比重1.41船運含水量最大值2.0％平衡含水量8-10％(50％時，比較潮濕)pKa6.0±0.51.0％水分散液pH2.5-3.00.5％水分散液pH2.7-3.5當量76±4灰分0.009ppm(均值)玻璃化轉變溫度100-105℃(212-221)共溶劑(環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物)中產生的聚合物的體積密度為176kg/m3(11lbs/ft3)。乙酸乙酯中產生的聚合物中的平均灰分(如硫酸鉀)為1-3％。
本領域的技術人員顯然可知，如果其它已知的膠凝劑在最終的pH范圍內也能形成凝膠，并且不影響有機酸的效用，則除卡波普外，還可以使用其它膠凝劑，或者使用其它膠凝劑來替代卡波普。
本發(fā)明組合物還可以制成氣霧劑形式，優(yōu)選地是裝在泵式容器內以合適的噴霧形式噴在受損部位。這種氣霧劑可以僅僅是弱有機酸的水溶液，或者可以包括其它成分，氣霧劑中典型的其它成分例如為硬化劑、保濕劑或草藥提取物，如庫拉索蘆薈(Aloe Vera)，只要這些額外的成分不影響本組合物的特性就行。氣霧劑形式的優(yōu)點在于不用與皮膚直接物理接觸即可將其施用到受損部位。
本發(fā)明組合物還可以制成施用在皮膚上的敷料形式。該敷料可以是浸有本發(fā)明組合物的紗布或其他合適的吸收材料。使用這種敷料可以建立一道物理屏障，幫助保護受損部分免受與外界可能的摩擦接觸。
本發(fā)明組合物還可以制成保持在吸收物纖維基質內的吸收凝膠形式，如護墊或衛(wèi)生棉條等女性衛(wèi)生用品，或者根據(jù)需要可以是尿布等。雖然并不想限定成任何特定的操作理論，但據(jù)認為，因為可從身體吸收濕氣，所以存在向有關的表皮接觸部位輸送本發(fā)明組合物的有效成分的路徑。
本發(fā)明的實施例可以制成試劑盒形式，其包含用于減少和/或預防細菌感染/超感染的組合物，該組合物包括置于藥理有效載體內的、治療有效量的、至少兩種選自乙酸、醋、檸檬酸及其組合的弱有機酸和EDTA，其中所述組合物的pH約為2.5-4.5；選自傷口敷料、吸收繃帶、女性衛(wèi)生用品和尿布的包裹或包扎材料；以及使用說明書。
在上述試劑盒中還包括有助于使受損組織免受環(huán)境侵害的其他物品，以及其他幫助皮膚治療的物品，這些都在本發(fā)明的范圍內。幫助輸送本組合物的施加器也可以包括在該試劑盒中。
下面將述及本發(fā)明組合物制劑的一些實施例。應當意識到，這些特定實施例并非要限制本發(fā)明，而只是對優(yōu)選實施例作出說明。
酸性凝膠的制備A.制備兩種含以下酸的凝膠11％乙酸(AA)/5％檸檬酸(CA)凝膠(200ml)21％乙酸/4％檸檬酸凝膠(200ml)B.根據(jù)上述酸濃度制備以下含0.1％EDTA的溶液
5％CA+1％AA4％CA+1％AACA一水合物11.0g 8.75g(FW.210)EDTA120g 0.20g 0.20g蒸餾水加到160ml 加到160ml醋(～5％乙酸) 40ml 40mlC.凝膠產品裝到約300ml的燒杯中以最高轉速(2500rpm)進行磁力攪拌用精細金屬網(wǎng)將3.6g卡波普940NF(1.8g/100ml)非常緩慢地加到上述各溶液中，避免成團。
不斷攪拌懸浮液直到順滑而且沒有白色卡波普薄片為止；如果還有少量薄片，用刮鏟攪散。
每次加入10N NaOH 1ml/0.5ml/0.2ml，得到pH4.2的5％CA+1％AA.10.3ml 10N NaOH(5.2ml NaOH/100ml凝膠)和4％CA+1％AA9.0ml 10N NaOH(4.5ml NaOH/100ml凝膠)；卡波普膠凝化使磁力攪拌子停止攪拌，剩下的攪拌工作則需要用刮鏟完成。
將凝膠轉到15ml和50ml的Falcon管中，旋轉5分鐘/2000rpm(550g)將凝膠中氣體排出。
為避免醋中的乙酸揮發(fā)，一定不要用真空來排除混合物中氣體。
其他凝膠制劑用蒸餾水將冰乙酸(99.8％)和固體檸檬酸一水合物(分析純)分別稀釋到5％(wt/v)。另外用檸檬酸一水合物和含5％乙酸的食品級商品醋制備含4％或5％檸檬酸和1％乙酸的混合物。將該混合物置于室溫下并攪動20分鐘，纖維素膜過濾，然后加入EDTA至0.1％。接著，緩慢加入固體卡波普940NF或980NF至1.8％，同時高速磁力攪拌直到懸浮液中沒有顆粒為止。然后向混合物中加入10N NaOH緩慢攪拌，調節(jié)其pH至4.2以利于膠凝化。例如，每100ml醋和5％乙酸凝膠需要2.8ml堿性溶液，而100ml 5％檸檬酸凝膠則需要4.3ml堿性溶液。
10N NaOH的實際用量可能稍有變化，這取決于所用蒸餾水的特定pH參數(shù)。最后室溫下低速(2000rpm)離心5分鐘將凝膠懸浮液中多余氣體排出。
同樣用蒸餾水、EDTA和卡波普940NF或980NF制備中性(pH7.0)凝膠作為酸性凝膠的對照。由于卡波普介導的膠凝化在接近中性pH時更有效，所以制備中性凝膠所用的卡波普量明顯減少。另外，也可用10NNaOH滴定5％乙酸來制備中性凝膠。
這些制劑概括如下制備I醋制劑

