專利名稱：一種糜胰蛋白酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種糜胰蛋白酶(Trsnsin-Chsmotrypsin)的制備方法，特別是，公開了一種糜胰蛋白酶及其透析與親和層析相結合的制備方法。
背景技術：
糜胰蛋白酶(Trsnsin-Chsmotrypsin)是從牛、豬胰分離出來的一種蛋白水解酶。1963年我國科學家首先從豬胰中獲得了糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合晶體，命名為糜胰蛋白酶，1976年又研制成功注射用結晶糜胰蛋白酶，是我國獨創(chuàng)的酶制劑。糜胰蛋白酶具有糜蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶協(xié)同水解蛋白質肽鍵的作用。其藥理作用與從牛胰中制取的胰蛋白酶α-糜蛋白酶基本相同。比單獨使用一種酶的效果更好，適用范圍更廣，對各種炎癥、炎性水腫、粘連、潰瘍及血栓等均有較好療效。其具體作用有1、糜胰蛋白酶具有很好的抗炎消腫作用，促進局部血凝塊的溶解，使血液和體液流通流暢。2、糜胰蛋白酶能分解粘稠的粘液和粘蛋白，有助于痰液液化，易于咳出。3、糜胰蛋白酶能使細胞通透性增加，與抗癌藥及抗生素合用時可以增加藥效。在臨床上應用非常廣泛，主要用于外科的手術或外傷后的炎癥、炎性水腫、血腫、粘連、潰瘍等；胸科的膿胸、血胸、術后咳痰困難，肺不張等；內科的慢性支氣管炎、支氣管哮喘等；婦產科的宮頸炎、輸卵管炎、盆腔炎等；眼科及五官科的角膜炎、化膿性中耳炎等疾病的治療。
本發(fā)明產品采用清真宰牲場的牛胰臟為基礎原料，適合于在中東及穆斯林國家銷售及使用，為穆斯林國家及世界各國醫(yī)藥界十分需求的制品。
本發(fā)明在資料分析和發(fā)明者以往豐富的工作經驗的基礎上，廣泛的研究了各種制造胰蛋白酶和糜蛋白酶的工藝，結合透析與親和層析等新技術，現(xiàn)采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產品工藝。該工藝路線優(yōu)點是操作方便、產品活力高。糜胰蛋白酶和彈性酶、胰酶三種酶分子的三維結構很相似，而且它們的活性部位絲氨酸附近的幾個氨基酸順序也是完全一樣的。但是由于它們與底物結合的部位在結構上存在差異，從而導致它們在催化功能的專一性上有較大差異。由于這些酶分子在結構上及其他很多性質上的相似之處，使得傳統(tǒng)的一些分離、純化技術難以達到十分滿意的效果，制劑中往往混雜有彼此的組分而難以除凈。只是在采用了透析與親和層析技術以后，才大大提高了分離純化的效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供了一種糜胰蛋白酶。在工藝技術上，克服了傳統(tǒng)技術對糜胰蛋白酶和彈性酶、胰酶三者的分離、純化效果差、制劑中往往混雜有彼此的組分而難以除凈的困難。本發(fā)明通過常規(guī)原料，采用透析與親和層析相結合的方法，分離出具有較高生物活性的糜胰蛋白酶。本發(fā)明在原料選擇上，不采用豬胰等非清真原料，而是采用源于清真宰牲場的牛胰為主要原料，適應了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應藥用原料的渠道；并且采用透析與親和層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高。
——本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明公開了一種糜胰蛋白酶，蛋白酶活力≥2500U/mg，生物活性更強，對各種炎癥、炎性水腫、粘連、潰瘍及血栓等均有更好的療效。本發(fā)明在原料選擇上，不采用豬胰等非清真原料，而是采用源于清真宰牲場的牛胰為主要原料，適應了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應藥用原料的渠道；并且采用透析與親和層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高。
