專利名稱：一種能增強(qiáng)動物抗體應(yīng)答的多肽片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬免疫學(xué)和遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能增強(qiáng)動物抗體應(yīng)答的多肽片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際獸醫(yī)局將口蹄疫列為A類傳染病之首?？谔阋呤钱?dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動物。多年來，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防接種是控制該病毒的主要手段。在各種預(yù)防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景。一個基因工程疫苗成敗的關(guān)鍵在于其能否引起動物產(chǎn)生足夠高的中和抗體應(yīng)答。現(xiàn)已證明口蹄疫病毒VP1蛋白G-H環(huán)是一個重要的誘導(dǎo)中和抗體的抗原位點(diǎn)，涉及130-160位肽段。然而，含有該肽段的融合蛋白卻不能誘發(fā)動物產(chǎn)生足夠高的中和抗體應(yīng)答。因此，尋求一種能夠增強(qiáng)該肽段誘發(fā)動物產(chǎn)生中和抗體能力的新型免疫增強(qiáng)佐劑顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種能增強(qiáng)動物抗體應(yīng)答的多肽片段及其應(yīng)用。
本發(fā)明提出的能增強(qiáng)動物抗體應(yīng)答的多肽片段，是一種能夠刺激基因工程疫苗誘發(fā)中和抗體應(yīng)答水平的免疫刺激多肽片段。該免疫刺激片段為口蹄疫病毒VP2蛋白1-33位氨基酸，其氨基酸序列為DKKTEEATLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVT(SEQ ID NO.1)，該肽命名為B1，不同型的口蹄疫病毒，該免疫刺激片段有1-3個氨基酸可被置換。
本發(fā)明提出的免疫刺激片段，用western blotting和T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)該片段含有B細(xì)胞表位，具有T細(xì)胞刺激功能。該片段的免疫刺激效應(yīng)主要在于其增強(qiáng)動物體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答，進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞成熟于分化，增強(qiáng)了抗體的分泌。
本發(fā)明還采用β-半乳糖苷酶作為載體蛋白，將上述免疫刺激肽段連接在該載體蛋白半乳糖苷酶C端，制備得融合蛋白LacZ-B1，該融合蛋白可作為新型口蹄疫基因工程多肽疫苗免疫刺激佐劑。該融合蛋白佐劑安全性好，能有效提高動物抗體應(yīng)答水平。


圖1融合蛋白表達(dá)及其免疫原性檢測。
A融合蛋白在JM101菌表達(dá)SDS-PAGEM蛋白分子量Marker.
1JM101空菌對照2pWR590對照3pWRB1B Western blotting檢測融合蛋白免疫原性1-3與上述相同圖2采用MTS法測定T細(xì)胞增殖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1，以β-半乳糖苷酶為載體蛋白構(gòu)建免疫刺激蛋白pWRB1表達(dá)質(zhì)粒。其結(jié)果如下SDS-PAGE電泳檢測證明表達(dá)獲得的融合蛋白LacZ-B1分子量與預(yù)期一致(見圖1A)。Western blotting檢測證明該LacZ-B1融合蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能與標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)(見圖1(B))。
用該融合蛋白免疫豚鼠，檢測T細(xì)胞增殖。結(jié)果證明VP2中1-33肽段能有效地誘導(dǎo)動物T細(xì)胞增殖(見圖2)。圖中的橫坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋倍數(shù)X，縱坐標(biāo)表示刺激指數(shù)SI(注本實(shí)驗(yàn)采用MTS/PMS法測定T細(xì)胞增殖，刺激指數(shù)以實(shí)驗(yàn)組的OD值與不加抗原的陰性對照組OD之差與不加抗原的陰性對照組OD值的比值)。
用純化的融合蛋白LacZ-B1配制疫苗，把該疫苗與LacZ-D7疫苗(亞洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163肽段連在β-半乳糖苷酶C端所形成的融合蛋白，該融合蛋白免疫豚鼠，能引起豚鼠中和抗體應(yīng)答見表1)聯(lián)合兩次免疫豚鼠(免疫劑量各組分蛋白單次免疫300μg)，與單獨(dú)免疫LacZ-D7融合蛋白組相比，前者所引起的中和抗體水平比后者顯著提高(見表2)。
表1融合蛋白分別免疫豚鼠中和抗體測定

表2融合蛋白混合在一起免疫豚鼠中和抗體測定

序列表SEQID NO.1DKKTEEATLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVT
權(quán)利要求
1.一種能增強(qiáng)動物抗體應(yīng)答的多肽片斷，其特征為該多肽片段連在載體蛋白半乳糖苷酶C端，構(gòu)成一融合蛋白，所述多肽片段為口蹄疫病毒VP2蛋白1-33位氨基酸，其氨基酸序列為DKKTEEATLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽片斷，其特征在于該多肽片斷有1-3個氨基酸可被置換。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的多肽片斷在制備口蹄疫基因工程多肽疫苗的免疫刺激佐劑中的應(yīng)用，該佐劑是以β-半乳糖苷酶作為載體蛋白、由所述多肽片斷連接在該載體蛋白半乳糖苷酶C端而得到的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬免疫學(xué)與遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能增強(qiáng)動物抗體應(yīng)答的多肽片段及其應(yīng)用。該多肽片斷是一種能夠刺激基因工程疫苗誘發(fā)中和抗體應(yīng)答水平的免疫刺激多肽片斷，具體為口蹄疫病毒VP2蛋白第1－33位氨基酸序列。本發(fā)明采用β－半乳糖苷酶作為載體蛋白，將上述免疫刺激肽段連接在該載體蛋白半乳糖苷酶C端，制備得融合蛋白LacZ－B1。該融合蛋白可作為新型口蹄疫基因工程多肽疫苗免疫刺激佐劑。該融合蛋白佐劑安全性好，能有效提高動物抗體應(yīng)答水平。
文檔編號A61P31/00GK1986562SQ20061014725
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日
發(fā)明者鄭兆鑫, 嚴(yán)維耀, 王加龍, 劉明秋, 陳維灶, 韓姬 申請人:復(fù)旦大學(xué)