專利名稱：含有與治療性物質(zhì)連接的非天然鏈間二硫鍵的t細(xì)胞受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有與治療性物質(zhì)結(jié)合的非天然鏈間二硫鍵的T細(xì)胞受體(TCR)。
背景技術(shù)：
本文公開的新型TCR治療劑組合可用于治療自身免疫疾病、器官排異、移植物抗宿主病(GVHD)和癌癥。本文公開的TCR治療劑組合中的TCR部分是靶向部分。
發(fā)明簡述本發(fā)明首次制備了可利用的與治療性物質(zhì)結(jié)合的二聚體TCR(dTCR)或單鏈TCR(scTCR)，所述物質(zhì)選自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD8抗體、抗-CD44抗體、抗-CD45RA抗體、抗-CD45RB抗體、抗-CD45RO抗體、抗-Thy1.2抗體、抗淋巴細(xì)胞球蛋白、抗-αβTCR抗體、抗-γδTCR抗體、抗-CD49a抗體、抗-CD49b抗體、抗-CD49c抗體、抗-CD49d抗體、抗-CD49e抗體、抗-CD49f抗體、抗-TCR Vβ8抗體、抗-CD16抗體、抗-CD28抗體、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗體、抗-CD40L抗體、抗-ICAM-1抗體、ICAM-I、抗-Mac抗體、抗-LFA-1抗體、抗-IFN-γ抗體、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合體、抗-IL-2R抗體、IL-2R抗體、IL-2白喉(Diptheria)-毒素蛋白、抗-IL-12抗體、IL-12拮抗劑(p40)、抗-IL-1抗體、IL-1拮抗劑、谷氨酸脫羧酶(GAD)、抗-GAD抗體、病毒蛋白和肽、細(xì)菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神經(jīng)酰胺、降鈣素、煙酰胺、抗-氧化劑(維生素E、丙丁酚類似物、丙丁酚+地夫可特(deflazacoert)或氨基胍)、抗-炎性藥物(己酮可可堿或咯利普蘭(Rolipram))、免疫調(diào)節(jié)劑(羅喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍亂毒素B、釩酸鹽或維生素D3類似物、小分子CD80抑制劑、雄激素、IGF-1、免疫操控物(Immunomanipulation)(天然抗體)、狼瘡獨(dú)特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制劑、硅石、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗無唾液酸(Antiasialo)GM-1抗體、透明質(zhì)酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I類MHC抗體、或抗-II類MHC抗體、環(huán)孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脫氧精胍菌素(Deoxyspergualin)、PE38假單胞菌外毒素或上述任何物質(zhì)的功能性變體或片段；其中所述TCR包含由對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；該第一和第二鏈之間有一個(gè)二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物；和以所述scTCR為例，其還含有連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列，或反之亦然，該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應(yīng)使得所述第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的彼此定向基本上如同天然αβT細(xì)胞受體的那樣。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的二聚體TCR(dTCR)或單鏈TCR(scTCR)，所述物質(zhì)選自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD8抗體、抗-CD44抗體、抗-CD45RA抗體、抗-CD45RB抗體、抗-CD45RO抗體、抗-Thy1.2抗體、抗淋巴細(xì)胞球蛋白、抗-αβTCR抗體、抗-γδTCR抗體、抗-CD49a抗體、抗-CD49b抗體、抗-CD49c抗體、抗-CD49d抗體、抗-CD49e抗體、抗-CD49f抗體、抗-TCR Vβ8抗體、抗-CD16抗體、抗-CD28抗體、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗體、抗-CD40L抗體、抗-ICAM-1抗體、ICAM-I、抗-Mac抗體、抗-LFA-1抗體、抗-IFN-γ抗體、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合體、抗-IL-2R抗體、IL-2R抗體、IL-2白喉(Diptheria)-毒素蛋白、抗-IL-12抗體、IL-12拮抗劑(p40)、抗-IL-1抗體、IL-1拮抗劑、谷氨酸脫羧酶(GAD)、抗-GAD抗體、病毒蛋白和肽、細(xì)菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神經(jīng)酰胺、降鈣素、煙酰胺、抗-氧化劑(維生素E、丙丁酚類似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性藥物(己酮可可堿或咯利普蘭)、免疫調(diào)節(jié)劑(羅喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍亂毒素B、釩酸鹽或維生素D3類似物、小分子CD80抑制劑、雄激素、IGF-1、免疫操控物(Immunomanipulation)(天然抗體)、狼瘡獨(dú)特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制劑、硅石、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗無唾液酸GM-1抗體、透明質(zhì)酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I類MHC抗體、或抗-II類MHC抗體、環(huán)孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脫氧精胍菌素、PE38假單胞菌外毒素或上述任何物質(zhì)的功能性變體或片段；其中所述TCR包含由對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；該第一和第二鏈之間有一個(gè)二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物；和以所述scTCR為例，其還含有連接所述第一區(qū)段C末端與所述第二區(qū)段N末端的接頭序列，或反之亦然，該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應(yīng)使得所述第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的彼此定向基本上如同天然αβT細(xì)胞受體的那樣。
本文所用的術(shù)語“與治療性物質(zhì)結(jié)合的二聚體TCR(dTCR)或單鏈TCR(scTCR)”應(yīng)理解為表示TCR與治療性物質(zhì)共價(jià)或以其它方式連接。所述治療性物質(zhì)可以直接與TCR相連，也可經(jīng)接頭部分間接相連。
本文所用的術(shù)語“功能性變體”應(yīng)理解為表示所公開治療性物質(zhì)的具有相同治療作用的類似物。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道與本文公開的物質(zhì)相比，可以產(chǎn)生在其化學(xué)結(jié)構(gòu)或氨基酸序列中摻入微小改變但不會(huì)改變?cè)撐镔|(zhì)的治療作用的治療劑。這種普通的變體包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
功能性抗體片段和變體適用于本文所述組合物和方法的抗體片段和變體/類似物包括但不限于以下。
抗體片段本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可能產(chǎn)生基本上保留了親代抗體相同結(jié)合特性的某給定抗體的片段。下文提供了這種片段的細(xì)節(jié)微小抗體(minibody)-這些構(gòu)建物由具有截除了Fc部分的抗體組成。因此，它們保留了其所衍生抗體的完整結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
Fab片段-這些(構(gòu)建物)包含與免疫球蛋白重鏈的一部分共價(jià)相連的一條免疫球蛋白輕鏈。例如，F(xiàn)ab片段包含一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段定義為用木瓜蛋白酶處理而釋放的IgG的一部分。這種片段一般可經(jīng)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。(Reeves等，(2000)，《免疫學(xué)講稿》(Lecture Notes on Immunology)，(第四版)，BlackwellScience出版)F(ab’)2片段-這些(構(gòu)建物)包含一種抗體的二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和絞鏈區(qū)。F(ab’)2片段定義為用胃蛋白酶處理而釋放的IgG的一部分。這種片段一般可經(jīng)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。(Reeves等，(2000)，《免疫學(xué)講稿》(Lecture Notes on Immunology)，(第四版)，Blackwell Science出版)Fv片段-這些(構(gòu)建物)包含與免疫球蛋白輕(鏈)可變區(qū)共價(jià)相連的免疫球蛋白重(鏈)可變區(qū)。已產(chǎn)生了許多Fv設(shè)計(jì)。這些(構(gòu)建物)包括通過引入二硫鍵來增強(qiáng)兩結(jié)構(gòu)域之間締合的dsFv。或者，可利用肽接頭將兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起成為一條多肽而形成scFv。也已產(chǎn)生了含有免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變區(qū)，并與相應(yīng)的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)相結(jié)合的Fv構(gòu)建物。Fv也可多聚化而形成雙抗體或三抗體(Maynard等，(2000)，Annu Rev Biomed Eng，2 339-376)。
NanobodiesTM-由Ablynx(比利時(shí))投入市場(chǎng)的這些構(gòu)建物包含衍生自駱駝(camelid)(例如，駱駝或美洲駝)抗體的一個(gè)合成的免疫球蛋白重(鏈)可變區(qū)。
結(jié)構(gòu)域抗體-由Domantis(比利時(shí))投入市場(chǎng)的這些構(gòu)建物包含親和力成熟的一個(gè)免疫球蛋白重(鏈)可變區(qū)或免疫球蛋白輕(鏈)可變區(qū)。
抗體變體和類似物本發(fā)明所定義的抗體功能特性是它們能特異性結(jié)合靶配體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可工程改造許多其它蛋白質(zhì)的這種結(jié)合特性。適用于本發(fā)明組合物和方法的抗體變體和同類物的例子包括但不限于以下。
基于蛋白質(zhì)支架的結(jié)合多肽-該結(jié)合構(gòu)建物家族包括含天然結(jié)合環(huán)的蛋白質(zhì)的突變類似物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市場(chǎng)的基于衍生自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的三螺旋基序Affibodies抗體。另一例子是由EvoGenix(澳大利亞)投入市場(chǎng)的基于移植了類似于抗體結(jié)合環(huán)結(jié)構(gòu)域CTLA-4胞外結(jié)構(gòu)域的Evibodies抗體。最后一個(gè)例子是由RegeneronPharmaceuticals(US)投入市場(chǎng)的在抗體支架中嫁接有細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)域的Cytokine Traps。(Nygren等，(2000)Current Opinion in Structural biology，7 463-469)是利用支架經(jīng)工程改造在蛋白質(zhì)中加入新型結(jié)合位點(diǎn)的綜述。該綜述提及以下蛋白質(zhì)作為支架來源CP1鋅指(結(jié)構(gòu))、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z結(jié)構(gòu)域(蛋白A同類物)、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1和細(xì)胞色素b562。其它蛋白質(zhì)支架研究報(bào)道采用了纖連蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)和錨蛋白重復(fù)(序列)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以產(chǎn)生能與某給定蛋白配體不同部分結(jié)合的抗體或其片段，變體或類似物。例如，可制備針對(duì)形成此(CD3)復(fù)合物的多肽鏈(即，γ、δ、ε、ζ和ηCD3鏈)之一的抗-CD3抗體。能與εCD3鏈結(jié)合的抗體是本發(fā)明組合物和方法所用的優(yōu)選抗-CD3抗體。