本發(fā)明公開的一種糜胰蛋白酶的制備方法，依次包括如下步驟1取清真宰牲場的新鮮或冷凍牛胰，去除脂肪雜物絞碎，加硫酸溶液，保溫攪拌提取，溶液放置過夜，次日用雙層紗布過濾，濾餅用等體積的冷硫酸再提取一次，合并濾液。
2在不斷攪拌下，逐漸加入工業(yè)品硫酸銨，并加入少量活性白土助濾，放置12h后過濾。濾液再加硫酸銨，放置12h后過濾，得粗制濾餅。
3將此濾餅溶于冷蒸餾水中，用分析純硫酸銨按上述步驟重復兩次，取沉淀部分，得粗制濾餅。
4將上述粗制濾餅溶于冷蒸餾水中，在低溫下用醋酸緩沖液透析，透析液過濾，清液加硫酸銨，沉淀，真空抽濾，得透析濾餅。
5濾餅溶于冷蒸餾水中，調pH，加硫酸銨，放置3～5h后，用活性碳助濾，得澄清溶液為親和層析樣品。
6將固定化卵粘蛋白裝柱，用Tris-鹽酸緩沖液平衡。上樣完畢，用Tris-鹽酸緩沖平衡液淋洗。然后用甲酸鈉-氯化鈉溶液進行洗脫，收集洗脫峰。
7在低溫下緩慢加入無水乙醇使，沉淀物真空過濾，丙酮脫水，真空干燥，得注射用結晶糜胰蛋白酶原料。
8成品取樣進行全項檢測。
本發(fā)明以清真的牛胰臟為主要原料，在深入的資料分析和發(fā)明者以往豐富工作經驗的基礎上，廣泛的研究了各種制造胰蛋白酶和糜蛋白酶的工藝，結合透析與親和層析等新技術，現(xiàn)采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析產品的工藝。該工藝路線優(yōu)點是操作方便、產品活力高。
工藝路線牛胰臟→硫酸溶液浸取→一次透析→二次透析→活性炭吸附→親和層析→乙醇醇析→無菌過濾、脫水→真空干燥→糜胰蛋白酶精品(二)工藝過程(按以下次序進行)1取清真宰牲場的新鮮或冷凍牛胰，去除脂肪雜物絞碎，加2倍體積的0.125mol/L硫酸溶液，保溫10℃以下，攪拌提取1h，溶液pH約為3.0，于5℃放置過夜，次日用雙層紗布過濾，濾餅用等體積0.125mol/L的冷硫酸再提取一次，合并濾液。
2在不斷攪拌下，逐漸加入工業(yè)品硫酸銨至0.25飽和度，并加入少量活性白土助濾，0～5℃放置12h后過濾。濾液再加硫酸銨至0.65飽和度，0～5℃放置12h后過濾，得粗制濾餅。
3將此濾餅溶于5倍體積冷蒸餾水中，用分析純硫酸銨按上述步驟重復兩次，取0.25～0.65飽和度沉淀部分，得粗制濾餅。
4將上述粗制濾餅溶于3倍冷蒸餾水中，在低溫下用0.01mol/L pH5.5的醋酸緩沖液透析，透析液過濾，清液加硫酸銨至0.65飽和度，沉淀，真空抽濾，得透析濾餅。
5濾餅溶于3倍量的冷蒸餾水中，調pH3.0～3.5，加硫酸銨至0.25飽和度，室溫放置3～5h后，用0.5％活性碳助濾，得澄清溶液為親和層析樣品。
6將固定化卵粘蛋白裝柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖液平衡。上樣液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上樣完畢，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖平衡液淋洗，直至280在0.02為止。然后用0.1mol/L甲酸鈉-0.5mol/L氯化鈉pH2.5溶液進行洗脫，流速控制在1.0cm/min，收集洗脫峰。
7在低溫下緩慢加入無水乙醇使乙醇濃度達70％，沉淀物真空過濾，丙酮脫水3次，真空干燥，得注射用結晶糜胰蛋白酶原料。
8成品取樣進行全項檢測。
本發(fā)明采用源于清真宰牲場的牛胰為主要原料，適應了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應藥用原料的渠道；并且采用透析與親和層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高，生物活性更強，對各種炎癥、炎性水腫、粘連、潰瘍及血栓等均有更好的療效。
糜胰蛋白酶是一類很有前途的生化藥物，具有糜蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶協(xié)同水解蛋白質肽鍵的作用。其藥理作用與從牛胰中制取的胰蛋白酶α-糜蛋白酶基本相同。比單獨使用一種酶的效果更好，適用范圍更廣。
實際例1.