制備II5％乙酸制劑


制備III5％檸檬酸制劑

制備IV5％檸檬酸+醋制劑

制備V4％檸檬酸+醋制劑

制備VI蒸餾水制劑pH7.0


制備VII用5％乙酸和NaOH制備的中性制劑(pH7.0)

用于測試本組合物的抗菌功效的實驗的代表性實施例描述如下。
實施例1胰蛋白大豆肉湯、37℃、搖動水浴下培養(yǎng)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 27317，革蘭氏陰性菌)，獲得對數(shù)生長期的生長培養(yǎng)物。然后用無菌磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌該懸浮液兩次，并用無菌PBS重懸。將系列稀釋液鋪到添加5％羊血的胰蛋白大豆瓊脂平板上，以測定洗滌后接種菌的細菌濃度。
為測定浮游生長，將無效對照劑組合物和本發(fā)明組合物各200μl分別加到含104菌落形成單位(CFU)/ml的胰蛋白大豆肉湯中。手動混勻細菌混合物直到所有凝膠溶解，然后37℃培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)期間，采用熟知的微生物程序在各時間間隔測定細菌生長。
與含無效對照劑組合物的肉湯相比，含本發(fā)明組合物的肉湯在細菌培養(yǎng)3小時內，銅綠假單胞菌數(shù)量降低2個對數(shù)級(Log)。在使用本發(fā)明組合物的48小時實驗中，浮游生長趨于穩(wěn)定(3.3×102CFU/ml)，而使用無效對照劑組合物，觀察到菌數(shù)增加7個對數(shù)級。實驗數(shù)據(jù)如圖1和圖2中所示。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
實施例2銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 27317)培養(yǎng)同例1。
本研究模擬傷口表面感染后立即治療的情形。
為測定本發(fā)明組合物清除細菌生物膜的能力，使用聚氨酯海綿模型體外模擬表面感染和深度感染的傷口。將聚氨酯海綿放在淺水盤中，接種102CFU銅綠假單胞菌。接種后立即取無效對照劑組合物、含5％醋酸磺胺米隆(熟知的臨床準用抗菌凝膠)的無效對照劑組合物和本發(fā)明組合物各200μl分別施加到各聚氨酯海綿上。這些組合物保留在海綿上，37℃培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)期間在各時間間隔測定細菌生長。
24小時內，覆有無效對照劑組合物的海綿上的細菌數(shù)增加到1010CFU，隨后48小時趨于穩(wěn)定。相反，72小時內，本發(fā)明組合物施加1次后細菌數(shù)維持在104CFU以下。而且，在第一個48小時內，海綿上施加本發(fā)明組合物的細菌數(shù)要比使用臨床準用抗菌組合物低3個對數(shù)級。該實驗數(shù)據(jù)如圖3所示。圖4是比較兩塊聚氨酯海綿上銅綠假單胞菌生長的對照圖；一塊海綿含無效對照劑組合物，另一塊海綿含熟知的臨床準用抗菌制劑(5％醋酸磺胺米隆)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
實施例3銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 27317)培養(yǎng)同例1。
本實驗是要確定組合物發(fā)揮顯著抗菌作用的最小施用時間。將四塊聚氨酯海綿置于一個淺水盤中，接種103CFU銅綠假單胞菌。將1份200μl無效對照劑組合物(施加1次)施加到海綿1和2上，1份200μl本發(fā)明組合物施加到海綿3和4上。細菌接種后立即將各份施加到海綿上。5分鐘后去除海綿1和3上的組合物，20分鐘后去除海綿2和4上的組合物。然后將海綿置于37℃培養(yǎng)72小時。
24小時內，覆有無效對照劑組合物的海綿上的細菌數(shù)增加到至少109CFU；隨后48小時趨于穩(wěn)定。相反，接種后48小時內，本發(fā)明組合物施用1個5分鐘后銅綠假單胞菌被清除。將本發(fā)明組合物的施用時間增加到20分鐘，24小時內銅綠假單胞菌數(shù)降低5個對數(shù)級，隨后未觀察到細菌生長。該實驗數(shù)據(jù)如圖5所示。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
