專利名稱：：雞nd-ib-ai-eds四聯油乳劑滅活疫苗抗原濃縮技術的制作方法雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗抗原濃縮技術
技術領域：
本方法為雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗制備過程中病毒抗原的濃縮技術。
背景技術：
：隨著我國養雞業的發展，養殖規模和養殖密度越來越大，由于蛋雞和種雞的飼養周期較長，受疾病侵害的危險性也大，迫使養殖場頻繁地給雞群接種不同種類的單苗，不僅耗費大量的人力、物力，還給雞群造成嚴重的應激反應，影響生產性能。二聯、三聯和多聯疫苗，接種一次可以預防兩種、三種甚至多種疾病，使疫苗接種變得更加簡便且經濟實惠，在生產實踐中應用越來越多，受到廣大養殖戶的喜愛。多聯疫苗的生產，單位體積內抗原含量是否充足是決定疫苗質量的關鍵，而單純改變疫苗乳化工藝中的油水比例以及通過改變病毒增殖條件提高病毒含量均不能達到多聯苗生產所需要的抗原量。因此應用先進的抗原濃縮技術，提高疫苗中的抗原濃度，確保單位疫苗中足夠的抗原含量，同時盡量減小免疫劑量，是目前多聯疫苗生產中急需解決的關鍵技術。中空纖維超濾技術具有單位體積內膜表面體積大、耗能低、效率高、滯留低等特點。其工作原理是原液通過泵，在一定壓力成湍流狀態下在中空纖維超濾膜內或膜外表面分布流動，溶劑或小于膜截流分子量的物質透過膜經收集成為超濾液，而大于膜截流分子量的物質及膠體顆粒則被截流，如要返回到原液中時，其原液的濃度會逐漸升高，俗稱濃縮液，如此反復，從而實現原液的濃縮目的。本技術應用天津工業大學膜分離技術研究所生產的內壓式中空纖維超濾器濃縮器對病毒抗原進行濃縮，旨在解決長期雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗抗原量低的問題。
發明內容1發明目的本發明的目的是建立可靠、高效率的雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗抗原濃縮技術，以確保生產出的四聯苗中四種病毒的濃度均達到抗原量，能夠保護雞群免受新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AIV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、減蛋下降綜合癥病毒(EDSV)的侵襲。2發明的具體步驟2.1設備本方法采用由天津工業大學膜分離技術研究所生產的內壓式中空纖維超濾器，'選用不銹鋼機械泵，采用低噪音、耐腐蝕、無污染、易滅菌的聚四氟乙稀材料，整機無機械磨擦，無劇烈振動、易清洗。接口密閉，循環閉路，便于無菌操作。該設備為兩級過濾，一級濾柱可截留病毒液中顆粒物質、碎片以及蛋白等膠凍樣物質，為二級過濾創造一個良好的過濾環境。二級濾柱截留分子量40KD，為該濾過裝置的主要部分，病毒液通過中空纖維濾柱時水分等小于截留分子量的物質在循環過程中被濾過，而病毒被截留，從而達到病毒液濃縮的目的。2.2濃縮材料新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AIV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)病毒液，將以上三種病毒液分別通過超濾裝置進行濃縮后，與減蛋下降綜合癥病毒(EDSV)按比例混合用于疫苗的制備。2.3病毒液濃縮和疫苗制備流程2.3.1粗濾將病毒液倒入料桶中，經過300目的銅網濾出病毒液中殘留的組織或細胞團塊，流出的病毒液稱為粗濾液。2.3.2精濾在0.15MPa的壓力下，將粗濾液壓入到一級濾柱內，在持續的壓力下，粗濾液在中空纖維柱內流動，小于膜截流分子量的病毒液通過中空纖維膜流出一級濾柱(稱為精濾液)，大分子量的蛋白質等物質被截留在柱內。2.3.3超濾將精濾液在0.15MPa的壓力下注入二級濾柱內，在持續的壓力下，精濾液在中空纖維柱內循環流動，小于膜截流分子量的溶劑通過中空纖維膜流出，病毒粒子被截留。流出的溶劑中應不含有病毒粒子。通過計算流出的溶劑的量與病毒原液的體積相比，即可計算出病毒液被濃縮的倍數。2.3.4收料當通過計算體積比，病毒液達到了濃縮倍數時，停止超濾。將中空纖維柱中余下的病毒濃縮液，從出口流入收料裝置內。整個病毒濃縮過程結束。