本發(fā)明另一方面提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，所述物質(zhì)選自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、TGF-β、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗體、抗-CD4抗體、抗-CD8抗體、抗-CD44抗體、抗-CD45RA抗體、抗-CD45RB抗體、抗-CD45RO抗體、抗-Thy1.2抗體、抗淋巴細(xì)胞球蛋白、抗-αβTCR抗體、抗-γδTCR抗體、抗-CD49a抗體、抗-CD49b抗體、抗-CD49c抗體、抗-CD49d抗體、抗-CD49e抗體、抗-CD49f抗體、抗-TCR Vβ8抗體、抗-CD16抗體、抗-CD28抗體、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗體、抗-CD40L抗體、抗-ICAM-1抗體、ICAM-1、抗-Mac抗體、抗-LFA-1抗體、抗-IFN-γ抗體、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合體、抗-IL-2R抗體、IL-2R抗體、IL-2白喉(Diptheria)-毒素蛋白、抗-IL-12抗體、IL-12拮抗劑(p40)、抗-IL-1抗體、IL-1拮抗劑、谷氨酸脫羧酶(GAD)、抗-GAD抗體、病毒蛋白和肽、細(xì)菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神經(jīng)酰胺、降鈣素、煙酰胺、抗-氧化劑(維生素E、丙丁酚類似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性藥物(己酮可可堿或咯利普蘭)、免疫調(diào)節(jié)劑(羅喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍亂毒素B、釩酸鹽或維生素D3類似物、小分子CD80抑制劑、雄激素、IGF-1、免疫操控物(Immunomanipulation)(天然抗體)、狼瘡獨(dú)特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制劑、硅石、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗無唾液酸GM-1抗體、透明質(zhì)酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I類MHC抗體、或抗-II類MHC抗體、環(huán)孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脫氧精胍菌素、或上述任何物質(zhì)的功能性變體或片段“抗-T細(xì)胞”抗體本發(fā)明的一組優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是能與只由T細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞呈遞的表位結(jié)合的抗體或其功能性片段或變體/類似物。以下是能特異性靶向這些細(xì)胞的抗體抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD8抗體、抗-αβTCR抗體、抗-CD49a抗體、抗-CD49b抗體、抗-CD49c抗體、抗-CD49d抗體、抗-CD49e抗體、抗-CD49f抗體、抗-γδTCR抗體、抗-TCR Vβ8抗體和抗-CD28抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道大多數(shù)以上抗體所靶向的T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞特定亞組。只有抗-CD3抗體靶向所有的NK細(xì)胞和T細(xì)胞。
與可溶性TCR相連而形成本發(fā)明雙功能組合物的這種抗體可導(dǎo)致T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞定位于表達(dá)可溶性TCR同源肽-MHC配體的細(xì)胞。不想受理論的束縛，這些抗體與T細(xì)胞或NK細(xì)胞結(jié)合可激活這些細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，所述治療性物質(zhì)選自IL-10、IL-4或IL-3或它們的功能性變體或片段。
本發(fā)明一方面提供組織特異性的dTCR或scTCR。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述dTCR或scTCR對(duì)在自身免疫疾病、器官排異或移植物抗宿主病(GVHD)中作為自身反應(yīng)性T細(xì)胞靶標(biāo)的組織具有特異性。在該方面的特定實(shí)施方案中，所述dTCR或scTCR是胰島細(xì)胞特異性的。T細(xì)胞克隆NY8.3(Santamaria等，J.Immunology，(1995)，154 2494-2503和Nagata等，(1995)，J Immunology，1522042-2050)和G9C8(Wong等，J Exp Med，(1996)，183 67-76)是胰島細(xì)胞特異性小鼠T細(xì)胞克隆的例子。NY8.3 T細(xì)胞克隆是小鼠H2-KdMHC呈遞的葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)衍生肽的特異性克隆，G9C8 T細(xì)胞克隆是小鼠H2-KdMHC呈遞的胰島素衍生肽的特異性克隆。
本發(fā)明另一方面提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，所述治療性物質(zhì)選自IL-15、IL-21、IL-23、PE38假單胞菌外毒素、IFN-γ或抗-CD3抗體或它們的功能性變體或片段。
在本發(fā)明的一方面，與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR是dTCR。在本發(fā)明的其它方面，與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR是scTCR。
有兩類接頭是本發(fā)明TCR與治療性物質(zhì)結(jié)合優(yōu)選的接頭。通過聚亞烷基二醇鏈與治療性物質(zhì)結(jié)合的本發(fā)明TCR是該方面的實(shí)施方案之一。肽接頭是另一類TCR接頭。關(guān)于它們?cè)谛纬蒚CR多聚體中的應(yīng)用，下文詳細(xì)討論了這兩類接頭。本文的實(shí)施例6提供了可用于連接TCR和治療性物質(zhì)的兩種肽接頭實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種肽接頭適合于連接TCRβ鏈與所需的治療性物質(zhì)。以下是可用于此目的的接頭序列的其它例子ggcggtccg-其編碼Gly-Gly-Pro接頭。
cccggg-其編碼包含Xma1限制性酶切位點(diǎn)的Pro-Gly接頭。
如上所述，本文所述TCR治療性物質(zhì)組合中的TCR部分是靶向部分。本發(fā)明TCR能靶向TCR配體，例如肽-MHC或CD1-抗原復(fù)合物。例如，如果與該配體的特異性天然TCR相比，這些TCR對(duì)該TCR配體的親和力較高和/或解離速率較慢是理想的。待批申請(qǐng)WO 2004/044004的發(fā)明人詳述了與該配體的特異性天然TCR相比，對(duì)該TCR配體的親和力較高和/或解離速率較慢的TCR的制備方法。此TCR對(duì)TCR配體的親和力(KD)最好高于1μM和/或解離速率(kOFF)最好低于1×10-3S-1。更優(yōu)選該TCR對(duì)TCR配體的親和力(KD)高于10nM和/或解離速率(kOFF)低于1×10-4S-1。最優(yōu)選該TCR對(duì)TCR配體的親和力(KD)高于1nM和/或解離速率(kOFF)低于1×10-5S-1。
可采用任何已知的方法檢測(cè)親和力(KD)和/或解離速率(koff)。優(yōu)選方法是實(shí)施例3所述的表面等離振子共振(Biacore)方法。
就廣義而言，本發(fā)明TCR可以如WO 04/033685和WO 03/020763所述為單鏈TCR(scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。
合適的scTCR形式包含由對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，由對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，所述氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端融合；和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。
或者，第一區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成，第二區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成，所述氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端融合。
更具體地說，第一區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成，此氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端融合；第二區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成，此氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端融合；和在第一和第二鏈之間可以存在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物的二硫鍵。
在以上scTCR形式中，接頭序列可連接第一區(qū)段C末端和第二區(qū)段N末端，其序列如式-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQ ID NO1)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQ IDNO2)所示，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
本發(fā)明TCR的合適dTCR形式含有第一多肽和第二多肽，其中第一多肽中對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端融合；第二多肽中對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端融合；該第一和第二多肽通過在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物的二硫鍵相連。
所述第一多肽可含有與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端融合的TCRα鏈可變區(qū)序列，而第二多肽的序列對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列并與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端融合，該第一和第二多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57的半胱氨酸殘基或其非人等價(jià)物之間的二硫鍵相連。(“TRAC”等術(shù)語在本文根據(jù)《T細(xì)胞受體手冊(cè)》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN 0-12-441352-8命名)。
