專利名稱：玉足海參多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及玉足海參多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥目前已成為人類面臨的一大殺手，死亡率僅次于心血管疾病，而且呈逐年上 升的趨勢(shì)。目前的化學(xué)合成藥物雖然抗腫瘤作用確切，療效顯著，但有不良反應(yīng)大、長期應(yīng) 用易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，所以，人們迫切希望找到療效好且不良反應(yīng)低的藥物，我國的傳統(tǒng) 中藥在這方面顯示出了優(yōu)勢(shì)。近年來，廣大學(xué)者對(duì)中藥進(jìn)行了廣泛的研究。
侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤最基本的生物學(xué)特征，也是惡性腫瘤的致死主因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床 診斷出原發(fā)腫瘤時(shí)，約50%的患者已產(chǎn)生遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移，而目前的手術(shù)、放化療等方法對(duì)已多 灶性分布的惡性瘤的治療效果也不顯著，因此，尋找有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物對(duì)于防治腫瘤， 降低癌癥病死率具有重要意義。王光鳳等采用多種腫瘤模型，研究橘皮中提取的黃酮化合 物川陳皮素的抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，川陳皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率 為42. 24% 65. 95%，對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤率為38. 84% 59. 09% ；對(duì)小鼠S180肉 瘤的抑瘤率為36. 02% 45. 98%。川陳皮素與小劑量的紫杉醇、絲裂霉素、52氟尿嘧啶、 順鉬和阿霉素聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)。川陳皮素對(duì)小鼠Lewis肺癌腋皮下接種肺轉(zhuǎn) 移的抑制率為33. 63% 38. 94% ；對(duì)小鼠Colon26結(jié)腸癌腹腔接種腹膜轉(zhuǎn)移的抑制率為 37. 74% 43. 40%。(王光鳳，王小晨，肖磷，等.柑橘黃酮川陳皮素的抗腫瘤作用研究，中 草藥，2007,38(11) 1694-1697)蛇床子水提物、總香豆素及蛇床子素等單體成分抗腫瘤及 相關(guān)研究表明，蛇床子不僅本身抗腫瘤效價(jià)明顯，對(duì)腫瘤引起的免疫功能低下、炎癥反應(yīng)及 癌性疼痛具有一定的治療價(jià)值，在腫瘤的預(yù)防及治療中配合放化療，對(duì)于克服腫瘤的多藥 耐藥以及減毒增效作用都有積極的意義。蛇床子不僅有明顯的抗誘變活性，其本身也沒有 致突變性和致瘤性，并且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(周則衛(wèi)，劉培勛.蛇床子化 學(xué)成分及抗腫瘤活性的研究進(jìn)展，中國中藥雜志，2005,30(17) 1309-1312)但以上研究都 只能對(duì)某種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，研究還不夠深入。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供玉足海參多糖的制備方法。技術(shù)方案一、玉足海參多糖的制備將海參洗凈，放入研缽，加入液氮(15mL/g)，迅速冷凍，將凍塊壓碎，轉(zhuǎn)移至研缽研 磨，邊研磨邊加液氮，直至成細(xì)末(150目)；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，應(yīng) 用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，冷凍干燥分為預(yù)凍、升華和二次升華三個(gè)階段，預(yù)凍階段將箱內(nèi) 溫度降至_38°C至_42°C，維持6小時(shí)；升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整 個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在15-20帕之間，溫度在20-30分鐘升至1_3°C，維持16-18小時(shí)； 二次升華階段將溫度升至22-28°C，維持8-12小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉，制成玉足海參多糖凍干粉。優(yōu)選方法為上述玉足海參多糖的制備方法，預(yù)凍階段先將冷凍干燥箱內(nèi)溫度降 至-40°C，維持7小時(shí)；升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓 強(qiáng)設(shè)置在18帕，溫度在25分鐘時(shí)升至2V，維持17小時(shí)；二次升華階段將溫度升至25°C， 維持10小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉。