實施例4本實驗用表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)(ATCC12228，革蘭氏陽性菌)代替銅綠假單胞菌重復例3實驗。
表皮葡萄球菌培養(yǎng)同例1中銅綠假單胞菌的培養(yǎng)。
本發(fā)明組合物施用1個5分鐘，48小時后清除表皮葡萄球菌。該實驗數(shù)據(jù)如圖6所示。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
實施例5銅綠假單胞菌(ATCC 27317)培養(yǎng)同例1。
本實驗模擬進行任何醫(yī)療性干擾之前因治療延誤而導致傷口感染逐漸惡化的情形。
將兩塊海綿置于一個淺水盤中，接種103CFU銅綠假單胞菌。細菌接種后4小時，取1份200μl無效對照劑組合物施加到第一塊海綿上，取1份200μl本發(fā)明組合物施加到第二塊海綿上。之后將海綿置于37℃培養(yǎng)72小時，組合物一直保留在海綿上。培養(yǎng)期間在各時間間隔測定細菌生長。
4小時內，接種細菌的海綿上銅綠假單胞菌水平增加1個對數(shù)級。24小時內覆有無效對照劑組合物的海綿上的細菌數(shù)增加到1010CFU，72小時內本發(fā)明組合物將細菌數(shù)維持在104CFU以下。該實驗數(shù)據(jù)如圖7所示。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
實施例6銅綠假單胞菌(ATCC 27317)培養(yǎng)同例1。
本實驗模擬進行任何醫(yī)療性干擾前因治療大大延誤而導致傷口感染逐漸惡化的情形。
將兩塊聚氨酯海綿置于一個淺水盤中，接種103CFU銅綠假單胞菌。接種后24小時，取1份200μl無效對照劑組合物施加到第一塊海綿上，取1份200μl本發(fā)明組合物施加到第二塊海綿上。施加后，讓第1份在海綿上保留5分鐘，然后去除并再次施加，第二次施加的組合物在海綿上保留10分鐘，然后去除并進行第三次施加，第三次施加的組合物在海綿上保留到實驗結束。將海綿置于37℃培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)期間在各時間間隔測定細菌生長。
細菌接種后24小時銅綠假單胞菌水平增加到109CFU。覆有無效對照劑組合物的海綿上的細菌數(shù)維持恒定。相反，施加本發(fā)明組合物后24小時內觀察到細菌降低4個對數(shù)級。施加本發(fā)明組合物后48小時沒有觀察到細菌，但72小時時細菌數(shù)增加到105CFU。該實驗數(shù)據(jù)如圖8所示。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
實施例7銅綠假單胞菌(ATCC 27317)培養(yǎng)同例1。
本實驗模擬進行任何醫(yī)療性干擾前因治療大大延誤而導致傷口不斷惡化的情形。
將六塊聚氨酯海綿置于一個淺水盤中，接種103CFU銅綠假單胞菌。接種后24小時，取1份200μl無效對照劑組合物施加到前三塊海綿上，取1份200μl本發(fā)明組合物施加到后三塊海綿上。施加后10分鐘去除海綿上的組合物。將海綿置于37℃培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)期間在各時間間隔測定細菌生長。
細菌接種到所有海綿后24小時內銅綠假單胞菌水平增加到1010CFU。覆有無效對照劑組合物的海綿上的細菌數(shù)維持恒定直至實驗結束。相反，施加本發(fā)明組合物后24小時內觀察到細菌降低3個對數(shù)級，隨后該抗菌療效一致維持到96小時。該實驗數(shù)據(jù)如圖9所示。數(shù)據(jù)以平均值±SEM(n＝6)表示。
本說明書公開的數(shù)據(jù)有力地表明本發(fā)明組合物具有快速減少細菌的浮游生長和生物膜生長的功效。無論是感染后立即施用還是延誤至24小時后施用，均有抗菌作用。
