專利名稱：一種羅布麻提取物的制備方法及其藥物制劑與肝病用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物藥有效部位分離、純化技術領域，可使羅布麻有效部位總黃酮含量大于50％，達到國家5類中藥原料藥標準。
羅布麻的藥理活性，文獻報道有保肝、降酶等藥理作用。
背景技術：
常用提取分離工藝為醇提-水沉-乙酸乙酯提取法，得總黃酮，這些方法或有效成分損失大或成分被破壞，使得總黃酮得率低，成本高。因此需要研究一種新的簡便、高效的提取分離方法，并適用于工業化生產。

發明內容
本發明目的在于公開制備羅布麻總黃酮的方法；本發明的另一個目的在于公開以該成分為原料藥的藥物制劑及其保肝、降酶的用途。
本發明目的是通過如下技術方案實現的將干燥的羅布麻葉粉碎成粗粉，用10-30倍量的親水性溶劑加熱回流提取或冷浸滲濾提取，熱提2-3次，每次1-3小時，然后將提取液于低于60℃條件下減壓濃縮至比重1.15-1.30(70℃)的浸膏；加入原生藥量4-6倍熱水，分次溶解，靜置24小時，過濾，濾液聚酰胺為載體的柱層析，用水沖洗及用水醇比例為50∶50-5∶95的混合溶劑洗脫，收集水-醇洗脫液，于低于60℃的條件下減壓濃縮，真空干燥得羅布麻總黃酮提取物。
按藥劑學方法，可以將本發明的羅布麻總黃酮制備成多種臨床藥物劑型作為保肝，降酶藥物，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所說的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑中的任何一種所說的非腸道給藥劑型選自于注射劑、氣霧劑、栓劑或皮下給藥劑型中的一種。
附圖
是羅布麻總黃酮提取工藝的流程圖。
實驗1羅布麻總黃酮的抗肝細胞炎癥作用。
1材料和方法1.1材料 (1)動物昆明種小鼠♂，體重18-22g(2)藥品及試劑CCL4分析純；D-Gal分析純；羅布麻總黃酮，呈黃棕色粉末，實驗時，以生理鹽水作溶劑配制成口服液。
1.2分組及給藥 小鼠隨機分為(1)正常對照組；(2)CCL4中毒組(濃度0.1％，即0.1mlCCL4溶于100ml橄欖油中，腹腔注射0.1ml·g-1)；(3)CCL4+羅布麻總黃酮200mg·kg-1；100mg·kg-1；正常對照組不中毒，只給生理鹽水溶液，給藥組均給藥7d，灌胃，與于第7d給藥后1h腹腔注射0.1％CCL4油劑0.1％ml·g-1，于第9d摘一側眼球取血，收集血清。
1.3D-Gal 動物分組，觀察指標同CCL4.中毒鼠800mg·kg-1’ip.D待中毒高峰(24h攻毒后)殺鼠取血，分別進行生化指標測定。
1.4統計學處理 實驗結果以x±s表示，用SPSS統計軟件進行組間差異t檢驗。
2結果2.1羅布麻總黃酮對CCL4致小鼠肝功能的影響 如表1，2，3所示中毒模型組的各項生化指標與正常組比較均有明顯升高，說明小鼠肝損傷模型制作成功；給藥組分別與中毒組比較，其結果羅布麻總黃酮可明顯降低CCL4肝損傷小鼠血清中ALT水平(表1)，綜合三批動物實驗結果以100mg·kg-1組作用最為明顯，其保肝作用優于陽性對照藥聯苯雙酯。結果表明羅布麻總黃酮可明顯降低CCL4肝損傷小鼠血清中ALT水平，對化學性肝損傷有明顯的保護作用，可起到抗肝細胞炎癥的作用。
表1 JS對小鼠血清生化指標的影響(x±s，n＝79)