本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可含有對(duì)應(yīng)于人αβTCR胞外恒定區(qū)和可變區(qū)序列的氨基酸序列，和可連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基且在天然TCR中沒有等價(jià)物的二硫鍵。此二硫鍵位于與天然TCR中相對(duì)應(yīng)的其β碳原子相距小于0.6nm的氨基酸殘基的半胱氨酸殘基之間，例如在取代TRAC*01外顯子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57的半胱氨酸殘基或其非人等價(jià)物之間。對(duì)于TCRα鏈，可引入半胱氨酸形成二硫鍵的其它位點(diǎn)是TRAC*01外顯子1中的以下殘基，對(duì)于TCRβ鏈，是TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1中的以下殘基
除了以上提及的非天然二硫鍵外，本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可在對(duì)應(yīng)于天然TCR中通過二硫鍵連接的那些殘基的殘基之間含有二硫鍵。
本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式的序列最好不含對(duì)應(yīng)于天然TCR的跨膜或細(xì)胞質(zhì)序列。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其中所述治療性物質(zhì)是PE38外毒素。
PE38外毒素是假單胞菌外毒素的截短形式。該天然多肽是由結(jié)構(gòu)域IA、II、IB和III構(gòu)成的66kDa蛋白質(zhì)。PE38衍生物由結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域IB的氨基酸380-399和結(jié)構(gòu)域III構(gòu)成。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明可利用假單胞菌外毒素的其它截短形式(例如PE40)。本發(fā)明所用PE38的優(yōu)選變體在其結(jié)構(gòu)域III中含有突變，因而C-末端氨基酸是KDEL。以前(研究)顯示這些C-末端突變提高了假單胞菌外毒素的毒性。(Kreitman等，(1995)，J Biochem，307 29-37)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與PE38外毒素結(jié)合的所述TCR含有(SEQ ID NO73)和(SEQ ID NO71)所示氨基酸序列。(分別見圖29b和28b)PEG化的TCR單體在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR還與至少一條聚亞烷基二醇鏈結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多方法可引起這種結(jié)合。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該聚亞烷基二醇鏈與TCR共價(jià)相連。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明該方面的聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個(gè)聚乙烯重復(fù)單位。
多價(jià)TCR復(fù)合物本發(fā)明一方面提供含有與治療性物質(zhì)結(jié)合的至少兩個(gè)TCR的多價(jià)TCR復(fù)合物。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)TCR分子經(jīng)接頭部分相連形成多價(jià)復(fù)合物。這種多價(jià)TCR復(fù)合物可經(jīng)非肽聚合物鏈或肽接頭序列相連。該復(fù)合物最好是水溶性的，因而應(yīng)照此選擇接頭部分。此外，接頭部分最好能與TCR分子上所明確的位置相連，從而盡可能降低所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)多樣性。該方面的一個(gè)實(shí)施方案所提供的本發(fā)明TCR復(fù)合物中聚合物鏈或肽接頭序列在不位于TCR可變區(qū)序列中的各TCR氨基酸殘基之間延伸。
由于本發(fā)明復(fù)合物可用于醫(yī)療，接頭部分應(yīng)考慮它們的藥學(xué)適用性，例如它們的免疫原性來選擇。
在諸如抗體片段連接領(lǐng)域已知符合以上理想標(biāo)準(zhǔn)的接頭部分的例子。
兩類接頭優(yōu)選用于產(chǎn)生本發(fā)明的多價(jià)TCR分子。其中TCR通過聚亞烷基二醇鏈相連的本發(fā)明TCR復(fù)合物提供了該方面的一個(gè)實(shí)施方案。
第一類是親水性聚合物，例如聚亞烷基二醇。該類聚合物中最常用的是結(jié)構(gòu)如下式所示的聚乙二醇或PEG。
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而，其它聚合物依據(jù)其它合適的、任選取代的聚亞烷基二醇，包括聚丙二醇及乙二醇和丙二醇的共聚物。
這種聚合物可用于處理或偶聯(lián)治療性物質(zhì)，特別是多肽或蛋白質(zhì)治療劑來有益地改變?cè)撝委焺┑腜K分布狀況。據(jù)信，PEG分子能在該治療劑周圍形成“外殼”而在空間上阻礙治療劑與免疫系統(tǒng)反應(yīng)并減少其蛋白酶降解從而改善了PEG-治療劑偶聯(lián)物的PK分布狀況。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用親水性聚合物的大小可根據(jù)TCR復(fù)合物預(yù)期的治療應(yīng)用具體選擇。因此，例如當(dāng)需要該產(chǎn)品離開循環(huán)(系統(tǒng))透過組織時(shí)，如用于治療腫瘤時(shí)，宜利用5KDa量級(jí)的低分子量聚合物。已有許多綜述文章和書籍詳細(xì)描述了PEG和類似分子在藥物制劑中的應(yīng)用。例如，Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇的化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用ACS手冊(cè)》(Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACSBooks)，Washington，D.C.。
所用的聚合物可具有線形或分支構(gòu)型。可通過加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和賴氨酸來誘生分支PEG分子或其衍生物。
該聚合物一般在其結(jié)構(gòu)中，例如在其一端或兩端，和/或在骨架支鏈處含有化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)從而能使該聚合物與TCR中的靶位點(diǎn)相連。如下所示，這種化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)可與親水性聚合物直接相連，或者如下所示在親水性聚合物和反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))之間可有一間隔基團(tuán)/部分反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))-親水性聚合物-反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))-間隔基團(tuán)-親水性聚合物-間隔基團(tuán)-反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))用于形成上述類型構(gòu)建物的間隔基團(tuán)可以是無反應(yīng)活性的、化學(xué)穩(wěn)定的、鏈狀的任何有機(jī)部分。這種間隔基團(tuán)包括但不限于以下基團(tuán)-(CH2)n-，其中n＝2到5-(CH2)3NHCO(CH2)2本發(fā)明多價(jià)TCR復(fù)合物中二價(jià)亞烷基間隔基團(tuán)位于聚亞烷基二醇鏈和其與連接了治療性物質(zhì)的TCR連接點(diǎn)之間，提供了該方面的另一實(shí)施方案。
本發(fā)明多價(jià)TCR復(fù)合物中聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個(gè)聚乙二醇重復(fù)單位，提供了該方面的另一實(shí)施方案。
可利用各種偶聯(lián)化學(xué)(試劑)將聚合物分子偶聯(lián)于蛋白質(zhì)和肽治療劑。選擇最合適的偶聯(lián)化學(xué)(試劑)主要取決于所需的偶聯(lián)位點(diǎn)。例如，以下偶聯(lián)化學(xué)(試劑)(來源Nektar分子工程目錄2003(Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003))已用于連接PEG分子的一個(gè)或多個(gè)末端N-馬來酰亞胺、乙烯砜、苯并三唑碳酸酯、琥珀酰亞胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)、琥珀酰亞胺丁酸酯、硫代酸酯、乙醛、丙烯酸酯、生物素和伯胺。
如上所述，非PEG聚合物也可為本發(fā)明TCR的多聚化提供合適接頭。例如，可以利用含有通過脂肪鏈相連的馬來酰亞胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，產(chǎn)品號(hào)22330和22323)。
肽接頭是另一類TCR接頭。這些接頭由氨基酸鏈組成，其作用是在TCR分子上產(chǎn)生用于連接的簡單接頭或多聚化結(jié)構(gòu)域。以前曾用生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)產(chǎn)生用于體外結(jié)合研究的TCR四聚體(參見WO/99/60119)。然而，鏈霉親和素是微生物來源的多肽，因此用于治療劑中不理想。
本發(fā)明TCR復(fù)合物中TCR通過衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭相連提供了該方面的另一實(shí)施方案。有許多含多聚化結(jié)構(gòu)域的人蛋白可用于產(chǎn)生多價(jià)TCR復(fù)合物。例如，與單體scFV片段相比，利用p53四聚化結(jié)構(gòu)域所產(chǎn)生的scFv抗體片段四聚體已顯示其血清持久存留時(shí)間增加和解離速率顯著降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白也具有可能用于該類應(yīng)用的四聚化結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可與能將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的酶相連。這使得藥物前體只在需要的部位轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬?即，通過sTCR靶向)。
治療性應(yīng)用本發(fā)明也提供將治療性物質(zhì)遞送至靶細(xì)胞的方法，該方法包括在允許潛在的靶細(xì)胞與本發(fā)明TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物結(jié)合的條件下使二者接觸，所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物是給定的肽-MHC復(fù)合物特異性的。
具體地說，可利用本發(fā)明的可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物將治療性物質(zhì)遞送至能呈遞具體抗原的細(xì)胞所在部位。這可用于許多情況，例如抵御腫瘤或自身免疫疾病時(shí)。治療性物質(zhì)的遞送應(yīng)可在局部施加其作用而非只對(duì)與其結(jié)合的細(xì)胞起作用。
因此，一種具體方案設(shè)想將免疫刺激分子與腫瘤抗原特異性的本發(fā)明TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物相連。對(duì)于癌癥治療，定位于腫瘤或轉(zhuǎn)移(腫瘤)的鄰近可提高毒素或免疫刺激劑的效果。或者，可利用本發(fā)明的可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物將免疫抑制劑遞送至能呈遞自身免疫疾病相關(guān)特定抗原的細(xì)胞所在部位。例如，可利用胰島細(xì)胞特異性TCR將免疫抑制劑(如IL-10、IL-4或IL-13或它們的功能性變體或片段)遞送至糖尿病患者的胰島細(xì)胞。
對(duì)于疫苗遞送，可將疫苗抗原定位于抗原呈遞細(xì)胞附近，從而可提高抗原的效力。