二、玉足海參粘多糖(HS)對(duì)自發(fā)性B16F10黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞清潔級(jí)C57BL/6小鼠(雌性，6_8周齡，16_20g)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公 司，許可證號(hào)SCXK (滬)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤細(xì)胞株，南京大學(xué)徐強(qiáng)教授惠贈(zèng)。1.2實(shí)驗(yàn)藥物HS，常州海洋生物工程有限公司，批號(hào)060201。1.3實(shí)驗(yàn)試劑DMEM(美國GIBCO公司批號(hào)1340114)，PBS (實(shí)驗(yàn)室自制)，小牛血清(天津 市洋生物制品科技有限公司批號(hào):QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批號(hào)=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批號(hào)0105)，甲醛(上海久億化學(xué)試劑有限公司批號(hào)20070610)，生理 鹽水(上海華源長富藥業(yè)有限公司批號(hào)070405045)，NaHC03(南京化學(xué)試劑有限公司批 號(hào)050480039)，液體石蠟(上海久億化學(xué)試劑有限公司批號(hào)20040701)。1.4實(shí)驗(yàn)器材萊卡倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司型號(hào)DM1L)，精密移液器(法國吉爾森公 司型號(hào)P2)，全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào)MLS-3020)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集 團(tuán)安泰公司制造型號(hào)SW-CJ-ZFD)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司型號(hào)Nu-6511)，C02培 養(yǎng)箱(FORMA型號(hào)3111)，純水儀(美國Spring公司型號(hào)S/N 020579)，電子天平(德 國賽多利斯有限公司型號(hào)BT323S)，臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào) DHG9123A)，冰箱(西門子公司型號(hào)KG18V21TI)，液氮罐(CBS型號(hào):2001)，離心機(jī)(上海安 亭科學(xué)儀器廠型號(hào)KA-1000)，PH計(jì)(HANNA公司型號(hào)HI_221)，注射器。2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1體內(nèi)劑量的選擇實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)闡明HS具有抗凝活性，前期實(shí)驗(yàn)觀察HS對(duì)健康小鼠凝血時(shí) 間的影響，選取健康的ICR小鼠58只，隨機(jī)分成6組，HS組尾靜脈注射(41. 6mg/kg、10. 4mg/ kg、5. 2mg/kg、2. 6mg/kg和1. 3mg/kg)，對(duì)照組尾靜脈注射等體積的生理鹽水，采用玻片法 和毛細(xì)血管法兩種方法測(cè)定凝血時(shí)間，進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)HS以41. 6mg/kg劑量尾靜脈注射，5只 受試小鼠測(cè)得凝血時(shí)間均大于lOmin，除了 1.3mg/kg劑量組以外，其余各組與對(duì)照組相比 均有顯著性差異(P <0.01),結(jié)果如下表1-1 =HS對(duì)健康ICR小鼠凝血時(shí)間的影響(χ ± SD )Table 1-1 :The effect of HS on clotting time of health ICR mice ( 士 SD) 注與對(duì)照組相比，*P< 0.01。從結(jié)果可以看出，HS在劑量為2. 6mg/kg時(shí)已經(jīng)影響了凝血時(shí)間，改變了小鼠血 液流變學(xué)的某些過程，而HS的抗凝活性是我們選擇其作為研究其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移影響的基礎(chǔ)， 所以基于體內(nèi)抗凝劑量我們來確定本研究課題的體內(nèi)給藥劑量。由于荷瘤鼠狀態(tài)較差，而 且對(duì)于腫瘤模型的研究一般使用的是C57BL/6小鼠，此小鼠通體全黑，尾巴很細(xì)，尾靜脈不 容易找到且要持續(xù)給藥很長時(shí)間，所以我們采用腹腔注射給藥方式，將體內(nèi)最小劑量定為 5. 2mg/kg，最大劑量定為最小劑量的五倍，為26mg/kg，中劑量取兩者中間值定為11. 6mg/