注與正常對照組比較，dP＜0.001；與中毒組比較gP＜0.01，fP＜0.05，，hP＜0.001，eP＞0.05.
實驗2羅布麻總黃酮的抗乙肝病毒的作用一、材料(一)藥物羅布麻總黃酮由302醫院研制，為黃棕色粉末，實驗時用培養液溶解稀釋至最大實驗濃度4000μg/ml備用。
(二)2215細胞HBV-DNA克隆轉染人肝癌細胞(Hep G2)的2215細胞系，美國Mount sinai醫學中心構建，我國北京醫科大學傳染科引進，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所病毒室自行傳代培養。
(三)試劑Eagles MEM干粉，美國GIBCO公司產品；胎牛血清，美國Hyolone Lab公司產品；G-418(Genticin)，MEM配制，美國Gibco公司產品；L-谷氨酰胺，北科化學試劑公司進口分裝；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司產品(400μg/100ml MEM)；HBeAg，HBsAg固相放射免疫測定盒，購自中國同位素公司北方免疫試劑研究所產品；青霉素、鏈毒素，華北制藥廠生產。
(四)實驗用品及儀器培養瓶，丹麥Tunclon TM；培養板，96孔板，24孔板，美國corning公司產品；二氧化碳孵箱，美國Shel-Lab產品。
(五)2215細胞培養液及試劑配制MEM培養液100ml含10％胎牛血清，3％谷氨酰胺，1％G418 380μg/ml，青鏈霉素各100μg/ml，加1ml，用5％NaHCO3調pH至pH7。注試驗用培養液不加G418細胞消化液，加0.25％胰酶，用Hanks液配制。
二、試驗方法(一)2215細胞培養在長滿2215細胞的培養瓶內加0.25％胰酶，37℃消化3分鐘，加培養液吹打，1∶3傳代，10天長滿，加入細胞計數板計數，配制成每毫升10萬個細胞分別接種于96孔細胞培養板(供細胞毒性試驗)，每孔0.2ml24孔板(供藥物對病毒抗原試驗)，每孔1ml，37℃，5％CO2培養24小時，細胞長成單層后進行實驗。
(二)藥物對細胞毒性試驗QL12000μg/ml用培養液2倍稀釋成6個濃度8000、4000、2000、1000、500μg/ml，加入96孔細胞培養板，每濃度4孔，每4天換同濃度藥液，培養12天，觀察藥物對細胞的毒性，并設無藥物細胞對照。由于藥液顏色深，不能用MTT染色法觀察藥物對細胞的毒性，采用顯微鏡觀察細胞病變(CPE)為指標。病變程度分五級完全圓化變形病變＞75％為4，病變＞50％＜75％為3，病變＞25％＜50％為2，病變＞15％＜25％為1，無病變為0。
(三)結果計算計算每濃度藥液4孔平均細胞病變程度和抑制％。按Reed-Meuench法計算TC50(半數細胞毒濃度)(1)。
A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝A-B (四)藥物對HBeAg、HBsAg的抑制試驗(2)每毫升10萬個2215細胞接種24孔細胞培養板，每孔1ml，37℃，5％CO2培養24小時，加無毒濃度以下2倍稀釋試驗藥液，3個稀釋度分別為4000、2000、1000、500μg/ml，每濃度3孔，37℃5％CO2培養，每4天收取培養液，換原濃度藥液培養，將收集的培養液-20℃冰凍保存將第8、12天收集的培養液同時測定HBeAg和HBsAg。實驗設HBeAg、HBsAg陽性和陰性對照，細胞對照和陽性對照藥物-羧基甲酸納(Trisodium Phosphonmate，PFA)。用固相放射免疫測定盒測定，方法見說明書，用γ-計數器測定每孔藥液的放射強度(cpm)值。
(五)藥物效果計算計算細胞對照及每濃度cmp均值及標準差，P/N值和抑制百分率(％)，半數有效濃度(IC50)及選擇指數(SI)。
(3)計算藥物抑制抗原半數有效濃度(IC50) A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝A-B (5)以t檢驗法計算各稀釋度HBeAg、HBsAg和對照組之間cpm的差別。
三、試驗結果(一)羅布麻總黃酮在2215細胞培養中的細胞毒性為觀察羅布麻總黃酮對乙型肝炎病毒基因轉染的人肝癌2215細胞的毒性，在接種2215細胞后24小時，加2倍稀釋的6個稀釋度藥液12000、8000、4000、2000、1000、500μg/ml，4天換一次藥液，維持12天，用顯微鏡觀察細胞病變，按公式計算TC50最大無毒濃度(TC0)見表1。TC50三批實驗分別為8673.61μg/ml，8366.73μg/ml，8947.04μg/ml，平均為8662.46μg/ml；TC0三批實驗均為4000μg/ml。
表1羅布麻總黃酮在2215細胞培養(12天)中對細胞的毒性