預(yù)計(jì)給予患者干擾素(IFN)，例如IFN-γ，然后和/或同時(shí)給予和治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR可提高靶細(xì)胞上肽-MHC的表達(dá)水平。這對(duì)于治療癌癥特別有益。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供含有與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或其多價(jià)TCR復(fù)合物及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明也提供一種治療癌癥的方法，包括給予患這種癌癥的對(duì)象有效量的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或其多價(jià)TCR復(fù)合物。在一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或其多價(jià)TCR復(fù)合物在制備治療癌癥的組合物中的應(yīng)用。IL-15、IL-21或抗-CD3抗體或它們的功能性變體或片段是用于治療癌癥的特別優(yōu)選的治療劑。
本發(fā)明也提供一種治療自身免疫疾病、器官排異或GVHD的方法，包括給予患這種自身免疫疾病、器官排異或GVHD的對(duì)象有效量的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或其多價(jià)TCR復(fù)合物。在一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或其多價(jià)TCR復(fù)合物在制備治療自身免疫疾病、器官排異或GVHD的組合物中的應(yīng)用。IL-10、IL-4或IL-13或它們的功能性變體或片段是用于治療自身免疫疾病、器官排異或GVHD的特別優(yōu)選的治療劑。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的dTCR或scTCR是組織特異性的。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述dTCR或scTCR是自身免疫疾病、器官排異或移植物抗宿主病(GVHD)中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的靶位組織特異性的。在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療糖尿病的方法，其中所述dTCR或scTCR是胰島細(xì)胞特異性的。
可從本發(fā)明方法獲益的癌癥包括白血病、頭、頸(癌)、肺(癌)、乳腺(癌)、結(jié)腸(癌)、子宮頸(癌)、肝(癌)、胰腺(癌)、卵巢(癌)和睪丸(癌)。
可從本發(fā)明方法獲益的自身免疫疾病包括以下急性播散性腦脊髓炎、腎上腺機(jī)能不全、過敏性脈管炎和肉芽腫(Allergic angiitis and granulomatosis)、淀粉樣變性病(Amylodosis)、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性脫發(fā)、自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、自身免疫性溶血性貧血(Autoimmune haemolytic anaemia)、自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少(Autoimmune Neutrogena)、自身免疫性血小板減少性紫癜、貝塞病、小腦變性、慢性活動(dòng)性肝炎、慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)根神經(jīng)疾病(Chronic inflammatory demyelinatingpolyradiculoneuropathy)、具有單克隆γ-球蛋白病的慢性神經(jīng)病、經(jīng)典的結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、先天性腎上腺增生、寒冷病(Cryopathies)、皰疹樣皮炎、糖尿病、伊-朗綜合征、腦脊髓炎、后天性大皰性表皮松解、結(jié)節(jié)性紅斑、谷蛋白敏感性腸病、
古德帕斯徹綜合征、格-巴綜合征、橋本甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、特發(fā)性血色素沉著、特發(fā)性膜性腎小球腎炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分離性血管炎、川崎病、輕微變化腎病、混雜型血管炎(Miscellaneous vasculitides)、混合型結(jié)締組織病、具有傳導(dǎo)阻滯的多病灶運(yùn)動(dòng)原神經(jīng)病(Multifocal motor neuropathy withconduction block)、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、斜視眼陣攣-肌陣攣綜合征(Opsoclonus-myoclonus syndrome)、類天皰瘡(Pemphigoid)、天皰瘡(Pemphigus)、惡性貧血、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、感染后關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性膽管硬化、銀屑病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、萊特病、視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬化性膽管炎、斯耶格倫綜合征、
僵體綜合征、亞急性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身形壞死性血管炎、全身性硬化癥(硬皮病)、高安動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、血栓閉塞性脈管炎、I型和II型自身免疫性多腺體綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、眼色素層炎、韋格納肉芽腫病本發(fā)明的治療性組合物通常可作為包含藥學(xué)上可接受的載體的滅菌藥物組合物的一部分提供。該藥物組合物可采取任何合適的形式(取決于將其給予患者所需方法)。該藥物組合物可以單位劑型提供，通常裝在密封的容器中，可作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒中通常(雖然不是必需的)裝有使用說明書。該試劑盒可裝有多個(gè)所述單位劑型。
該藥物組合物可采用任何合適的途徑給予，例如胃腸外、透皮或吸入，優(yōu)選胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)，或最優(yōu)選靜脈內(nèi))途徑。可通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法，例如在無菌條件下混合活性成分與運(yùn)載體或賦形劑來制備這種組合物。
取決于所治療的疾病或病癥、所治療個(gè)體的年齡和身體狀況等，本發(fā)明物質(zhì)的劑量范圍很廣，醫(yī)師可最終確定所用的合適劑量。
其它方面與治療性物質(zhì)結(jié)合的scTCR或dTCR(其中TCR優(yōu)選由對(duì)應(yīng)于人序列的恒定區(qū)或可變區(qū)序列構(gòu)成)可以基本純形式、或作為純化或分離的制劑提供。例如，可以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。
本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征與已作了必要修正的其它各方面一樣。本文提及的現(xiàn)有技術(shù)文件按照法律所允許的最大程度納入本文。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
參考以下附圖

圖1a和1b分別顯示了可溶性A6 TCR的α和β鏈的核酸序列，所述核酸序列經(jīng)突變而引入了一個(gè)半胱氨酸密碼子。陰影表示引入的半胱氨酸密碼子；圖2a顯示了A6 TCRα鏈的胞外氨基酸序列，其包含用于產(chǎn)生新型鏈間二硫鍵的T48→C突變(下劃線)；圖2b顯示了A6 TCRβ鏈的胞外氨基酸序列，其包含用于產(chǎn)生新型鏈間二硫鍵的S57→C突變(下劃線)；圖3a顯示了A6 TCRα鏈序列，其包含突變的新型半胱氨酸殘基以摻入BamH1限制性位點(diǎn)。陰影表示為形成BamH1限制性位點(diǎn)而引入的突變；圖3b和3c顯示了經(jīng)突變含有形成非天然二硫鍵的額外半胱氨酸殘基的JM22TCRα和β鏈的DNA序列；圖4a和4b分別顯示了從圖3b和3c所示DNA序列產(chǎn)生的JM22 TCRα和β鏈胞外氨基酸序列；圖5a和5b分別顯示了可溶性AH-1.23 TCR的α和β鏈的DNA序列，該序列經(jīng)突變而引入了一個(gè)新的半胱氨酸密碼子(以陰影表示)；圖6a和6b分別顯示了從圖5b和5c所示DNA序列產(chǎn)生的AH-1.23 TCRα和β鏈胞外氨基酸序列；圖7a-成熟的人IL-10的DNA序列；圖7b-成熟的人IL-10的氨基酸序列；圖8a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Pro-Gly接頭參與形成與成熟的人IL-10相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Pro-Gly接頭的DNA序列如下劃線所示；圖8b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Pro-Gly接頭參與形成與成熟的人IL-10相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Pro-Gly接頭如下劃線所示；圖9a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-10相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭的DNA序列如下劃線所示；
圖9b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-10相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭如下劃線所示；圖10a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-10相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭的DNA序列如下劃線所示；圖10b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-10相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭如下劃線所示；圖11a-成熟的人IL-4的DNA序列；圖11b-成熟的人IL-4的氨基酸序列；圖12a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Pro-Gly接頭與參與形成成熟的人IL-4相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Pro-Gly接頭的DNA序列如下劃線所示；圖12b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Pro-Gly接頭參與形成與成熟的人IL-4相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Pro-Gly接頭如下劃線所示；圖13a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-4相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭的DNA序列如下劃線所示；圖13b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-4相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭如下劃線所示；圖14a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-4相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭的DNA序列如下劃線所示；圖14b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-4相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭如下劃線所示；圖15a-成熟的人IL-13的DNA序列；圖15b-成熟的人IL-13的氨基酸序列；圖16a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Pro-Gly接頭參與形成與成熟的人IL-13相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Pro-Gly接頭的DNA序列如下劃線所示；圖16b-含有非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Pro-Gly接頭參與形成與成熟的人IL-13相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Pro-Gly接頭如下劃線所示；圖17a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-13相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭的DNA序列如下劃線所示；圖17b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-13相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭如下劃線所示；圖18a-含有一個(gè)非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ鏈的DNA序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-13相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。編碼Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭的DNA序列如下劃線所示；