kg ο2.2制備B16F10細(xì)胞懸液常規(guī)培養(yǎng)B16F10腫瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前4-5天，按1 10細(xì)胞傳代于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 以免細(xì)胞生長過度而出現(xiàn)不完全融合。每個(gè)培養(yǎng)瓶大約含6-8 X 106細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期的 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗凈，加入ImL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入細(xì)胞培養(yǎng) 箱中，l-3min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落。加IOmL DMEM，用移液管吹打細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸 液，轉(zhuǎn)入50mL聚丙烯離心管。離心細(xì)胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗兩遍。用苔盼藍(lán) 計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX107/mL。2. 3復(fù)制B16F10自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足墊皮下注射含5 X 105個(gè)B16F10細(xì)胞的懸液0. 05mL, 這些小鼠每五天稱一次體重。于接種后第八天按照左足墊上原發(fā)瘤的大小將小鼠隨機(jī)分 為四組模型組對(duì)照組(生理鹽水組)、HS低劑量組(5. 2mg/kg小鼠體重)、HS中劑量組 (11.6mg/kg小鼠體重)、HS高劑量組(26mg/kg小鼠體重)，每組動(dòng)物數(shù)為10只。從接種的 第九天開始各組腹腔注射給予相應(yīng)劑量的藥物，模型組給予相應(yīng)的生理鹽水，每日一次，直 至處死動(dòng)物，采集標(biāo)本。在接種后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福爾馬林固 定原發(fā)瘤組織，稱取原發(fā)腫瘤重量以及用直尺測(cè)量原發(fā)瘤的長軸(Li)和縱軸(L2)，按照以 下公式計(jì)算原發(fā)瘤的體積0. 5236XL1X (L2)2，最后用石蠟包埋用于免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察原 發(fā)位的血管生成以及各因子表達(dá)的情況。切除原發(fā)灶后22天處死小鼠，取出肺，避免鑷子 觸及臟器表面損傷組織，用PBS洗凈組織。10% PBS-福爾馬林固定肺組織，稱取肺重，拍照 并且在解剖顯微鏡下計(jì)算肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. IHS對(duì)B16F10黑色素瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型肺轉(zhuǎn)移的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，HS各 劑量組與對(duì)照組相比對(duì)黑色素瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均有抑制作用，且呈現(xiàn)劑 量相關(guān)性=HS 5. 2mg/kg 劑量組(P < 0. 05)、HS 11. 6mg/kg 劑量組(P < 0. 01)、HS 26mg/ kg劑量組(P < 0. 01)。對(duì)于肺重的影響，HS 26mg/kg劑量組的肺重明顯低于對(duì)照組的肺重(P <0.01)，其他兩組無明顯作用。3. 2HS對(duì)B16F10黑色素瘤原發(fā)位腫瘤體積和重量的影響從表1-2可以看出，與生理鹽水組相比，HS對(duì)于接種B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的小 鼠足墊部的原發(fā)位腫瘤無論是體積以及重量都沒有明顯的影響作用。從表1-2的小鼠給藥 前后的體重記錄可以得出，與對(duì)照組相比，HS給藥組的小鼠體重并未明顯低。表1-2 =HS對(duì)B16F10原發(fā)位腫瘤生長以及小鼠體重的影響(又士S. D.) 4.結(jié)論HS能夠抑制B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，而且也抑制轉(zhuǎn)移灶的生長，但是對(duì)原發(fā)腫瘤 細(xì)胞增殖沒有影響，從小鼠體重變化可以看出，HS的毒副作用很小，為今后體內(nèi)安全用藥提 供基礎(chǔ)。三、HS對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株B16F10黑色素瘤細(xì)胞株由南京大學(xué)徐強(qiáng)教授惠贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)在含有10%小牛血 清和2mg/mL NaHC03的DMEM培養(yǎng)液中；原代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)由本實(shí)驗(yàn)室從人 的臍靜脈中分離得到，方法是通過在37°C下用0. 25%胰酶對(duì)人臍靜脈消化8-10分鐘，將含 有內(nèi)皮細(xì)胞的胰蛋白酶液1200rpm離心10分鐘后，棄上清，加入培養(yǎng)液，吹打混勻制成細(xì)胞 懸液后種于培養(yǎng)瓶中。本課題使用的HUVEC均為2-7代，所用的培養(yǎng)液是含有LSGS的M199 培養(yǎng)液。1. 2實(shí)驗(yàn)藥物HS，常州海洋生物工程有限公司，批號(hào)060201。1. 