(二)羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBeAg和HBsAg表達的作用羅布麻總黃酮1000-4000μg/ml給藥8天對HBeAg、HBsAg均有抑制作用，隨著給藥時間延長至12天，這種抑制作用明顯增強(見表2)。
表2羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBeAg和HBsAg的抑制作用(三批實驗均值)

注與細胞對照比較ap＜0.05；bp＜0.01；cp＜0.001
(三)羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBeAg和HBsAg的抑制效果隨著羅布麻總黃酮濃度的增加，抑制率也隨之升高，顯示一定的量效關系；隨著給藥時間的延長(8天-12天)，其抑制率明顯增加，顯示一定的時效關系(見表3)。
表3羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBeAg和HBsAg的抑制效果(三批實驗均值)

與細胞對照比較ap＜0.05；bp＜0.01；cp＜0.001(四)羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBeAg和HBsAg轉陰作用表4P/N值表明，羅布麻總黃酮4000μg/ml對HBeAg和HBsAg的抑制，3次實驗各有2次轉陰；2000μg/ml對HBeAg和HBsAg的抑制，3次實驗各有1次轉陰。陽性對照藥PFA300ug/ml對HBeAg的抑制，3批實驗有2次轉陰；對HBsAg的抑制，3批實驗均轉陰。
表4羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBsAg和HBeAg轉陰作用


注P/N值＞2.1為抗原陽性；*＜2.1為抗原陰性(五)羅布麻總黃酮的TC50、IC50和SI的測定結果羅布麻總黃酮對細胞的TC50三批均值為8662.46μg/ml；TC0＞4000μg/ml；對HBeAg和HBsAg于試驗第8天的IC50分別為2993.89±768.66μg/ml和3090.19±772.40μg/ml，給藥12天的IC50值均＜給藥8天的IC50值；給藥12天SI值＞給藥8天的SI值。說明QL給藥12天比給藥8天的藥量小，而療效比給藥8天更強，更安全(見表5)。
表5羅布麻總黃酮對HBsAg和HBeAg的TC50、TC0、IC50、SI測定結果

(六)羅布麻總黃酮對HBsAg和HBeAg表達作用的綜合結果羅布麻總黃酮對HBeAg和HBsAg表達作用綜合結果包括cpm值、抑制率、IC50、P/N等項目(見表6-7)表6羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBeAg活性的抑制作用