圖18b-含有一個(gè)非天然半胱氨酸密碼子的AH1.23 TCRβ鏈的氨基酸序列，該半胱氨酸經(jīng)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭參與形成與成熟的人IL-13相連的新型鏈間鍵。引入的半胱氨酸以陰影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接頭如下劃線所示；圖19詳述了pEX821質(zhì)粒的DNA序列；圖20提供pEX821載體的質(zhì)粒圖，其DNA序列見圖19；圖21詳述了pEX954質(zhì)粒的DNA序列；圖22提供pEX954載體的質(zhì)粒圖，其DNA序列見圖21；圖23a詳述了編碼高親和力c61 NY-ESO MTCRβ鏈的DNA序列，圖23b詳述了圖23a所示DNA序列編碼的氨基酸序列；圖24a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與IL-18相連的高親和力c61 NY-ESOMTCRβ鏈的DNA序列。圖24b詳述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示；圖25a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與高親和力c61 NY-ESO MTCRβ鏈相連的IL-18原蛋白的DNA序列。此原-IL-18 DNA經(jīng)改變而編碼了因子X的一個(gè)切割位點(diǎn)。圖25b詳述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示；圖26a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與IL-10相連的高親和力c61 NY-ESOMTCRβ鏈的DNA序列。圖26b詳述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示；圖27a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與IL-13相連的高親和力c61 NY-ESOMTCRβ鏈的DNA序列。圖27b詳述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示；圖28a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與PE38外毒素的“KDEL”變體相連的高親和力c61 NY-ESO MTCRβ鏈的DNA序列。圖28b詳述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示；圖29a詳述了編碼高親和力c58 NY-ESO MTCRα鏈的DNA序列，圖29b詳述了圖29a所示DNA序列編碼的氨基酸序列。
實(shí)施例1-引物設(shè)計(jì)及A6 TAX TCRα和β鏈的誘變?yōu)閷RAC*01外顯子1的A6 Tax蘇氨酸48突變?yōu)榘腚装彼幔O(shè)計(jì)了以下引物(突變以小寫顯示)5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT(SEQ ID NO3)5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G(SEQ ID NO4)為將TRBC1*01和TRBC2*01外顯子1的A6 Tax絲氨酸57突變?yōu)榘腚装彼幔O(shè)計(jì)了以下引物(突變以小寫字母顯示)5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC(SEQ ID NO5)5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G(SEQ ID NO6)PCR誘變?nèi)缦滤荆謩e利用上述α-鏈引物和β-鏈引物突變含有A6 Tax TCRα或β鏈基因的表達(dá)質(zhì)粒。將100ng質(zhì)粒和5μl 10mM dNTP、25μl 10×Pfu-緩沖液(Stratagene)、10單位Pfu聚合酶(Stratagene)混合，用H2O將終體積調(diào)節(jié)至240μl。向48μL此混合物中加入引物稀釋至終濃度為0.2μM，最終反應(yīng)體積為50μL。經(jīng)95℃，30秒的初始變性步驟后，反應(yīng)混合物用Hybaid PCR快速PCR儀進(jìn)行變性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分鐘)，15輪。然后37℃用10單位DpnI限制性酶(New England Biolabs)消化產(chǎn)物5小時(shí)。將10μl消化的反應(yīng)(產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌中，細(xì)菌在37℃生長18小時(shí)。挑出一個(gè)菌落，在5ml TYP+氨芐青霉素(16g/l Bacto-胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/l K2HPO4、100mg/l氨芐青霉素)中生長過夜。按照生產(chǎn)商的使用說明書用Qiagen小制備柱純化質(zhì)粒DNA，自動(dòng)測(cè)序驗(yàn)證序列。圖1a和2a及圖1b和2b分別顯示了α鏈和β鏈突變的核酸序列和氨基酸序列。
實(shí)施例2-可溶性TCR表達(dá)、重折疊和純化將分別含有突變的α-鏈和β-鏈的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)菌株BL21pLysS中，37℃用TYP(氨芐西林100μg/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)氨芐西林抗性單個(gè)菌落至OD600為0.4，然后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)后3小時(shí)用BeckmanJ-6B離心機(jī)以4000rpm離心30分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸于含有50mMTris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、10mM DTT，pH 8.0的緩沖液中。凍融過夜后，在Milsonix XL2020超聲波儀中用標(biāo)準(zhǔn)的12mm直徑探頭對(duì)重懸細(xì)胞進(jìn)行1分鐘爆發(fā)性超聲波處理，共約10分鐘。用Beckman J2-21離心機(jī)以13000rpm離心30分鐘回收包涵體沉淀物。然后用洗滌劑洗滌3次除去細(xì)胞碎片和膜組分。每次將包涵體在Triton緩沖液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH 8.0)中勻漿，然后用Beckman J2-21離心機(jī)以13000rpm離心沉淀15分鐘。然后用以下緩沖液進(jìn)行類似洗滌以除去洗滌劑和鹽50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH 8.0。最后，將包涵體分為30mg等份，-70℃冷凍。用6M胍-HCl溶解并用Bradford染料結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)定量測(cè)定包涵體的蛋白產(chǎn)量。
可溶性TCR的變性從冷凍儲(chǔ)備物中融解30mg溶解的TCRβ鏈包涵體和60mg溶解的TCRα鏈包涵體。用6M胍溶液將包涵體稀釋至終濃度為5mg/ml，加入DTT(2 M儲(chǔ)備液)至終濃度為10mM。混合物在37℃培育30分鐘。
可溶性TCR的重折疊1L重折疊緩沖液在5℃±3℃劇烈攪拌。加入氧化還原對(duì)試劑(2-巰基乙胺和胱胺)至終濃度分別為6.6mM和3.7mM，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。5℃±3℃攪拌約5小時(shí)±15分鐘以重折疊此蛋白質(zhì)。
透析重折疊的可溶性TCR重折疊的TCR以Spectrapor 1膜(Spectrum；產(chǎn)品號(hào).132670)用10L 10mM Tris、pH 8.1于5℃±3℃透析18-20小時(shí)。然后將透析緩沖液更換為新鮮的10mM Tris pH 8.1(10L)，繼續(xù)在5℃±3℃透析20-22小時(shí)。
實(shí)施例3-與特異性pMHC結(jié)合的sTCR的Biacore表面等離振子共振特征鑒定用表面等離振子共振生物傳感器(BIAcore 3000TM)分析sTCR與其肽-MHC配體的結(jié)合情況。制備以半定向方式固定在鏈霉親和素包被的結(jié)合表面上的單pMHC復(fù)合物(描述于下文)有助于該項(xiàng)分析，從而有效地測(cè)試了可溶性T-細(xì)胞受體與多達(dá)4種不同pMHC(固定在不同的流動(dòng)小室上)的結(jié)合情況。手動(dòng)注入HLA復(fù)合物可以容易地操控固定的I類分子的精確水平。
這種固定的復(fù)合物能同時(shí)結(jié)合T-細(xì)胞受體和輔助受體CD8αα，可將二者注射入溶液相。即使在低濃度(至少40μg/ml)也能獲得TCR的特異性結(jié)合，暗示TCR較穩(wěn)定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，觀察到sTCR的pMHC結(jié)合特性在質(zhì)量和數(shù)量上相似。這對(duì)控制可溶性(TCR)種類的部分活性很重要，也提示生物素化pMHC復(fù)合物的生物學(xué)活性與非生物素化復(fù)合物的相同。
在體外重折疊細(xì)菌表達(dá)的含組成型亞基蛋白和合成肽的包涵體中的生物素化I類HLA-A2-肽復(fù)合物，純化后進(jìn)行體外酶(催化)生物素化(O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15)。表達(dá)的HLA-重鏈含有取代了合適構(gòu)建物中該蛋白質(zhì)的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的C-末端生物素化標(biāo)簽。包涵體表達(dá)水平約為75mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。HLA輕鏈或β2-微球蛋白也在大腸桿菌中以約500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)液的水平表達(dá)為合適構(gòu)建物的包涵體。
裂解大腸桿菌，將包涵體純化至約80％純。包涵體的蛋白質(zhì)用6M胍-HCl、50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA變性，通過在＜5℃時(shí)將變性蛋白質(zhì)以一次脈沖加入重折疊緩沖液中，以30mg/升重鏈、30mg/升β2m的濃度在0.4M L-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml肽(例如，tax11-19)中重折疊。重折疊在4℃至少進(jìn)行1小時(shí)方完成。
用10倍體積的10mM Tris pH 8.1透析更換緩沖液。為充分降低該溶液的離子強(qiáng)度，緩沖液需要更換兩次。然后將蛋白質(zhì)溶液通過1.5μm乙酸纖維素濾膜過濾，加樣于POROS 50HQ陰離子交換柱上(床體積8ml)。用0-500mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白質(zhì)。HLA-A2-肽復(fù)合物大約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)，各組分冷藏于冰上。