3實(shí)驗(yàn)試劑DMEM(美國GIBCO公司批號(hào)1340114)，DPBS(實(shí)驗(yàn)室自制)，小牛血清(天津 市灝洋生物制品科技有限公司批號(hào)QWTC0701)，Trypsin(AMRESCC)公司批號(hào)2009/08)， EDTA (AMRESC0 公司批號(hào)0105)，LSGS (Cascade biologies 公司批號(hào)#070418_901)， M199(美國Sigma公司批號(hào):083K83581)，胎牛血清(美國GIBCO公司)，MTS (Promega公司 批號(hào)G111A 22258402)，PMS (AMRESC0公司批號(hào)0361)，NaHC03 (南京化學(xué)試劑有限公司批號(hào)050480039)。1. 4實(shí)驗(yàn)器材可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國MD公司型號(hào)SPECTRA MAX 190)，萊卡倒置 熒光顯微鏡(德國萊卡公司型號(hào)DM1L)，精密移液器(法國吉爾森公司型號(hào)P2)，全自動(dòng) 高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào)MLS-3020)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型 號(hào)SW-CJ-ZFD)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司型號(hào)Nu-6511)，CO2培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào) 3111)，純水儀(美國Spring公司型號(hào)S/N 020579)，電子天平(德國賽多利斯有限公司 型號(hào)BT323S)，臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)DHG9123A)，冰箱(西 門子公司型號(hào)KG18V21TI)，液氮 罐(CBS型號(hào)2001)，離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào) KA-1000)，pH 計(jì)(HANNA 公司型號(hào)HI_221)，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corningcostar 公司)，Tip 頭若干。2.實(shí)驗(yàn)方法MTS法測(cè)定HS對(duì)常規(guī)培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞和HUVEC增殖的影響，具體方法如下在 完全培養(yǎng)液中收集處于對(duì)數(shù)期生長的HUVEC細(xì)胞和B16F10細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于 96孔板，每孔200 μ L，5000個(gè)細(xì)胞/孔，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。對(duì) 于B16F10細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后棄上清，更換新鮮的培養(yǎng)液，180 μ L/孔并加入20 μ 1溶于DMEM 的各濃度HS藥液，HS的終濃度分別為0. 001 μ Μ，0. 01 μ Μ，0. 1 μ Μ，1 μ Μ，10 μ M禾口 100 μ Μ, 空白對(duì)照僅加入20 μ L DMEM，每組4個(gè)復(fù)孔，置搖床上低速振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)； 對(duì)于HUVEC細(xì)胞，貼壁后棄上清，先用M199培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞后加入含有1 %胎牛血清的 M199 (180 μ L/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后加入相應(yīng)的劑量的HS，使其終濃度分別為0. 08 μ Μ, 0. 4 μ Μ，2 μ Μ，10 μ M和50 μ Μ，每組5個(gè)復(fù)孔，再繼續(xù)培養(yǎng)30小時(shí)。在與相應(yīng)藥物共同孵育 相應(yīng)時(shí)間之后，加入40 μ L/孔MTS/PMS溶液，MTS的終濃度為333 μ g/mL, PMS的終濃度為 25 μ Μ,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后置搖床上低速振蕩lOmin，測(cè)量各孔在490nm處的吸光值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果為三次獨(dú) 立實(shí)驗(yàn)的平均值，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中將空白對(duì)照組所得出的吸光度均值歸一化設(shè)定為100%，HS 各劑量組的值就表達(dá)為％空白對(duì)照。3. IHS對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響100倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，與對(duì)照組相比，HS各劑量組對(duì)于B16F10細(xì)胞形態(tài) 均無明顯影響，但HSl μ MUO μ M和100 μ M劑量組的細(xì)胞密度明顯要比對(duì)照組的稀疏一些， 490nm處吸光度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，HS 1 μ M和10 μ M能抑制B16F10細(xì)胞增殖(P < 0. 