專利名稱：黑乳海參多糖提取方法及其在醫藥領域中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種從黑乳海參中提取黑乳海參多糖的方法及其黑乳海參多糖在預防和治療腫瘤疾病的藥物中的應用。
背景技術：
黑乳海參(Holothuria nobilis Jaeger)為棘皮動物門(Echinodermata)海參科(Holothuriadae)生物。海參具有較高的食用和藥用價值。明代以后，海參收入本草，列為補益藥。資料記載，海參具有補腎益精、養血潤燥的功用，主治精血虧損、虛弱勞怯、陽痿、夢遺、小便頻數、腸燥便艱等癥。現代化學和藥理實驗研究證實海參體壁真皮結締組織、體腔、內腺管及內臟含有多種生物活性物質，其主要有效成分為酸性粘多糖(SJAMP)，由氨基半乳糖、己糖醛酸、巖藻糖和硫酸基組成。是一種類肝素抗凝劑，具有抗凝血、抑制血小板聚集、防治急性放射性損傷作用，可明顯促進造血功能的恢復和增強。SJAMP能抑制腫瘤生長、抗腫瘤轉移，是一種作用較強的免疫促進劑。
國內外關于黑乳海參的研究主要集中于其體內皂苷類成分，對于黑乳海參多糖的提取方法則尚未見報道。

發明內容
本發明的目的是運用各種現代化學和藥理手段，從黑乳海參中提取具有治療腫瘤疾病的多糖類化合物。
黑乳海參多糖提取工藝流程是將黑乳海參粉碎后，與3～7％的氫氧化鉀溶液按質量比1∶2～1∶6混合，并用打漿機打漿，在30～60℃的溫度下攪拌提取，提提取時間1～3小時，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解1～2小時，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶0.5～2.0。酶解液用3000轉/分鐘離心機離心后，收集全部濾液，在50～80℃濃縮8～12小時。將濃縮后的浸提液置于冷凍機中冷凍1～3小時，溫度為-1～10℃，然后減壓至20帕～200帕，干燥溫度為30～60℃，經8～12小時，得到白色多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。本發明具有黑乳海參多糖損失少，工藝成本低，多糖得率高的特點。
實驗研究證明，黑乳海參多糖對人體腫瘤細胞K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細胞株均有抑制作用；對S180荷瘤小鼠的腫瘤組織也有較強的抑制作用，是有效的治療腫瘤藥物。
本發明對黑乳海參多糖進行了抗腫瘤的評價實驗。
(一)黑乳海參多糖對人體外腫瘤細胞的抑制作用。
1.實驗目的評價黑乳海參多糖對K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細胞株生長的影響。
2.實驗方法細胞毒活性實驗MTT法篩選。黑乳海參多糖的濃度為100μg/ml，10μg/ml，1.0μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml。
數據處理以抑制率(％)表示。計算公式如下抑制率＝[細胞死亡均數-(細胞存活數1+細胞存活數2)/2]/細胞死亡均數對照組指數×100％。
3.結果黑乳海參多糖在100μg/ml時，對K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細胞株生長有較強的抑制作用(結果見表1)。
表1.黑乳海參多糖對人體腫瘤細胞的抑制作用

4.結論黑乳海參多糖具有較強的抗腫瘤活性。
(二)黑乳海參多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用1.實驗目的評價黑乳海參多糖對S180荷瘤小鼠肉瘤組織生長的影響。
2.方法昆明種小鼠，體重20±5g，雌雄各半。隨機編成試驗組、陰性對照組、內環磷酰胺陽性對照組，每組10只。在無菌條件下，取生長旺盛的瘤源，制備成1-2×107個/ml的細胞懸液，分別接種于相應宿主小鼠腋皮下，接種0.2ml/只，次日開始，按照如下實驗方案給藥灌胃給藥100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，每天一次，連續給藥10d；陰性對照組給予與試驗組等體積的生理鹽水，陽性對照組給予環磷酰胺30mg/kg，腹腔給藥，每天一次，連續7d。停藥后24h處死各組動物，稱體重、瘤重，計算各組平均瘤重，按下列公式求出腫瘤抑制率并進行t檢驗。