用以相同緩沖液預(yù)平衡的Pharmacia快速脫鹽柱將生物素化標(biāo)記的HLA復(fù)合物的緩沖液更換為10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脫后立即將含有蛋白質(zhì)的組分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化試劑1mM生物素、5mM ATP(緩沖至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15純化)。然后將混合物在室溫培育過夜。
采用凝膠過濾層析純化生物素化的HLA復(fù)合物。用已過濾的PBS預(yù)平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱，加入1ml生物素化反應(yīng)混合物，用PBS以0.5ml/分鐘洗脫。生物素化的HLA復(fù)合物作為單峰洗脫約15ml。合并含有蛋白質(zhì)的組分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，生物素化的HLA復(fù)合物分為等份試樣保存在-20℃。采用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)方法固定鏈霉親和素。
在BIAcore 3000TM表面等離振子共振(SPR)生物傳感器上分析含有新型鏈間鍵的A6 Tax sTCR與其配體/MHC復(fù)合物或不相關(guān)的HLA-肽組合(上述產(chǎn)物)之間的相互作用。SPR可檢測(cè)小流動(dòng)室中傳感器表面附近的折射指數(shù)變化，此變化以反應(yīng)單位(RU)表示，該原理可用于檢測(cè)受體配體相互作用并分析它們的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過交聯(lián)在β2m上的生物素和鏈霉親和素(二者用化學(xué)方法交聯(lián)于流動(dòng)小室的活化表面)之間的結(jié)合作用將各HLA-肽復(fù)合物固定在不同的流動(dòng)小室中來制備探針流動(dòng)小室。然后使sTCR以恒定流速流過不同流動(dòng)小室的表面，再測(cè)定這樣做時(shí)的SPR反應(yīng)來進(jìn)行該試驗(yàn)。首先使sTCR以5μl每分鐘的恒定流速流過兩個(gè)不同的表面來驗(yàn)證此相互作用的特異性；一個(gè)表面用約5000RU的特異性肽-HLA復(fù)合物包被，第二個(gè)用約5000RU的非特異性肽-HLA復(fù)合物包被。可用恒定流速和不同的濃度注入sTCR來與肽-HLA復(fù)合物相比以確定背景共振。從用特異性肽-HLA復(fù)合物獲得的數(shù)值中減去這些對(duì)照的檢測(cè)值計(jì)算出以解離常數(shù)Kd表示的結(jié)合親和力(Price和Dwek，《生物化學(xué)家的物理化學(xué)原理與問題》(Principles andProblems in Physical Chemistry for Biochemists)，(第二版)，1979，Clarendon Press，牛津)。
獲得的Kd值(1.8μM)接近不含新型二硫鍵的A6 Tax sTCR與pMHC之間相互作用所報(bào)道的值(0.91μM-Ding等，1999，Immunity，1145-56)。
實(shí)施例4-制備含有新型二硫鍵的可溶性JM22 TCR實(shí)施例1制備的可溶性A6 TCR的β鏈含有適合用作連接位點(diǎn)的天然序列BglII限制性位點(diǎn)(AAGCTT)。
如下所詳述，進(jìn)行PCR誘變將BamH1限制性位點(diǎn)(GGATCC)引入可溶性A6TCR的α鏈新型半胱氨酸密碼子的5’處。實(shí)施例1所述序列用作此誘變的模板。使用以下引物BamHI5’-ATATCCAGAACCCgGAtCCTGCCGTGTA-3’(SEQ ID NO7)5’-TACACGGCAGGAaTCcGGGTTCTGGATAT-3’(SEQ ID NO8)將100ng質(zhì)粒和5μl 10mM dNTP、25μl 10×Pfu-緩沖液(Stratagene)、10單位Pfu聚合酶(Stratagene)混合，用H2O將終體積調(diào)節(jié)至240μl。向48μL此混合物中加入引物稀釋至終濃度為0.2μM，最終反應(yīng)體積為50μL。經(jīng)95℃，30秒的初始變性步驟后，反應(yīng)混合物用Hybaid PCR快速PCR儀進(jìn)行的變性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分鐘)，共15輪。然后在37℃用10單位DpnI限制性酶(New England Biolabs)消化產(chǎn)物5小時(shí)。將10μl消化反應(yīng)(產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌中，細(xì)菌在37℃生長18小時(shí)。挑出一個(gè)菌落，在5ml TYP+氨芐青霉素(16g/l Bacto-胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/lK2HPO4、100mg/l氨芐青霉素)中生長過夜。按照生產(chǎn)商的使用說明書用Qiagen小制備柱純化質(zhì)粒DNA，自動(dòng)測(cè)序驗(yàn)證此序列。引入α鏈的突變是“沉默”突變，因而此鏈的氨基酸序列與圖2a詳述的相比無變化。圖3a顯示了該突變的α鏈的DNA序列。
為產(chǎn)生摻入了新型二硫鍵的可溶性JM22 TCR，將含有α鏈BamH1和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的A6 TCR質(zhì)粒用作模板。使用了以下引物|NdeI|5’-GGAGATATACATATGCAACTACTAGAACAA-3’(SEQ ID NO9)5’-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3’(SEQ ID NO10)|BamHI||Nde1|5’-GGAGATATACATATGGTGGATGGTGGAATC-3’(SEQ ID NO11)5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’(SEQ ID NO12)|BglII|如下所示，通過PCR克隆獲得JM22 TCRα和β-鏈構(gòu)建物。利用上述引物和含有JM22 TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用相關(guān)的限制性酶限制性消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，將其克隆入pGMT7獲得表達(dá)質(zhì)粒。自動(dòng)DNA測(cè)序驗(yàn)證該質(zhì)粒插入物的序列。圖3b和3c分別顯示了JM22 TCR的突變?chǔ)梁挺骆湹腄NA序列，圖4a和4b顯示了得到的氨基酸序列。
如實(shí)施例1和2所述表達(dá)、共同折疊和純化各TCR鏈。
如實(shí)施例3所述進(jìn)行JM22 TCR與pMHC結(jié)合的Biacore分析。HLA-flu復(fù)合物的這種二硫鍵連接的TCR經(jīng)測(cè)定其Kd為7.9±0.51μM。
實(shí)施例5-制備含有新型鏈間二硫鍵的可溶性AH-1.23 TCR按照已知的技術(shù)從Hill Gaston(Medical School，Addenbrooke’s Hospital，劍橋)提供的T細(xì)胞分離得到編碼AH-1.23 TCR的cDNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶處理該HiRNA得到編碼NY-ESO TCR的cDNA。
如實(shí)施例4所述，為產(chǎn)生摻入了新型二硫鍵的可溶性AH-1.23 TCR，將含有α鏈BamHI和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的TCR質(zhì)粒用作框架。使用了以下引物|NdeI|5’-GGGAAGCTTACATATGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGG-3’(SEQ IDNO13)5’-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3’(SEQ ID NO14)|BamHI||NdeI|5’-TTGGAATTCACATATGGGCGTCATGCAGAACCCAAGACAC-3(SEQ IDNO15)5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’(SEQ ID NO16)|BglII|如下所示，進(jìn)行PCR克隆獲得AH-1.23 TCRα和β-鏈構(gòu)建物。利用上述引物和含有AH-1.23 TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用相關(guān)的限制性酶限制性消化PCR產(chǎn)物，將其克隆入pGMT7獲得表達(dá)質(zhì)粒。通過自動(dòng)DNA測(cè)序驗(yàn)證該質(zhì)粒插入物的序列。圖5a和5b分別顯示了AH1.23 TCR的突變?chǔ)梁挺骆湹腄NA序列，圖6a和6b顯示了得到的氨基酸序列。
如實(shí)施例2所述表達(dá)、共同折疊和純化各TCR鏈。
實(shí)施例6-制備可溶性AH-1.23 TCR-IL-10融合蛋白然后可制備包含圖7a所詳述的成熟人IL-10 DNA序列和位于IL-10 DNA序列5’端的許多DNA延伸段之-的合成基因。此5’端DNA延伸段是用于連接IL-10DNA與編碼AH1.23 TCRβ鏈的接頭序列。
接頭序列cccggg-其編碼含有Xma1限制性酶切位點(diǎn)的Pro-Gly接頭ggatccggcggtccg-(SEQ ID NO17)其編碼含有BamHI限制性酶切位點(diǎn)的Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO18)接頭。
ggatccggtgggggcggaagtggaggcagcggtggatccggcggtccg-(SEQ ID NO19)其編碼含有兩個(gè)BamH1限制性酶切位點(diǎn)的Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)接頭。
然后將上述合成基因之一亞克隆入如實(shí)施例5所述制備的含AH1.23 TCRβ鏈的pGMT7質(zhì)粒中，從而形成編碼TCRβ鏈-接頭-IL-10融合蛋白的DNA序列。
圖8a和8b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Pro-Gly-IL-10融合體的DNA序列和氨基酸序列。
圖9a和9b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO18)-IL-10融合體的DNA序列和氨基酸序列。
圖10a和10b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)-IL-10融合體的DNA序列和氨基酸序列。
然后采用實(shí)施例2詳述的方法使這些AH1.23 TCRβ鏈-接頭-IL-10融合蛋白與AH1.23 TCRα鏈重折疊從而產(chǎn)生完整的可溶性AH1.23 TCR-IL-10融合蛋白。
以上詳述的方法描述了制備TCRβ鏈的C-末端連接有IL-10單體的可溶性αβTCR。常見的IL-10是同源二聚體形式。因此，使與可溶性AH1.23 TCR相連的IL-10多肽二聚化可能有益。這可用許多方法實(shí)現(xiàn)。例如，可將單鏈形式的成熟人IL-10同源二聚體與TCRβ融合，然后與TCRα鏈一起重折疊。或者，可在溶液中將成熟形式的人IL-10加入按照上述形成的TCRβ鏈-IL-10融合蛋白，然后與可溶性TCRα鏈一起重折疊，或者加入重折疊的αβTCR-IL-10融合蛋白。或者，可采用本實(shí)施例所述方法將其它IL-10分子加入TCRα鏈形成融合蛋白來產(chǎn)生TCRβ鏈-IL-10融合蛋白。然后可采用實(shí)施例2所述方法使兩種TCR鏈-IL-10融合蛋白一起重折疊。最后，可通過IL-10多肽的同源二聚化形成含有兩個(gè)TCR(各含一個(gè)與TCRβ鏈相連的IL-10多肽)的復(fù)合物。這將導(dǎo)致以下類型的復(fù)合物
αβTCR-IL-10同源二聚體-αβTCR。
實(shí)施例7-制備可溶性AH-1.23 TCR-IL-4和AH-1.23 TCR-IL-13融合蛋白也可采用實(shí)施例6所述方法制備含有與其它多肽相連的可溶性AH-1.23 TCR的融合蛋白。
可構(gòu)建包含圖11a所詳述的成熟人IL-4 DNA序列和實(shí)施例6所列舉的5’端DNA延伸序列之一的合成基因，將其亞克隆入如實(shí)施例5所述制備的含AH1.23TCRβ鏈的pGMT7質(zhì)粒中，從而形成編碼TCRβ鏈-接頭-IL-4融合蛋白的DNA序列。
圖12a和12b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Pro-Gly-IL-4融合體的DNA序列和氨基酸序列。