05)，而 100 μ M HS 能明顯抑制 B16F10 生長(P < 0. 01)。3. 2HS對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響從測(cè)得的吸光度以及100倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HS在濃度高達(dá)50 μ M時(shí)會(huì)對(duì)HUVEC 細(xì)胞的正常生長有明顯的抑制作用(P < 0.01)，其他各劑量組無論從形態(tài)上還是實(shí)際測(cè)得 的吸光度對(duì)HUVEC細(xì)胞的正常生長均無顯著的影響。4.結(jié)論從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不難看出，共同孵育30小時(shí)之后，HS在低于50 μ M對(duì)HUVEC細(xì)胞的 正常生長并未產(chǎn)生任何的抑制作用，提示在本課題之后使用HUVEC細(xì)胞來研究HS抗血管生成作用時(shí)HS的劑量不應(yīng)超過50 μ M且HS的作用時(shí)間應(yīng)在30小時(shí)之內(nèi)，而對(duì)于B16F10細(xì)胞 所使用的劑量應(yīng)低于1 μ Μ,且作用時(shí)間不超過24小時(shí)，為后面體外實(shí)驗(yàn)劑量的確定提供依 據(jù)。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以看出，劑量大于ΙμΜ就能夠抑制B16F10生長，但對(duì)于正常細(xì)胞HUVEC 細(xì)胞的生長，HS劑量高達(dá)50 μ M才會(huì)產(chǎn)生抑制作用，說明HS對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力要明顯強(qiáng) 于正常細(xì)胞。四、HS對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移影響1.實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞清潔級(jí)C57BL/6小鼠(雌性，6_8周齡，16_20g)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公 司，許可證號(hào)SCXK (滬)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤細(xì)胞株，南京大學(xué)徐強(qiáng)教授惠贈(zèng)。1. 2實(shí)驗(yàn)藥物HS，常州海洋生物工程有限公司，批號(hào)060201。1. 3實(shí)驗(yàn)試劑DMEM(美國GiBCO公司批號(hào)1340114)，PBS(實(shí)驗(yàn)室自制)，小牛血清(天津市 灝洋生物制品科技有限公司批號(hào):QWTC0701), Trypsin (AMRESC0公司批號(hào)2009/08), EDTA(AMRESC0公司批號(hào)0105)，甲醛(上海久億化學(xué)試劑有限公司批號(hào)20070610)，生理 鹽水(上海華源長富藥業(yè)有限公司批號(hào)070405045)，NaHCO3(南京化學(xué)試劑有限公司批 號(hào)050480039)。1. 4實(shí)驗(yàn)器材萊卡倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司型號(hào)DM1L)，精密移液器(法國吉爾森公 司型號(hào)P2)，全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào)MLS-3020)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集 團(tuán)安泰公司制造型號(hào)SW-CJ-ZFD)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司型號(hào)Nu-6511)，CO2培 養(yǎng)箱(FORMA型號(hào)3111)，純水儀(美國Spring公司型號(hào)S/N 020579)，電子天平(德 國賽多利斯有限公司型號(hào)BT323S)，臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào) DHG9123A)，冰箱(西門子公司型號(hào)KG18V21TI)，液氮罐(CBS型號(hào):2001)，離心機(jī)(上海安 亭科學(xué)儀器廠型號(hào)KA-1000)，PH計(jì)(HANNA公司型號(hào)HI_221)，注射器。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1制備細(xì)胞懸液常規(guī)培養(yǎng)B16F10腫瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前4-5天，按1 10，細(xì)胞傳代于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 以免細(xì)胞生長過度而出現(xiàn)不完全匯合。