專利名稱：貫眾總多糖在制備防治急性呼吸窘迫綜合征藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬中藥領域，涉及中藥貫眾總多糖新的藥用用途。具體涉及貫眾總多糖在防治急性呼吸窘迫綜合征中的用途。
背景技術：
急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指心源性以外的各種肺內外致病因素所導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，其臨床特點為急性呼吸窘迫和難治性低氧血癥，是臨床上較為常見的危急、重癥之一，病死率高。Davidson TA(Davidson TA，Caldwell ES，et al.JAMA，1999，281354.)等報道在過去十年ARDS的死亡率高達30％-40％。有研究表明重癥非典型肺炎(SARS)病人也可出現呼吸窘迫，且肺部病理改變與ARDS相似，主要表現為肺泡的損傷。SARS并發ARDS死亡率極高。糖皮質激素、抗生素、抗細胞因子治療藥物等常被用于ARDS的治療，但目前為止，仍無一種特效藥物能治療上述疾病。研究表明免疫損害是ARDS的另一重要發病機制。而補體系統的過度激活與ARDS的發生與預后有顯著聯系。通過特異性抑制補體組成成分激活有可能提高治療ARDS的臨床療效。因此急需高效低毒的補體抑制劑來防治急性呼吸窘迫綜合征。
貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨(Dryopteris crassirhizoma)的根莖及葉柄基，也稱為東北貫眾或綿馬貫眾。此外，也有將蛾眉蕨(Lunathyrium acrostichoides)、狗脊蕨(Woodwardia japonica)、紫萁(Osmunda japonica)、蘇鐵蕨(Brainea insignis)、烏毛蕨(Blechnum orientale)莢果蕨(Matteuccia struthiopteris)和東方莢果蕨(M.orientalis)的根莖及葉柄基作貫眾入藥。貫眾具有清熱解毒、涼血止血、殺蟲的功效，主治風熱感冒、溫熱斑疹、吐血、咯血及腸寄生蟲病等癥。現代藥理研究證明貫眾含綿馬酸類、三萜、鞣質、揮發油、多糖等化學成分。具有抗腫瘤、抗病原微生物和驅蟲等作用(吳貽谷，宋立人，等.中華本草(上冊)精選本.1996，p219)。
縱觀國內外的報導，尚無關于貫眾免疫抑制藥理作用的報道，也未見報道貫眾總多糖的防治急性呼吸窘迫綜合征藥效及其藥物。

發明內容
本發明的目的是提供貫眾總多糖新的藥用用途，具體涉及貫眾總多糖在制備防治急性呼吸窘迫綜合征藥物中的用途及其制備方法。
本發明從中藥貫眾中分離提取得到總多糖提取物。
所述總多糖提取物經體外實驗證實，有較強抗補體活性，整體動物模型試驗證實其具有很強的防治實驗性急性呼吸窘迫綜合征作用。
本發明所述的中藥貫眾包括狗脊蕨貫眾(Woodwardia japonica)，綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma)，莢果蕨貫眾(Matteuccia struthiopteris)和東方莢果蕨貫眾(M.orientalis)。
本發明的目的通過下述技術方案實現1、制備貫眾總多糖取貫眾藥材以95％乙醇冷浸提取，濾過，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80％，離心，沉淀、冷凍、干燥，即得總多糖提取物，收率達5.72％，多糖含量為53.0-58.9％。
2、貫眾總多糖用于抗補體和防治急性呼吸窘迫綜合征試驗1)抗補體激活經典途徑細胞溶血試驗豚鼠(購自復旦大學實驗動物部)血清1∶32稀釋液作為補體，抗原激活補體經典途徑導致羊紅細胞溶血，測得貫眾總多糖可抑制細胞溶血。
綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma)CH50＝0.170mg.ml-1(n＝4)。
狗脊蕨貫眾(Woodwardia japonica)CH50＝0.114mg.ml-1(n＝4)。
莢果蕨貫眾(Matteuccia struthiopteris)CH50＝0.137mg.ml-1(n＝4)。
東方莢果蕨貫眾(M.orientalis)CH50＝0.125mg.ml-1(n＝4)。
2)抗補體激活旁路途徑細胞溶血試驗健康人血清1∶10稀釋液作為補體，激活補體旁路途徑導致兔紅細胞溶血，測得貫眾總多糖可抑制溶血。
綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma)AP50＝0.764mg.ml-1(n＝4)。
狗脊蕨貫眾(Woodwardia japonica)AP50＝0.703mg.ml-1(n＝4)。
莢果蕨貫眾(Matteuccia struthiopteris)AP50＝0.375mg.ml-1(n＝4)。
東方莢果蕨貫眾(M.orientalis)AP50＝0.682mg.ml-1(n＝4)。
3)防治急性呼吸窘迫綜合征體內試驗選用SD大鼠，以缺血再灌注+內毒素(LPS)二次打擊，建立與補體過度激活相關的急性呼吸窘迫綜合征模型。貫眾總多糖灌胃給藥。觀察動物的血清中總補體活性及二氧化碳指標。
將試驗大鼠在實驗結束后放血處死，取肺，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。
結果證實口服貫眾總多糖后，對大鼠急性呼吸窘迫綜合征引起的肺損傷有明顯的保護作用。
體外試驗證實，貫眾總多糖對在經典和旁路途徑激活所引發的細胞溶血均有抑制，對體內大鼠的急性呼吸窘迫綜合征有防治作用。
表1是動物血清補體活性測定的OD值變化率(％，X±SD)(n＝5)。
表2是動物血清CO2濃度變化率(％，X±SD)(n＝5)。
表1