圖13a和13b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-(SEQ ID NO18)-IL-4融合體的DNA序列和氨基酸序列。
圖14a和14b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)-IL-4融合體的DNA序列和氨基酸序列。
可構(gòu)建包含圖15a所詳述的成熟人IL-13 DNA序列和實(shí)施例6所列舉的5’端DNA延伸序列之一的合成基因，將其亞克隆入如實(shí)施例5所述制備的含AH1.23TCRβ鏈的pGMT7質(zhì)粒中，從而形成編碼TCRβ鏈-接頭-IL-4融合蛋白的DNA序列。
圖16a和16b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Pro-Gly-IL-13融合體的DNA序列和氨基酸序列。
圖17a和17b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-(SEQ ID NO18)-IL-13融合體的DNA序列和氨基酸序列。
圖18a和18b分別詳述了AH1.23 TCRβ鏈-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)-IL-13融合體的DNA序列和氨基酸序列。
然后采用實(shí)施例2詳述的方法使這些AH1.23 TCRβ鏈-接頭-干擾素融合蛋白與AH1.23 TCRα鏈重折疊從而產(chǎn)生完整的可溶性AH1.23 TCR-干擾素融合蛋白。
實(shí)施例10-評(píng)估AH1.23 TCR-IL-10融合蛋白導(dǎo)致肥大細(xì)胞增殖能力的胸苷摻入試驗(yàn)在IL-4存在下將對(duì)人IL-10起反應(yīng)能增殖的5×106個(gè)D36小鼠肥大細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中。如實(shí)施例9所述制備一系列AH1.23TCR-IL-10融合蛋白(0、0.01、0.1、0.5和1μM)，將IL-4加入上述培養(yǎng)基。(Schlaak等，(1994)，J Immunological Methods，168 49-54)然后，在96孔板的1×105個(gè)上述培養(yǎng)細(xì)胞中加入1.85MBq/ml的H3胸苷。37℃，5％CO2下再培育這些培養(yǎng)物8小時(shí)。利用細(xì)胞收獲機(jī)(cell-harvester)收集細(xì)胞，利用Top Countβ計(jì)數(shù)器檢測(cè)摻入細(xì)胞的胸苷水平。
與不存在融合蛋白時(shí)所見相比，AH1.23 TCR-IL-10融合蛋白存在時(shí)摻入D36細(xì)胞的胸苷減少，表明該融合蛋白的IL-10部分有活性，能導(dǎo)致D36肥大細(xì)胞增殖。
實(shí)施例11-制備高親和力NY-ESO MTCR-治療性物質(zhì)融合蛋白合成含有圖23a詳述的編碼可溶性高親和力c61 NY-ESO TCRβ鏈的DNA序列的合成基因，其經(jīng)編碼肽接頭的DNA序列與編碼許多免疫調(diào)節(jié)劑的DNA相連。
有許多公司提供合適的DNA服務(wù)，例如Geneart(德國)。
圖24a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與IL-18相連的高親和力c61 NY-ESOMTCRβ鏈的DNA序列。圖24b詳述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示。
圖25a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與高親和力c61 NY-ESO MTCRβ鏈相連的IL-18原蛋白的DNA序列。原-IL-18 DNA序列經(jīng)改變以編碼有助于翻譯后除去該原序列內(nèi)一些氨基酸的因子X切割位點(diǎn)。圖25b詳述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示。
圖26a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與IL-10相連的高親和力c61 NY-ESOMTCRβ鏈的DNA序列。圖26b詳述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示。
圖27a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與IL-13相連的高親和力c61 NY-ESOMTCRβ鏈的DNA序列。圖27b詳述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示。
圖28a詳述了編碼C末端經(jīng)肽接頭與PE38外毒素的“KDEL”變體相連的高親和力c61 NY-ESO MTCRβ鏈的DNA序列。圖28b詳述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接頭如下劃線所示。
可將以上c61 NY-ESO TCRβ鏈的DNA序列連接入pEX821載體。(此載體的DNA序列和質(zhì)粒圖分別見圖19和20)然后基本上按照實(shí)施例2所述的方法制備二硫鍵連接的αβTCR-治療性物質(zhì)。簡言之，合成圖29a詳述的編碼高親和力c61 NY-ESO MTCRα鏈的DNA序列，將其連接入pEX954載體。(此載體的DNA序列和質(zhì)粒圖分別見圖21和22)然后在c61 NY-ESO TCRα鏈存在下重折疊上述TCRβ鏈融合蛋白。
圖29a詳述了編碼高親和力c58 NY-ESO MTCRα鏈的DNA序列，圖29b詳述了圖29a所示DNA序列編碼的氨基酸序列。
實(shí)施例12-MTCR-PE-38融合蛋白的細(xì)胞毒性試驗(yàn)將1×10-6個(gè)所需靶細(xì)胞(例如SK-MEL腫瘤細(xì)胞或J82 cells)懸浮在10mlRPMI培養(yǎng)基+10％胎牛血清(FCS)中。如果需要，37℃用10μM相關(guān)肽脈沖此靶細(xì)胞2小時(shí)。然后用RPMI+10％FCS洗滌樣品三次，各次洗滌間1200rpm離心5分鐘。然后重新計(jì)數(shù)洗滌的細(xì)胞并重懸于合適體積的RPMI+10％FCS培養(yǎng)基中得到2×105個(gè)細(xì)胞/ml的最終細(xì)胞密度。
用RPMI培養(yǎng)基+10％FCS將如實(shí)施例11所述制備的MTCR-PE38融合蛋白稀釋至2×10-6M終濃度得到工作標(biāo)準(zhǔn)品。然后利用此工作標(biāo)準(zhǔn)品制備一系列連續(xù)稀釋液。
在微滴定板孔中制備實(shí)驗(yàn)和對(duì)照樣品在實(shí)驗(yàn)樣品孔中注入50μl培養(yǎng)基配制的mTCR-PE38和50μl培養(yǎng)基配制的細(xì)胞。為在96孔平底白色不透明孔板(Nunc 136101)中得到100μl的總體積。利用以上制備的mTCR-PE38連續(xù)稀釋液在這些孔中提供一系列mTCR-PE38濃度。
利用100μl細(xì)胞(只有細(xì)胞的對(duì)照)或100μl mTCR-PE38和培養(yǎng)基(只有效應(yīng)細(xì)胞的對(duì)照)制備對(duì)照樣品孔。
然后在37℃，5％CO2培育實(shí)驗(yàn)和對(duì)照樣品48或96小時(shí)。然后按照生產(chǎn)商的使用說明書采用CellTiter-Glo發(fā)光試驗(yàn)(Promega目錄號(hào)G7572)評(píng)估各孔中存留的活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果圖30a和30b顯示1G4 MTCR-PE38融合蛋白可殺傷NY-ESO+SK-MEL 37和Mel 624腫瘤細(xì)胞系。
從圖30a提供的數(shù)據(jù)計(jì)算出1G4 MTCR-PE38融合蛋白分別以5.9×10-9和1×10-8M培育48小時(shí)后對(duì)SK-MEL 37和Mel 624腫瘤細(xì)胞系效力的EC50值。
從圖30b提供的數(shù)據(jù)計(jì)算出1G4 MTCR-PE38融合蛋白分別以5.7×10-9和2.1×10-8M培育96小時(shí)后對(duì)SK-MEL 37和Mel 624腫瘤細(xì)胞系效力的EC50值。
圖30a和30b提供的結(jié)果均證明與用未受脈沖的J82靶細(xì)胞觀察到的相比，用相關(guān)SLLMWITQC NY-ESO肽脈沖J82靶細(xì)胞導(dǎo)致NY-ESO TCR-PE38構(gòu)建物更有效地殺傷這些細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種與治療性物質(zhì)結(jié)合的二聚體TCR(dTCR)或單鏈TCR(scTCR)，其中所述物質(zhì)選自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD8抗體、抗-CD44抗體、抗-CD45RA抗體、抗-CD45RB抗體、抗-CD45RO抗體、抗-Thy 1.2抗體、抗淋巴細(xì)胞球蛋白、抗-αβTCR抗體、抗-γδTCR抗體、抗-CD49a抗體、抗-CD49b抗體、抗-CD49c抗體、抗-CD49d抗體、抗-CD49e抗體、抗-CD49f抗體、抗-TCR Vβ8抗體、抗-CD16抗體、抗-CD28抗體、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗體、抗-CD40L抗體、抗-ICAM-1抗體、ICAM-I、抗-Mac抗體、抗-LFA-1抗體、抗-IFN-γ抗體、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合體、抗-IL-2R抗體、IL-2R抗體、IL-2白喉-毒素蛋白、抗-IL-12抗體、IL-12拮抗劑(p40)、抗-IL-1抗體、IL-1拮抗劑、谷氨酸脫羧酶(GAD)、抗-GAD抗體、病毒蛋白和肽、細(xì)菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神經(jīng)酰胺、降鈣素、煙酰胺、抗-氧化劑(維生素E、丙丁酚類似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性藥物(己酮可可堿或咯利普蘭)、免疫調(diào)節(jié)劑(利諾胺、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍亂毒素B、釩酸鹽或維生素D3類似物、小分子CD80抑制劑、雄激素、IGF-1、免疫操控物(天然抗體)、狼瘡獨(dú)特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制劑、硅石、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗無唾液酸GM-1抗體、透明質(zhì)酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I類MHC抗體、或抗-II類MHC抗體、環(huán)孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脫氧精胍菌素、PE38假單胞菌外毒素，其中所述TCR包含由對(duì)應(yīng)于TCRα可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由對(duì)應(yīng)于TCRβ可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；該第一和第二鏈之間有一個(gè)二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物；并且，在所述scTCR還含有連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列的情況下，或反之亦然的情況下，該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置使所述第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的彼此定向基本上如天然αβT細(xì)胞受體的那樣。