2.3.5病毒液滅活濃縮后的新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AIV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)病毒液和減蛋下降綜合癥病毒(EDSV)中加入0.2%的甲醛進行滅活。2.3.6疫苗制備將經滅活檢驗合格的濃縮ND、IB、AI(H9)、EDS病毒抗原按適當比例混合，加入少量吐溫-80，制備水相后，與油相按l:3的比例混合，加入終濃度為0.01%的硫柳汞，乳化制備成ND-IB-AI-EDS濃縮四聯油乳劑滅活疫苗。圖1內壓式中空纖維微濾膜組件模式圖超濾過程中起決定作用的是超濾膜。中空纖維超濾膜是以高分子材料采用特殊工藝制造而成的非對成半透膜，它呈中空纖維毛細管狀微孔密布管壁。在壓力作用下原液在膜內或膜外流動，其中，溶劑或小分子物質透過膜經收集成為超濾液，其它大分子物質及膠體顆粒則被膜面阻擋，被循環流動的原液帶走而成為濃縮液，從而達到物質的分離、濃縮、和提純之目的。圖2中空纖維超濾器濾柱實例圖具體實施例方式實例1禽ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗病毒抗原濃縮和免疫對比試驗K材料與方法U病毒液NDV、IBV、AIV(H9亞型)、EDS活病毒液與滅活病毒液均由本室提供。1.2主要儀器設備中孔纖維超濾器，天津工業大學膜分離技術研究所生產；膠體磨，沈陽新光機器廠產品；均質機，購自上海華東均質機廠。1.3滅活前病毒抗原濃縮試驗應用中孔纖維超濾器將收獲的NDV、IBV、AIV(H9)濃縮4倍，計算濃縮時間和濾過水的體積，并分別采集濃縮前、濃縮后病毒樣品和等壓沖洗水、反洗水樣品，應用微量法測定樣品對1%雞紅細胞的HA效價，計算病毒截留率。IBV樣品測定前先用1%胰蛋白酶進行預處理。1.4滅活后病毒抗原濃縮試驗用滅活后的ND、IB、AI病毒液進行濃縮試驗，測定濃縮前、后病毒樣品對1。/。雞紅細胞的HA效價，計算病毒截留率。IBV樣品測定前先用1%胰蛋白酶進行預處理。1.5疫苗制備將經滅活檢驗合格的濃縮ND、IB、AI(H9)病毒抗原按適當比例混合，加入少量吐溫-80，制備水相后，與油相按l:3的比例混合，加入終濃度為0.01%的硫柳汞，乳化制備成ND-IB-AI濃縮三聯油乳劑滅活疫苗。同時用未濃縮的ND、IB、AI(H9)病毒抗原按相同的抗原體積比例制備非濃縮三聯疫苗。1.6免疫對比試驗將20日齡非免疫雛雞分成2組，每組10只，第l組用濃縮疫苗免疫，第2組用非濃縮疫苗免疫，每只雞接種0.25ml。分別與免疫前和免疫后l、4、8、12周檢湖!IND、IB、AI(H9)血清抗體HI效價。2、實驗結果2.1濃縮效率測定應用濾器對NDV、IBV、AIV按預先設計分別進行4倍濃縮，并分別采集濃縮前、濃縮后病毒樣品和濾過液、等壓沖洗水、反洗水樣品，測定樣品對1%雞紅細胞的HA效價，計算病毒截留率。結果見表2-l、表2-2、表2-3、表2-4。表2-l:未滅活病毒液濃縮前后的HA效價(Log2)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2-1結果表明，3種病毒液濃縮試驗均達到預期的效果，病毒液濃縮4倍后，其HA效價較濃縮前提高了兩個滴度。同時濾過液的HA效價經檢測為零，說明該裝置具有良好的嚴謹性，病毒的截留率為100%。表2-2:濃縮后四次沖洗液的HA效價<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>AIV10200由表2-2可知，兩次等壓沖洗的樣品中皆可檢測到HA效價，特別是第一次等壓沖洗樣品的HA效價接近于濃縮前病毒液。因此可在濃縮后用適量無菌水等壓沖洗兩次，沖洗液回收利用，提高病毒的回收率；反洗及反頂洗樣品中未能檢測到HA效價，證明反洗及反頂洗液中無病毒或極少病毒存在，可在洗滌后棄去。表2-3:病毒濃縮倍數與其體積變化的關系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2-3結果顯示，病毒的濃縮倍數與濃縮前后病毒液的體積變化及HA效價變化呈直線的線性關系，可以在實際生產中根據排放液與原液體積的比例關系或HA效價的變化來確定濃縮倍數。