取清真宰牲場的新鮮或冷凍牛胰160Kg，去除脂肪雜物絞碎，加378L的0.125mol/L硫酸溶液，保溫10℃以下，攪拌提取1h，溶液pH約為3.0，于5℃放置過夜，次日用雙層紗布過濾，濾餅用0.125mol/L的冷硫酸130L再提取一次，合并濾液。在不斷攪拌下，逐漸加入工業(yè)品硫酸銨至0.25飽和度，并加入少量活性白土助濾，0～5℃放置12h后過濾。濾液再加硫酸銨至0.65飽和度，0～5℃放置12h后過濾，得粗制濾餅。將此濾餅溶于8L冷蒸餾水中，用分析純硫酸銨按上述步驟重復兩次，取0.25～0.65飽和度沉淀部分，得粗制濾餅。將上述粗制濾餅溶于3.2L冷蒸餾水中，在低溫下用0.01mol/L pH5.5的醋酸緩沖液透析，透析液過濾，清液加硫酸銨至0.65飽和度，沉淀，真空抽濾，得透析濾餅。濾餅溶于2.1L的冷蒸餾水中，調pH3.0～3.5，加硫酸銨至0.25飽和度，室溫放置3～5h后，用11g活性碳助濾，得澄清溶液1950ml為親和層析樣品。將固定化卵粘蛋白裝柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖液平衡。上樣液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上樣完畢，用0.1mol/L pH7.5T的Tris-鹽酸緩沖平衡液淋洗，直至280在0.02以下為止。然后用0.1mol/L甲酸鈉0.5mol/L氯化鈉pH2.5溶液進行洗脫，流速控制在1.0cm/min，收集洗脫峰。在低溫下緩慢加入無水乙醇13.6L(乙醇濃度70％)，沉淀物真空過濾，丙酮脫水3次，真空干燥，得注射用結晶糜胰蛋白酶622g。成品取樣進行全項檢測(蛋白酶活力3050U/mg)。
實際例2.
取清真宰牲場的新鮮或冷凍牛胰140Kg，去除脂肪雜物絞碎，加333L的0.125mol/L硫酸溶液，保溫10℃以下，攪拌提取1h，溶液pH約為3.0，于5℃放置過夜，次日用雙層紗布過濾，濾餅用114L冷的0.125mol/L硫酸再提取一次，合并濾液。在不斷攪拌下，逐漸加入工業(yè)品硫酸銨至0.25飽和度，并加入少量活性白土助濾，0～5℃放置12h后過濾。濾液再加硫酸銨至0.65飽和度，0～5℃放置12h后過濾，得粗制濾餅。將此濾餅溶于7L冷蒸餾水中，用分析純硫酸銨按上述步驟重復兩次，取0.25～0.65飽和度沉淀部分，得粗制濾餅。將上述粗制濾餅溶于2.8L冷蒸餾水中，在低溫下用0.01mol/L pH5.5的醋酸緩沖液透析，透析液過濾，清液加硫酸銨至0.65飽和度，沉淀，真空抽濾，得透析濾餅。濾餅溶于1.85L的冷蒸餾水中，調pH3.0～3.5，加硫酸銨至0.25飽和度，室溫放置3～5h后，用9.4g活性碳助濾，得澄清溶液1720ml為親和層析樣品。將固定化卵粘蛋白裝柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖液平衡。上樣液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上樣完畢，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖平衡液淋洗，直至280在0.02以下為止。然后用0.1mol/L甲酸鈉-0.5mol/L氯化鈉pH2.5溶液進行洗脫，流速控制在1.0cm/min，收集洗脫峰。在低溫下緩慢加入無水乙醇12L(乙醇濃度70％)，沉淀物真空過濾，丙酮脫水3次，真空干燥，得注射用結晶糜胰蛋白酶551g。成品取樣進行全項檢測(蛋白酶活力2930U/mg)。
權利要求
1.一種糜胰蛋白酶，其特征在于其蛋白酶活力≥2500U/mg，具有糜蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶協(xié)同水解蛋白質肽鍵的作用；比單獨使用一種酶的效果更好，適用范圍更廣，生物活性更強，對各種炎癥、炎性水腫、粘連、潰瘍及血栓等均有更好的療效。