每個(gè)培養(yǎng)瓶大約含6-8 X 106細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期的 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗凈，加入ImL 0. 25%胰酶-0. 02% EDTA消化液，放入細(xì)胞培養(yǎng) 箱當(dāng)中，l-3min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落。加IOmL DMEM，用移液管吹打細(xì)胞，獲得單細(xì)胞 懸液，轉(zhuǎn)入50mL聚丙烯離心管。離心細(xì)胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗兩遍。用苔盼 藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2. 5 X 106個(gè)/mL。2. 2復(fù)制B16F10實(shí)驗(yàn)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾靜脈注射0. 2mL細(xì)胞懸液(含5X 105腫 瘤細(xì)胞)。接種過腫瘤細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為4組模型組對(duì)照組(生理鹽水)，HS低劑量 組(5. 2mg/kg)，HS中劑量組(11. 6mg/kg)，HS高劑量組(26mg/kg)，腹腔注射給藥，每日一 次。給藥23天，處死小鼠，取肺臟。避免鑷子觸及臟器表面，防止損傷組織，用PBS洗凈組織。10% PBS-福爾馬林固定肺組織，稱取肺重，拍照，評(píng)價(jià)HS對(duì)B16F10腫瘤血行肺轉(zhuǎn)移的影響。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件學(xué)生t檢驗(yàn)，從各組取出的肺組織可以看出，模型組的肺組織轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目顯著多于給藥組，由于肺結(jié)節(jié)太多，無法計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)肺重的統(tǒng) 計(jì)分析表明，HS高劑量組(26mg/kg)和中劑量組(11.6mg/kg)均能抑制小鼠肺組織重量，P 值分別為P < 0. 01和P < 0. 05。HS給藥前后小鼠體重差異不大，且與對(duì)照組相比，小鼠體 重未發(fā)現(xiàn)有大幅度減少，各組的死亡率顯示，HS藥物對(duì)于小鼠的體內(nèi)毒性較小。4.結(jié)論HS給藥組小鼠的死亡率與對(duì)照組相當(dāng)，而且體重與給藥前也沒有明顯的減少，說 明HS的毒副作用很小，HS可以很好的抑制實(shí)驗(yàn)性B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，HS對(duì)于B16F10 細(xì)胞直接入血之后的血行過程，黏附過程以及穿出血管過程有一定的抑制作用。有益效果玉足海參粘多糖是從廣東省、海南島一帶的民間海洋生物玉足海參Hojothuria leucospilota中提取出的一種酸性粘多糖，性微寒，味甘、成。歸肺、腎、大腸經(jīng)。具有補(bǔ)腎 益精；養(yǎng)血潤燥；止血的功效，主治精血虧損；虛弱勞怯；陽痿；夢(mèng)遺；腸燥便秘；肺虛咳嗽 咯血，腸風(fēng)便血，外傷出血。現(xiàn)代藥理學(xué)研究，玉足海參粘多糖具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。將海參用普通烘箱80°C烘干后打粉，測(cè)定其中海參粘多糖的含量為2.5%，而采 用液氮冷凍，并凍干后的海參粘多糖的含量為4. 8%。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明如下海參為海洋生物玉足海參 Ho jothurialeucospilota。實(shí)施例1取海參5g，洗凈，放入研缽，加入液氮75mL，迅速冷凍，將凍塊壓碎，轉(zhuǎn)移至研缽研 磨，邊研磨邊加液氮，直至成150目細(xì)末；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，應(yīng)用 冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，冷凍干燥分為預(yù)凍、升華和二次升華三個(gè)階段，預(yù)凍階段將箱內(nèi)溫 度降至_38°C，維持6小時(shí)；升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)抽真 空，壓強(qiáng)設(shè)置在15-20帕之間，溫度在20-30分鐘升至;TC，維持16-18小時(shí)；二次升華階段 將溫度升至22°C，維持8-12小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉，制成玉足海參多糖凍干粉。