2.如權(quán)利要求1所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述治療性物質(zhì)選自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、TGF-β、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗體、抗-CD4抗體、抗-CD8抗體、抗-CD44抗體、抗-CD45RA抗體、抗-CD45RB抗體、抗-CD45RO抗體、抗-Thy 1.2抗體、抗淋巴細(xì)胞球蛋白、抗-αβTCR抗體、抗-γδTCR抗體、抗-CD49a抗體、抗-CD49b抗體、抗-CD49c抗體、抗-CD49d抗體、抗-CD49e抗體、抗-CD49f抗體、抗-TCR Vβ8抗體、抗-CD16抗體、抗-CD28抗體、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗體、抗-CD40L抗體、抗-ICAM-1抗體、ICAM-1、抗-Mac抗體、抗-LFA-1抗體、抗-IFN-γ抗體、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合體、抗-IL-2R抗體、IL-2R抗體、IL-2白喉-毒素蛋白、抗-IL-12抗體、IL-12拮抗劑(p40)、抗-IL-1抗體、IL-1拮抗劑、谷氨酸脫羧酶(GAD)、抗-GAD抗體、病毒蛋白和肽、細(xì)菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神經(jīng)酰胺、降鈣素、煙酰胺、抗-氧化劑(維生素E、丙丁酚類似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性藥物(己酮可可堿或咯利普蘭)、免疫調(diào)節(jié)劑(羅喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍亂毒素B、釩酸鹽或維生素D3類似物、小分子CD80抑制劑、雄激素、IGF-1、免疫操控物(天然抗體)、狼瘡獨(dú)特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制劑、硅石、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗無唾液酸GM-1抗體、透明質(zhì)酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I類MHC抗體、或抗-II類MHC抗體、環(huán)孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脫氧精胍菌素。
3.如權(quán)利要求1所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述治療性物質(zhì)是IL-10、IL-4或IL-13之一。
4.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR是組織特異性的。
5.如權(quán)利要求4所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR對(duì)自身免疫疾病、器官排異或移植物抗宿主病(GVHD)中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的靶位組織具有組織特異性。
6.如權(quán)利要求4或5所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR是胰島細(xì)胞特異性的。
7.如權(quán)利要求1所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述治療性物質(zhì)選自IL-15、IL-21、IL-23、PE38假單胞菌外毒素、IFN-γ或抗-CD3抗體之一。
8.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR。
9.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的scTCR。
10.如權(quán)利要求9所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的scTCR，其特征在于，所述接頭序列連接所述第一區(qū)段的C末端和所述第二區(qū)段的N末端。
11.如權(quán)利要求9所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的scTCR，其特征在于，所述接頭序列如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
12.如權(quán)利要求8所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的dTCR，其特征在于，所述dTCR含有第一多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的序列N末端融合；和第二多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的序列N末端融合；該第一和第二多肽通過在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物的一個(gè)二硫鍵連接。
13.如權(quán)利要求8所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述TCR是dTCR，其含有第一多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的序列N末端融合，第二多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的序列N末端融合，該第一和第二多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57的半胱氨酸殘基或其非人等價(jià)物之間的一個(gè)二硫鍵相連。
14.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于人αβTCR的胞外恒定區(qū)和可變區(qū)序列。
15.如權(quán)利要求14所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，一個(gè)在天然TCR中沒有等價(jià)物的二硫鍵連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基。
16.如權(quán)利要求15所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于對(duì)應(yīng)于天然TCR中所含β碳原子相距小于0.6nm的氨基酸殘基的半胱氨酸殘基之間。
17.如權(quán)利要求15所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于取代TRAC*01外顯子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57的半胱氨酸殘基或其非人等價(jià)物之間。
18.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR在與天然TCR中二硫鍵所連接殘基相對(duì)應(yīng)的殘基之間含有一個(gè)二硫鍵。
19.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR不含對(duì)應(yīng)于天然TCR的跨膜或細(xì)胞質(zhì)序列的序列。
20.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述治療性物質(zhì)是PE38外毒素。
21.如權(quán)利要求20所述的與PE38外毒素結(jié)合的TCR，其特征在于，其含有(SEQ ID NO73)和(SEQ ID NO71)所示氨基酸序列。
22.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述TCR與至少一條聚亞烷基二醇鏈結(jié)合。
23.如權(quán)利要求22所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述一條或多條聚亞烷基二醇鏈與TCR共價(jià)相連。
24.如權(quán)利要求22或23所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，其特征在于，所述一條或多條聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個(gè)聚乙二醇重復(fù)單元。
25.一種多價(jià)TCR復(fù)合物，其含有至少兩個(gè)如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR。
26.一種多價(jià)TCR復(fù)合物，其含有至少兩個(gè)如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR，所述至少兩個(gè)TCR通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列相連。
27.如權(quán)利要求26所述的多價(jià)TCR復(fù)合物，其特征在于，所述聚合物鏈或肽接頭序列在與治療性物質(zhì)或其功能性變體或片段結(jié)合的各TCR的氨基酸殘基之間延伸，但不位于TCR的可變區(qū)序列中。
28.如權(quán)利要求26或27所述的多價(jià)TCR復(fù)合物，其特征在于，所述與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR通過聚亞烷基二醇鏈或衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭相連。
29.如權(quán)利要求28所述的多價(jià)TCR復(fù)合物，其特征在于，在聚亞烷基二醇鏈和其與復(fù)合物中連接了治療性物質(zhì)的TCR的連接點(diǎn)之間具有二價(jià)亞烷基間隔基團(tuán)。
30.如權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的多價(jià)TCR復(fù)合物，其特征在于，所述聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個(gè)聚乙二醇重復(fù)單元。
31.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或如權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)所述的其多價(jià)復(fù)合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
32.一種治療癌癥的方法，其包括給予患有所述癌癥的對(duì)象有效量的如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或如權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)所述的其多價(jià)復(fù)合物，其中所述治療性物質(zhì)選自權(quán)利要求2所定義的那些。
33.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或如權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)所述的其多價(jià)復(fù)合物在制備癌癥治療組合物中的用途，其中所述治療性物質(zhì)選自權(quán)利要求2所定義的那些。
34.一種治療癌癥的方法，其包括給予患有所述癌癥的對(duì)象有效量的如權(quán)利要求20或21所述的融合蛋白。
35.權(quán)利要求20或21所述的融合蛋白在制備癌癥治療組合物中的用途。
36.一種治療自身免疫疾病、器官排異或GVHD的方法，其包括給予罹患自身免疫疾病、器官排異或GVHD的對(duì)象如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR或如權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)所述的多其價(jià)復(fù)合物，其中所述治療性物質(zhì)選自權(quán)利要求3所定義的那些。
37.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的與治療性物質(zhì)結(jié)合的TCR在制備用于治療自身免疫疾病、器官排異或GVHD的組合物中的用途，其中所述治療性物質(zhì)選自權(quán)利要求3所定義的那些。
全文摘要
本發(fā)明提供與所選治療性物質(zhì)結(jié)合的二聚體TCR(dTCR)或單鏈TCR(scTCR)，其中所述TCR包含由對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，該氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端融合；該第一和第二鏈之間有一二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物；和以所述scTCR為例，還含有連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列，或反之亦然，該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應(yīng)使所述第一和第二區(qū)段可變區(qū)序列的彼此定向基本上如同天然αβT細(xì)胞受體的那樣。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101061138SQ200580039381
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月1日
發(fā)明者B·K·雅各布森, T·B·安德森 申請(qǐng)人:阿維德克斯有限公司