2.本發(fā)明還公開了一種糜胰蛋白酶的透析與親和層析相結合的制備方法，依次包括如下步驟1取清真宰牲場的新鮮或冷凍牛胰，去除脂肪雜物絞碎，加2倍體積的0.125mol/L硫酸溶液，保溫10℃以下，攪拌提取1h，溶液pH約為3.0，于5℃放置過夜，次日用雙層紗布過濾，濾餅用等體積0.125mol/L的冷硫酸再提取一次，合并濾液。2在不斷攪拌下，逐漸加入工業(yè)品硫酸銨至0.25飽和度，并加入少量活性白土助濾，0～5℃放置12小時后過濾。濾液再加硫酸銨至0.65飽和度，0～5℃放置12小時后過濾，得粗制濾餅。3將此濾餅溶于5倍體積冷蒸餾水中，用分析純硫酸銨按上述步驟重復兩次，取0.25～0.65飽和度沉淀部分，得粗制濾餅。4將上述粗制濾餅溶于3倍冷蒸餾水中，在低溫下用0.01mol/L pH5.5的醋酸緩沖液透析，透析液過濾，清液加硫酸銨至0.65飽和度，沉淀真空抽濾，得透析濾餅。5濾餅溶于3倍量的冷蒸餾水中，調pH3.0～3.5，加硫酸銨至0.25飽和度，室溫放置3～5h后，用0.5％活性碳助濾，得澄清溶液為親和層析樣品。6將固定化卵粘蛋白裝柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖液平衡。上樣液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上樣完畢，用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖液淋洗，直至280在0.02為止。然后用0.1mol/L甲酸鈉-0.5mol/L氯化鈉pH2.5溶液進行洗脫，流速控制在1.0cm/min，收集洗脫峰。7在低溫下緩慢加入無水乙醇使乙醇濃度達70％，沉淀物真空過濾，丙酮脫水3次，真空干燥，得注射用結晶糜胰蛋白酶原料。8成品取樣進行全項檢測。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，選用清真宰牲場的牛胰為主要原料，適應了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應藥用原料的渠道。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟23中采用工業(yè)硫酸銨和分析純硫酸銨在0.25～0.65飽和度鹽析，節(jié)省了硫酸銨的原料成本，同時又取得了較好的分離純化效果。
5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4中在低溫下用0.01mol/L、pH5.5的醋酸緩沖液透析，既能很好的保護糜胰蛋白酶的活性，又達到了理想的分離效果。
6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟6中采用固定化卵粘蛋白裝柱，能夠大大延長卵粘蛋白的使用壽命，且具有更好的吸附層析分離效果。
7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟6中用0.1mol/L pH7.5的Tris-鹽酸緩沖平衡液淋洗，能夠很好的保護產品活性，又能達到快速高效的洗脫效果。
8.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所得糜胰蛋白酶為無菌、無內毒素，酶活力≥2500U/mg，可廣泛用于醫(yī)藥、化工和生物工程等行業(yè)的酶制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種糜胰蛋白酶，蛋白酶活力≥2500U/mg，具有糜蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶協(xié)同水解蛋白質肽鍵的作用。其藥理作用與從牛胰中制取的胰蛋白酶α－糜蛋白酶基本相同。比單獨使用一種酶的效果更好，適用范圍更廣，生物活性更強，對各種炎癥、炎性水腫、粘連、潰瘍及血栓等均有更好的療效。本發(fā)明在原料選擇上，不采用豬胰等非清真原料，而是采用源于清真宰牲場的牛胰為主要原料，適應了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應藥用原料的渠道；并且采用透析與親和層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高。
文檔編號A61K38/43GK1807612SQ20061002358
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權日2006年1月24日
發(fā)明者蘇翰, 蘇有錄, 唐甜, 周鈺, 韓彬 申請人:上海阿敏生物技術有限公司