注藥物組與細胞對照組比較ap＜0.05；bp＜0.01 *為P/N值＜2.1(轉陰)表7羅布麻總黃酮在2215細胞培養中對HBsAg活性的抑制作用


注藥物組與細胞對照組比較ap＜0.05；bp＜0.01 *為P/N值＜2.1(轉陰)結論根據《中藥新藥審批辦法》的有關規定(3)，試驗采用HBV基因轉染人肝癌細胞系(Hep G2)的2215細胞株體外培養方法，觀察羅布麻總黃酮對HBeAg、HBsAg的藥效。試驗結果表明，羅布麻總黃酮在最大無毒濃度(4000μg/ml)下，對2215細胞分泌HBeAg、HBsAg有顯著的抑制作用，并有明顯的量效、時效關系和有一定的轉陰作用實驗3羅布麻總黃酮的抗肝纖維化作用1.材料1.1動物 Wistar大鼠40只，清潔級，體重180-220g，雌雄各半，合格證號第003號，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。
1.2藥品 羅布麻總黃酮，由北京302醫院研制1.3試劑 四氯化碳(CC14)，AR級，由北京東市化學試劑商店提供，批號200419。橄欖油、化學純由上海雙喜香料助劑廠生產，批號200816。
2.方法2.1造模 造模前實驗動物適應性飼養1周。首次背部皮下注射CCl40.5ml/100g體重，第2周始背部皮下注射40％CCl4-橄欖油溶液0.3ml/100g體重，每周2次，共6周。自由飲水，飼以正常塊料。
1.4分組 取48只大鼠隨機分為生理鹽水組、CC14模型對照組、羅布麻總黃酮大、中、小劑量、陽性藥物(軟肝片)6組，每組8只。
1.5給藥 除生理鹽水組外，給藥各組自皮下注射CCl40.5ml/100g的第1天開始給藥，每天1次，連續給藥6周，則模型對照組給予生理鹽水2ml，連續給予6周。
1.6觀察 實驗每天觀察記錄大鼠的行為，飲食、稱重。
1.7取材 各組于6周全部處死取材。標本的采集與制備，自左腹股溝取血，分離血清，保存于-30℃箱中待測。取完血立刻剖腹，取肝臟稱重，切取肝左葉距邊緣3mm處肝組織，用10％甲醛固定，制作光鏡片。
1.8檢測 全自動生化測定儀分別測定，血液生化指標血清總蛋白(Tpr)、白蛋白(ALb)、堿性磷酸酶(ALP)；肝功能谷丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、谷草氨酸氨基轉移酶(AST)、血清總膽紅素(TBIL)、1.9鏡檢 肝組織學檢查光鏡下觀察肝小葉結構、肝細胞形態、肝纖維含量變化、肝竇周細胞的變化。
1.10統計 所有數據用x±s表示。2組數據比較用t檢驗。
3.結果3.1羅布麻總黃酮對各組動物血清總蛋白、白蛋白和堿性磷酸酶影響經全自動生化測定儀分別測定血清總蛋白(Tpr)、白蛋白(ALb)、堿性磷酸酶(ALP)結果表明，模型對照組的血清Tpr、Alb含量明顯減少(P＜0.05)；ALP水平明顯升高(P＜0.01)。
而給藥組，羅布麻總黃酮治療后，其小劑量(2.5g/kg)對血清Tpr、Alb雖有升高，但統計處理，與模型對照組無明顯差別，而對ALP則有非常顯著的降低(P＜0.01)。中劑量(5g/kg)對血清Tpr、Alb含量有明顯升高(P＜0.05)，而對ALP有非常顯著的降低(P＜0.01)。高劑量(10g/kg)對血清Tpr、Alb含量有非常明顯升高，對ALP有非常顯著的降低(P＜0.01)，陽性對照藥軟肝片對實驗大鼠血清總蛋白、白蛋白和堿性磷酸酶的影響與羅布麻總黃酮小劑量作用相似(見表1)。
表1各組大鼠血清T.pr、Alb、ALP的變化情況(x±s)

注與節正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型對照組比較，cP＜0.05，dP＜0.013.2羅布麻總黃酮對各組動物肝功能的影響實驗各組，除生理鹽水組肝功能正常外，其它組動物肝功能均出現異常。模型對照組血清ALT、AST、TBIL含量均明顯升高(P＜0.01)。給藥組，羅布麻總黃酮小劑量(2.5g/kg)對改善實驗大鼠肝功能效果不明顯。其中劑量(5g/kg)、大劑量(10g/kg)降低實驗大鼠血清ALT、AST、TBIL水平均非常明顯((P＜0.01)。軟肝片退黃不顯著而降酶明顯(見表2)。
表2各組大鼠血清ALT、AST、TBIL的變化情況(x±s)