本說明書提到的所有專利和出版物顯示出本發(fā)明所屬技術領域的水平。將所有這些專利和出版物在此引入作為參考，這等同于單獨、特定地指出每個出版物在此引入作為參考。應當理解，本發(fā)明對某一特定形式予以說明時，并非是要對本文所述或所示的該特定形式和排列進行限制。本領域的技術人員顯然可知，在不脫離本發(fā)明的范圍內可以對本發(fā)明做出各種變更，而且不應認為本發(fā)明是對本說明書所述和所示內容的限制。本領域的技術人員很容易意識到，本發(fā)明很適于執(zhí)行本說明書提到的目的，并達到目標，取得有益效果，以及固有特性。本說明書所述的組合物、相關化合物、方法、步驟和技術代表的是優(yōu)選實施例，是作為典范而非對范圍的限制。本領域技術人員在本發(fā)明的精神范圍內會進行變更和其他應用，這些均受到權利要求范圍的限定。雖然結合特定優(yōu)選實施例對本發(fā)明做出描述，但應當理解，主張了權利的本發(fā)明不應受到這些特定實施例的限制。毫無疑問，為實施本發(fā)明而對所述模式作的各種改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，應屬于所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一種減少和/或預防傷口細菌感染/超感染的方法，其包括在受損部位施用一種組合物，該組合物包括置于藥理有效載體內的、治療有效量的、至少兩種選自乙酸、醋、檸檬酸及其組合的弱有機酸和EDTA，其中所述組合物的pH約為2.5-4.5；所述治療有效量能減少和/或預防所述傷口的細菌感染/超感染。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述施用是在所述傷口暴露在外后立即進行。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述施用是在所述傷口暴露在外后延誤一段時間進行。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述施用是在所述傷口暴露在外后4小時進行。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述施用是在所述傷口暴露在外后24小時進行。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，進行所述施用后5-20分鐘內從所述受損部位去除所述組合物。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，進行所述施用后5分鐘從所述受損部位去除所述組合物。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，進行所述施用后10分鐘從所述受損部位去除所述組合物。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，進行所述施用后20分鐘從所述受損部位去除所述組合物。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述組合物的pH為4.1-4.4。
11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述藥理有效載體包括膠凝劑。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，所述膠凝劑是丙烯酸交聯(lián)的均聚物或共聚物。
13.一種用于減少和/或預防細菌感染/超感染的試劑盒，其包括A)一種用于減少和/或預防傷口細菌感染/超感染的組合物，該組合物包括置于藥理有效載體內的、治療有效量的、至少兩種選自乙酸、醋、檸檬酸及其組合的弱有機酸和EDTA，其中所述組合物的pH約為2.5-4.5；b)選自傷口敷料、吸收繃帶、女性衛(wèi)生用品和尿布的包裹或包扎材料；以及c)使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于減少和/或預防細菌感染/超感染的組合物。該組合物包括至少兩種置于惰性載體內的弱有機酸，輸送時pH約為2.5－4.5。該弱有機酸優(yōu)選為乙酸、醋、檸檬酸或其組合。該惰性載體優(yōu)選為用卡波普作膠凝劑的凝膠形式的水基載體。本發(fā)明組合物尤其可應用于減少和/或預防傷口的細菌感染/超感染。
文檔編號A61P31/04GK101018548SQ200580028162
公開日2007年8月15日 申請日期2005年6月13日 優(yōu)先權日2004年6月21日
發(fā)明者M·H·多氏, K·奧斯特曼 申請人:諾思藥業(yè)公司