表2-4:病毒液滅活前后濃縮效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2-4結果表明，在病毒滅活前和滅活后進行濃縮，對于濃縮效果沒有影響，因此，在疫苗研制過程中可根據不同病毒的特性和保存條件以及疫苗的生產工藝選擇濃縮時機。2.2免疫對比試驗免疫后不同時間血清HI抗體水平檢測結果見表2-5。表2-5結果顯示，濃縮疫苗免疫后，抗體產生速度要比非濃縮疫苗組快；而且在免疫后的同一吋期，濃縮疫苗免疫組抗體水平明顯高于非濃縮疫苗組，表明濃縮疫苗的免疫效果要優于非濃縮疫苗。根據其抗體下降趨勢分析，不難看出該疫苗具有更長的免疫持續期。表2-5:濃縮疫苗和非濃縮疫苗免疫效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>_非濃縮疫苗_2____6.93、小結與討論3.1由表2-l、表2-2結果可知，應用中孔纖維超濾器可對NDV、IBV和AIV進行有效濃縮，其病毒的截留率為100%，通過對等壓沖洗液回收利用，理論上可100%回收病毒，因此，該系統具有很高的病毒回收率。此外，該系統濃縮10000ml病毒液所需時間不超過20min，表明該設備具有較高的濃縮效率，可用于大規模病毒抗原的濃縮工藝。3.2免疫對比試驗結果顯示，與非濃縮疫苗組相比，濃縮疫苗免疫后，機體產生抗體速度更快，免疫后4周檢測抗體，NDHI抗體水平由濃縮前的8.01og2上升到10.1og2，IBHI抗體水平由6.51og2上升到8.51og2，均達到21og2以上；AIHI抗體水平由7.51og2上升到S.91og2，明顯高于非濃縮疫苗組，表明濃縮疫苗的免疫效果要優于非濃縮疫苗。根據其抗體下降趨勢分析，不難看出該疫苗具有更長的免疫持續期。因此，研究的病毒抗原濃縮技術完全可用于多聯疫苗生產中病毒抗原的濃縮，具有很好的應用價值。權利要求1、一種病毒抗原的濃縮技術，使用于雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗制備過程。2、根據權利要求1所述雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗抗原濃縮技術，其特征在于本方法用于新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、H9亞型禽流感病毒(AIV)的抗原濃縮。3、根據權利要求1所述的雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗抗原濃縮技術，其特征在于包括了粗濾、精濾、超濾、收料四個步驟。4、根據權利要求書3所述的病毒抗原濃縮技術，其特征在于在病毒抗原濃縮前，加入了預過濾過程即粗濾程序，選用300目的銅網，過濾出病毒液中殘留的組織或細胞團塊。5、根據權利要求書3所述的病毒抗原濃縮技術，其特征在于精濾過程中將濾液壓入到一級濾柱內，過濾出病毒液中殘留的大分子量的蛋白質等物質。6、根據權利要求書3所述的病毒抗原濃縮技術，其特征在于超濾過程選用40KD截流分子量的中空纖維超濾裝置用于三種病毒成分的濃縮。選用該截留分子量的中空纖維膜既可阻擋病毒液中的病毒粒子透過中空纖維膜，又不會因截留分子量過小影響病毒液濃縮的效率。7、根據權利要求1所述的病毒抗原濃縮技術，其特征在于該技術除用于雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗制備外，還可用于新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、H9亞型禽流感病毒(AIV)任意兩種以上病毒聯苗的制備。全文摘要本發明提供了雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗制備過程中病毒抗原的濃縮技術。該方法的主要內容為將雞新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、H9亞型禽流感病毒(AIV)分別通過內壓式中空纖維超濾器，經過了粗濾、精濾、超濾、收料四個步驟進行濃縮，濃縮后的三種病毒抗原與減蛋下降綜合癥病毒(EDSV)混合，用于雞ND-IB-AI-EDS四聯油乳劑滅活疫苗制備。文檔編號A61K9/107GK101181240SQ20061012940公開日2008年5月21日申請日期2006年11月14日優先權日2006年11月14日發明者丁伯良,健張,莉張,李秀麗,王英珍,鄢明華申請人:天津市畜牧獸醫研究所