*與ARDS模型組比較P＜0.05；**與ARDS模型組比較P＜0.01。
表2


*與ARDS模型組比較P＜0.05；**與ARDS模型組比較P＜0.01。


圖1是ARDS大鼠血清補體活性測定的OD值變化率。
圖2是ARDS大鼠血清CO2濃度變化率。
圖3是ARDS大鼠肺切片圖。
圖4是空白對照組大鼠肺切片圖。
圖5是偽手術組大鼠肺切片圖。
圖6是陽性對照(氫化潑尼松)大鼠肺切片圖。
圖7是貫眾總多糖給藥組大鼠肺切片圖。
具體實施例方式
實施例1取貫眾藥材100g，以95％乙醇冷浸提取，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以S三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積加乙醇至含醇量80％，離心，沉淀冷凍干燥即得總多糖，產物收率達5％以上，多糖含量超過50％。表3是貫眾總多糖收率及含量。
表3

實施例2將綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma)總多糖約3.0mg.mL-1用巴比妥緩沖液(barbitol buffer solution，BBS)對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清1∶32稀釋液)，0.1ml 2％羊紅細胞(sheep red blood cell，SRBC)和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0.2ml各濃度樣品溶液與0.4mlBBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(CH50)為0.170mg.ml-1(n＝4)。
實施例3將狗脊蕨貫眾(Woodwardia japonica)總多糖約3.0mg.mL-1用巴比妥緩沖液對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清1∶32稀釋液)，0.1ml 2％羊紅細胞和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅將0.2ml各濃度樣品溶液與0.4mlBBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(CH50)為0.114mg.ml-1(n＝4)。
實施例4將莢果蕨貫眾(Matteuccia struthiopteris)總多糖約3.0mg.mL-1用巴比妥緩沖液對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清1∶32稀釋液)，0.1ml 2％羊紅細胞和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅將0.2ml各濃度樣品溶液與0.4mlBBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(CH50)為0.137mg.ml-1(n＝4)。
實施例5將東方莢果蕨貫眾(M.orientalis)總多糖約3.0mg.mL-1用巴比妥緩沖液對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清1∶32稀釋液)，0.1ml 2％羊紅細胞和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0.2ml各濃度樣品溶液與0.4mlBBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(CH50)為0.125mg.ml-1(n＝4)。
實施例6將綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma)總多糖約5.0mg.mL-1用含Mg2+的明膠-巴比妥緩沖液[GVB/Mg(10mM)EGTA]對倍稀釋得八個濃度的溶液，取0.15ml各濃度樣品加入0.15ml補體(人血清1∶10稀釋液)，0.2ml 2％兔紅細胞，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0.15ml各濃度樣品溶液與0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(AP50)為0.764mg.ml-1(n＝4)。
實施例7將狗脊蕨貫眾(Woodwardia japonica)總多糖約5.0mg.mL-1用含Mg2+的明膠-巴比妥緩沖液[GVB/Mg(10mM)EGTA]對倍稀釋得八個濃度的溶液，取0.15ml各濃度樣品加入0.15ml補體(人血清1∶10稀釋液)，0.2ml 2％兔紅細胞，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0.15ml各濃度樣品溶液與0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(AP50)為0.703mg.ml-1(n＝4)。