3.結果黑乳海參多糖(100mg/kg)具有明顯抑制S180荷瘤小鼠肉瘤組織的生長形成。

注與陰性對照組比較*P＜0.014.結論黑乳海參多糖具有較強的抗腫瘤活性。
具體實施例方式
實施例一取新鮮黑乳海參10公斤，洗凈，切碎，加入3～7％的氫氧化鉀溶液30公斤，打漿機打漿，在45℃攪拌提取2小時，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解1小時，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶1。酶解液用3000轉/分鐘離心機離心后，收集全部濾液，在50℃濃縮12小時。將濃縮后的浸提液置于冷凍機中冷凍2小時，溫度為-1℃，然后減壓，使干燥壓降至100帕，干燥溫度為55℃，經10小時，得到白色多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。
實施例二取自然干燥的黑乳海參2公斤，粉碎，加入加入3～7％的氫氧化鉀溶液12公斤，浸泡，打漿機打漿，60℃攪拌提取3小時，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解2小時，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶0.9。酶解液用3000轉/分鐘離心機離心后，收集全部濾液，在60℃濃縮12小時。將濃縮后的浸提液置于冷凍機中冷凍2小時，溫度為5℃，然后減壓，使干燥壓降至100帕，干燥溫度為55℃，經10小時，得到白色多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。
實施例三取新鮮黑乳海參5公斤，洗凈，切碎，加入3～7％的氫氧化鉀溶液30公斤，打漿機打漿，60℃攪拌提取2小時，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解2小時，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶1。酶解液用3000轉/分鐘離心機離心后，收集全部濾液，在80℃濃縮10小時。將濃縮后的浸提液置于冷凍機中冷凍2小時，溫度為2℃，然后減壓，使干燥壓降至40帕，干燥溫度為40℃，經12小時，得到白色多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。
實施例四取黑乳海參多糖100mg，用適量注射用水溶解，加甘露醇200mg，按照常規凍干工藝凍干，即得注射用凍干粉。用于治療腫瘤。
實施例五將黑乳海參多糖用適量注射用水分散，噴霧干燥或真空干燥，得黑乳海參多糖干粉。取聚乙二醇400，加入黑乳海參干粉，邊加邊攪拌至勻，采用壓制法，制成軟膠囊。用于治療腫瘤。
實施例六取黑乳海參多糖100g，用適量注射用水分散，加入輔料適量，混勻，制粒，干燥，壓成1000片，包衣，即得黑乳海參多糖片。用于治療腫瘤。
權利要求
1.一種從海洋動物黑乳海參中提取黑乳海參多糖的方法，其特征在于將黑乳海參與溶劑按比例混合，并用打漿機打漿，在一定的溫度下進行攪拌提取，提取液用雙酶水解，離心，收集并濃縮濾液。將濃縮液冷凍干燥，得到白色的多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。
2.按權利要求1所述的黑乳海參，其特征在于，可以是新鮮采集的黑乳海參，也可以是經過干燥后的黑乳海參。
3.按權利要求1所述的黑乳海參與溶劑按比例混合，在一定的溫度下攪拌提取，其特征在于，打漿的溶劑為3～7％的氫氧化鉀溶液，溶劑與黑乳海參混合的質量比為2∶1～6∶1。攪拌提取溫度為30～60℃，時間為1～3小時。
4.按權利要求1所述的雙酶水解，其特征在于在浸提液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解1～2小時，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶0.5～2.0。
5.按權利要求1所述的離心和濃縮，其特征在于用3000轉/分鐘離心機離心后，收集全部濾液，在50～80℃濃縮8～12小時。
6.按權利要求1所述的冷凍干燥，其特征在于將濃縮后的浸提液置于冷凍機中冷凍1～3小時，溫度為-1～10℃，然后減壓至20帕～200帕，干燥溫度為30～60℃，經8～12小時，得到白色多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。
7.一種按權利要求1所述的黑乳海參多糖在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種從海洋動物黑乳海參中提取純化多糖的工藝。其工藝流程是將黑乳海參粉碎后，與溶劑按比例混合，并用打漿機打漿，在一定的溫度下進行攪拌提取，提取液用雙酶水解，離心，收集并濃縮濾液。將濃縮液冷凍干燥，得到白色的多糖干性物質，即為黑乳海參多糖。實驗研究證明，黑乳海參多糖對人體腫瘤細胞K－562，SHG－44，HCT－8，PC－3M，A－549等細胞株的生長均有抑制作用；對S180荷瘤小鼠的腫瘤組織的生長也有較強的抑制作用。本發明中的黑乳海參多糖是一種作用較強的免疫促進劑，可制備成新的抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K31/715GK1986826SQ20061015546
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月26日 優先權日2006年12月26日
發明者巫軍 申請人:巫軍