注與正常對照組比較，bP＜0.01；與模型對照組比較，cP＜0.05，dP＜0.013.3羅布麻總黃酮對大鼠行為的影響正常組大鼠生理狀態，生長良好，體重增加。CCl4模型對照組大鼠活動不良，飲食減少，體重減輕。給藥各組大鼠活動良好，食欲均有不同程度減退，體重下降不如模型組明顯。
3.4組織病理形態學變化光鏡下肝組織結構變化正常組肝小葉結構存在，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列。模型組肝細胞廣泛嚴重脂肪變性，有少量點狀壞死，匯管區有炎細胞浸潤。部分匯管區纖維組織增寬，并有纖細的纖維間隔伸入肝小葉，局部有早期假小葉形成。假小葉內肝細胞大小不等，排列紊亂。肝竇及中央靜脈擴張、瘀血。羅布麻總黃酮大、中劑量治療組肝細胞有濁腫，未見纖維明顯增生。其小劑量組肝細胞脂肪變性，部分明顯濁腫，匯管區及小葉邊緣纖維組織增寬，伴少量炎細胞浸潤，纖維間隔不連續。
4結論4.1 CCl4反復中毒引起慢性肝損傷模型重復性好。
4.2 CCl4模型對照組大鼠肝臟外觀粗造，質硬灰白，血清總蛋白，白蛋白含量降低，肝功異常，呈現慢肝的表現。其作為觀察抗肝損傷藥物療效模型是可行的。
4.3給藥組，羅布麻總黃酮小劑量(2.5mg/kg)對CCl4引起的慢性肝損傷有一定保護作用，其中劑量。
權利要求
1.一種羅布麻總黃酮原料藥，其特征在于該原料藥含羅布麻總黃酮55％～80％。
2.一種如權利要求1所述的羅布麻總黃酮原料藥的制備方法，其特征在于該制備方法為將干燥的羅布麻葉粉碎成粗粉，用10-30倍量的親水性溶劑加熱回流提取或冷浸滲濾提取，熱提2～3次，每次1～3小時，然后將提取液于低于60℃條件下減壓濃縮至比重1.15～1.30(70℃)的浸膏；加入原生藥量4～6倍熱水，分次溶解，靜置24小時，過濾，濾液上聚酰胺為載體的柱層析，用水沖洗及用水∶醇比例為50∶50～5∶95的混合溶劑洗脫，收集水-醇洗脫液，于低于60℃的條件下減壓濃縮，真空干燥得羅布麻總黃酮提取物。
3.如權利要求2所述的羅布麻總黃酮原料藥的制備方法，其特征在于該制備方法為將干燥的羅布麻葉粉碎成粗粉，加10倍量的70％乙醇加熱回流提取2小時，共3次，合并提取液，放冷，過濾，然后將提取液于低于60℃條件下減壓濃縮至密度1.15～1.30(70℃)的浸膏；加入原生藥量6倍熱水，分次溶解，靜置24小時，過濾，濾液加于相當于生藥5倍量，已處理好的聚酰胺柱上，用水沖洗至流出液呈淡黃色后，用70％醇洗脫，收集乙醇洗脫液至洗脫液承擔黃色為止，于低于60℃的條件下減壓濃縮，真空干燥得羅布麻總黃酮提取物。
4.一種含有如權利要求1所述原料藥的藥物制劑，為了提高其溶解度和生物利用度，可采用添加助溶劑如吐溫-80，或采用能與水混溶的丙二醇、聚乙二醇-400溶解，或采用與有機堿形成鹽等方法制成水溶性制劑。
5.一種含有如權利要求1和權利要求4所述的藥物制劑，其特征在于含有0.5％～99.5％的本發明原料藥和99.5％-0.5％的藥物賦形劑，優選1％～60％的本發明原料藥和99％-40％的藥物賦形劑。
6.如權利要求5所述的藥物制劑，其特征在于所說的藥物是口服制劑或非腸道給藥劑型。
7.如權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于所說的口服制劑選自于片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑當中的任何一種。
8.如權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于所述的非腸道給藥劑型選自于注射劑、氣霧劑、栓劑、或皮下給藥劑型當中的任何一種。
9.本發明羅布麻總黃酮原料藥在制備抗肝纖維化、抗乙型肝炎病毒及保肝藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種羅布麻總黃酮及其所含有效成分金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等。本發明還公開了羅布麻總黃酮的制備方法，其包括以下步驟，取羅布麻藥材，加乙醇提取，回收乙醇，得醇浸膏，以沸水溶解，過濾，上清液上聚酰胺柱，先用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，真空干燥得干浸膏，用比色法測定羅布麻總黃酮含量，以此干浸膏為藥用有效部位，羅布麻總黃酮含量達到50％以上，達到國家5類中藥原料藥標準。本發明羅布麻總黃酮藥理作用在于保肝降酶。由于本發明洗脫劑無毒性，適用于工業化生產。因此，本發明為生產羅布麻5類原料藥提供了高效、可行，且適用于工業應用的方法，為進一步進行羅布麻制劑研究打下了基礎。
文檔編號A61K9/10GK1981792SQ200610083809
公開日2007年6月20日 申請日期2006年6月2日 優先權日2006年6月2日
發明者楊新波, 黃正明, 曹文斌, 陳紅艷, 楊坤 申請人:楊新波, 黃正明, 曹文斌