實施例8將莢果蕨貫眾(Matteuccia struthiopteris)總多糖約5.0mg.mL-1用含Mg2+的明膠-巴比妥緩沖液[GVB/Mg(10mM)EGTA]對倍稀釋得八個濃度的溶液，取0.15ml各濃度樣品加入0.15ml補體(人血清1∶10稀釋液)，0.2ml 2％兔紅細胞，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0.15ml各濃度樣品溶液與0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(AP50)為0.375mg.ml-1(n＝4)。
實施例9將東方莢果蕨貫眾(M.orientalis)總多糖約5.0mg.mL-1用含Mg2+的明膠-巴比妥緩沖液[GVB/Mg(10mM)EGTA]對倍稀釋得八個濃度的溶液，取0.15ml各濃度樣品加入0.15ml補體(人血清1∶10稀釋液)，0.2ml 2％兔紅細胞，將每管37℃水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4℃離心，20min后分別取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0.15ml各濃度樣品溶液與0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4℃離心10min，取每管上清0.25mL于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(AP50)為0.682mg.ml-1(n＝4)。
實施例10SD大鼠25只(250-300g)，隨機分為A、B、C、D、E組。A組為內毒素致傷ARDS組，B組為陰性對照組，C組為陽性對照組，D組為偽手術對照組，E組為貫眾多糖組。除了D組外的所有組動物在20min內自頸部動脈放血至平均動脈壓為45±5mmHg，室溫下休克1h后回輸血液，在隨后的1h內回輸全部采集血液，然后氣管內給予LPS200μg.kg-1；E組在給予LPS前半小時灌胃給藥，劑量為10mg/kg；D組僅實施麻醉和頸動脈插管等手術操作。B組其余操作與E組相同，以生理鹽水替代貫眾多糖，作為陰性對照。C組則在給予LPS前半小時以70mg/kg腹腔注射氫化潑尼松作為陽性對照組。A-E組分別在氣管內注入內毒素前(T0)及注入內毒素后的0.5h(T0.5)、1h(T1)、1.5h(T1.5)、2.5h(T2.5)采集血樣，分別測定血中CO2濃度及補體經典途徑的溶血活性。給予內毒素2.5h后動物處置，取肺，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。結果顯示A組與B組血樣CO2濃度呈現較大幅度的上升，補體活性小幅度下降。C、E組血樣CO2濃度上升幅度相對較小，補體活性大幅度下降。D組血樣CO2濃度與補體活性略微下降，基本穩定。病理切片按肺部損傷情況A組評級均數為3.67，B組評級均數為2.33，C組為3.33，D組為1.17，E組別為2.67。結果表明，貫眾多糖在體內也有抑制補體的作用，且能不同程度地改善內毒素致傷引起缺氧及肺臟的炎癥，有緩解ARDS大鼠模型肺損傷趨勢。
權利要求
1.貫眾總多糖在制備防治急性呼吸窘迫綜合征藥物中的用途。
2.貫眾總多糖在制備防治重癥非典型肺炎藥物中的用途。
3.貫眾總多糖在制備防治人禽流感藥物中的用途。
4.貫眾總多糖在制備抗補體藥物中的用途。
5.按權利要求1或2或3或4的用途，其中所述的貫眾總多糖通過下述方法和步驟制備貫眾藥材以95％乙醇冷浸提取，濾過，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80％，離心，沉淀冷凍干燥即得總多糖提取物，收率5.72％，多糖含量為53.0-58.9％。
6.按權利要求5的用途，其中所述的貫眾藥材選自狗脊蕨貫眾(Woodwardiajaponica)，綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma)，莢果蕨貫眾(Matteucciastruthiopteris)或東方莢果蕨貫眾(M.orientalis)。
全文摘要
本發明屬中藥領域，涉及貫眾總多糖在制備防治急性呼吸窘迫綜合征藥物中的用途。本發明從中藥貫眾中分離提取得到總多糖提取物，平均產物收率5.72％，多糖含量為53.0－58.9％。所述總多糖提取物經體外實驗證實，對在經典和旁路途徑激活所引發的細胞溶血均有抑制，有較強抗補體活性；整體動物模型試驗顯示，對大鼠急性呼吸窘迫綜合征引起的肺損傷有明顯的保護作用，證實對急性呼吸窘迫綜合征有防治作用。本發明的總多糖提取物可制備防治急性呼吸窘迫綜合征藥物和防治人禽流感藥物。
文檔編號A61P31/16GK1994336SQ200610147309
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者陳道峰, 徐晗, 章蘊毅, 周捷, 張建文, 盧燕 申請人:復旦大學