實(shí)施例2取海參5g，洗凈，放入研缽，加入液氮75mL，迅速冷凍，將凍塊壓碎，轉(zhuǎn)移至研缽研 磨，邊研磨邊加液氮，直至成150目細(xì)末；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，應(yīng)用 冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，冷凍干燥分為預(yù)凍、升華和二次升華三個(gè)階段，預(yù)凍階段先將冷凍干 燥箱內(nèi)溫度降至-40°C，維持7小時(shí)；升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系 統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在18帕，溫度在25分鐘時(shí)升至2°C，維持17小時(shí)；二次升華階段將溫 度升至25°C，維持10小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉。實(shí)施例3一種玉足海參多糖的制備方法，將海參洗凈后用液氮冷凍成塊狀，將凍塊壓碎后轉(zhuǎn)移至研缽研磨，邊研磨邊加液氮，直至磨成細(xì)末；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶 中，應(yīng)用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥預(yù)凍階段先將冷凍干燥箱內(nèi)溫度降至_38°C，維持8小時(shí)； 升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在15帕，溫度 在20分鐘升至1°C，維持18小時(shí)；二次升華階段將溫度升至22°C，維持12小時(shí)，制成玉足 海參多糖凍干粉。實(shí)施例4
一種玉足海參多糖的制備方法，將海參洗凈后用液氮冷凍成塊狀，將凍塊壓碎后 轉(zhuǎn)移至研缽研磨，邊研磨邊加液氮，直至磨成細(xì)末；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶 中，應(yīng)用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥預(yù)凍階段先將冷凍干燥箱內(nèi)溫度降至_42°C，維持5小時(shí)； 升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在20帕，溫度 在20分鐘升至3°C，維持16小時(shí)；二次升華階段將溫度升至28°C，維持8小時(shí)，制成玉足 海參多糖凍干粉。
權(quán)利要求
一種玉足海參多糖的制備方法，其特征在于將海參洗凈后用液氮冷凍成塊狀，將凍塊壓碎后轉(zhuǎn)移至研缽研磨，邊研磨邊加液氮，直至磨成細(xì)末；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，應(yīng)用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥a.預(yù)凍階段先將冷凍干燥箱內(nèi)溫度降至-38℃至-42℃，維持5～8小時(shí)；b.升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到-38℃以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在15～20帕之間，溫度在20-30分鐘升至1～3℃，維持16～18小時(shí)；c.二次升華階段將溫度升至22～28℃，維持8～12小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述玉足海參多糖的制備方法，其特征在于所述預(yù)凍階段先將冷 凍干燥箱內(nèi)溫度降至-40°C，維持7小時(shí)；升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到_38°C以下時(shí)，對(duì)整 個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在18帕，溫度在25分鐘內(nèi)升至2°C，維持17小時(shí)；二次升華階段 將溫度升至25°C，維持10小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉。
全文摘要
一種玉足海參多糖的制備方法，將海參洗凈后用液氮冷凍成塊狀，將凍塊壓碎后轉(zhuǎn)移至研缽研磨，邊研磨邊加液氮，直至磨成細(xì)末；將研磨好的玉足海參細(xì)末轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，應(yīng)用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥預(yù)凍階段先將冷凍干燥箱內(nèi)溫度降至-38℃至-42℃，維持5～8小時(shí)；升華階段當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到-38℃以下時(shí)，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)抽真空，壓強(qiáng)設(shè)置在15～20帕之間，溫度在20-30分鐘升至1～3℃，維持16～18小時(shí)；二次升華階段將溫度升至22～28℃，維持8～12小時(shí)，制成玉足海參多糖凍干粉。將海參用普通烘箱80℃烘干后打粉，測(cè)定其中海參粘多糖的含量為2.5％，而采用液氮冷凍，并凍干后的海參粘多糖的含量為4.8％。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101863997SQ20101018049
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者張偉偉, 徐波, 王愛云, 鄭仕中, 陸茵, 陳磊, 雷娜 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)