專利名稱：：一種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于物質成份
技術領域：
，具體涉及一種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法。
背景技術：
：苦馬豆素是瘋草中的主要有毒成分，動物長期采食瘋草能夠引起以中樞神經機能紊亂為特征的中毒性疾病，由于瘋草在世界范圍內廣泛分布，是危害草原畜牧業(yè)最嚴重的毒草，備受關注。同時，苦馬豆素是溶酶體內α-甘露糖甙酶的抑制劑，近年來作為一種嶄新的抗癌藥物得到極大的關注，其特點在于既具有殺傷癌細胞的作用又具有免疫調節(jié)作用，從而抑制腫瘤的生長和轉移[1]。目前，瘋草中毒機理的研究需要大量的苦馬豆素，同時，苦馬豆素做為抗癌藥物廣闊的應用前景，而苦馬豆素在瘋草中含量低，極性大，不易分離、純化，國內外學者一直致力于苦馬豆素的提取和純化技術的研究，并取得了一些突破性的進展。Colegate[2]等首次報道分離苦馬豆素的方法是，用熱乙酸乙脂索氏提取24h，水溶部分上強酸性陽離子交換柱，收集稀氨水洗脫部分，濃縮后的殘留物上藥用瓊脂糖凝膠CL-6B，用氯化鈉梯度洗脫，產物用氨性氯仿提取，回收溶劑后用氯仿/乙醚結晶和重結晶，得到白色針狀結晶。在國內，曹光榮[3]等報道的方法是，將植物樣品用酸水浸泡2次，每次12h，酸濾液過陽離子交換柱，濃縮洗脫液中的總生物堿?？偵飰A經硅膠柱層析，TLC結合α-甘露糖甙酶活性抑制試驗結果監(jiān)測，合并同類并濃縮，分離出苦馬豆素單體。此外黃有德等(1992)[4]從變異黃芪中分離出苦馬豆素，趙寶玉等(1993)[5]從莖直黃芪中分離出苦馬豆素。并且童德文等(2001)[6]從甘肅棘豆中提取苦馬豆素。以上報道的苦馬豆素提取方法都采用柱層析法，步驟煩瑣，使用試劑多，費時費力，不適合大批量生產。李勤凡等(2005)[7]，劉志濱等(2006)[8]用萃取的方法提取甘肅棘豆中的苦馬豆素，步驟比傳統(tǒng)的方法簡便，但用水從植物中提取，提取液體積大，不宜蒸干水分。在化學合成苦馬豆素方面國外已有許多報道，美國化學家Yasuda和Bennet化學合成苦馬豆素共用21步[9]，迄今，最簡單的合成方法也需用9步才完成，并且合成過程中使用到一些價格昂貴或毒性強的試劑，使大量生產受限[10]。因此，目前市場上雖可以購買到毫克級的苦馬豆素，但價格十分昂貴，該項試驗通過改進現(xiàn)有提取工藝流程，用萃取法代替柱層析法，探索一種簡便易行的提取方法。發(fā)明人在研究過程中檢索到的主要參考文獻1.ColegateSM，DorlingPR，HuxtableCR.Aspectroscopicinvestiga-tionofswainsonineanα-mannosidaseinhibitorisolatedfromswainsinecanecens[J].AustJChem，1979，(32)2257～22642.曹光榮，李紹君，段得賢，等.黃花棘豆有毒成分的分離與鑒定[J].西北農業(yè)大學學報，1989，17(3)1～63.黃有德，肖志國，孟聚誠，等.變異黃芪有毒成分的分離與分析[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1992，6(4)3～64.趙寶玉.瘋草(甘肅棘豆)生物堿系統(tǒng)分析及其毒性的比較病理研究[D][博士學位論文].陜西楊凌西北農林科技大學，2001.125.鄒恒琴，徐峰，張忠義，等.一種具有前景的抗癌藥苦馬豆素的研究進展[J].中草藥，1997，28(7)437~4396.童德文，曹光榮.甘肅棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)，2001，29(3)5～88.李勤凡，王建華，劉志斌等.萃取法提取甘肅棘豆中的苦馬豆素研究初報[J]，中國農學通報，2005，21(5)143～1459.劉志濱，趙興華，余永濤等.甘肅棘豆中苦馬豆素提取工藝改進初報，西北農林科技大學學報(自然科學版)，2006，34(1)97～1047.DaleR.Gardner，RussellJ，etal.Analysisofocoweeds(Oxytropisspp.)[J].Agric.FoodChem.2001，49，4573～458010.PearsonWH，HembreEJ.Apracticalsynthesisof(-)-swainsonine[J].JOrgChem，1996.617217～7221
發(fā)明內容針對現(xiàn)有技術中存在的缺陷與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法。該方法操作簡便、生產成本低、提取率提高，適宜大批量生產。實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方案是一種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法，包括下列操作步驟1)將瘋草草粉和乙醇按1∶6～10的比例熱回流提取3次，每次4h，過濾，回收乙醇，殘留物用3～5倍乙醇反復溶解，直到液體變?yōu)榈S色，再回收乙醇，得到浸膏。2)浸膏中加入濃度為2％醋酸溶解酸化至pH為4.5～6之間，再加入浸膏重量50～100倍的氯仿，回收氯仿層；酸水部分再用50倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水經50～60℃的通風干燥，得到粗生物堿。3)粗生物堿加入濃度為1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物堿加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反復萃取至液體顏色變淡，再加氨水至殘余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收萃二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品。4)苦馬豆素粗品用甲醇溶解，移入升華管中，揮干甲醇，升華管置于115～120℃的油鍋中，先常壓10～20min升華，再減壓至0.1MP左右升華，30～50min左右的得到白色的針狀結晶結晶物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的提取方法具有以下優(yōu)點1.本方法采用乙醇提取，容易回收，無毒副作用。2.同時在堿水中加入了甲醇后萃取，使萃取效率提高。3.苦馬豆素浸膏的提取中常用氯仿萃取，本方法改用極性更大的二氯甲烷萃取，減少了萃取物中脂溶性的雜質，并且二氯甲烷的毒性比氯仿小，減小了環(huán)境污染。4.該項試驗所采用的技術，不需經過層析柱或離子交換柱，所用試劑品種少，并且都可以回收再利用，試驗流程簡單，容易操作，提取率高，是一種簡便易行的方法，適合于大批量生產。5.目前研究中常用減壓升華的方法。而苦馬豆素容易升華，當浸膏達到一定干燥程度，升華管底浸入100℃石蠟油中，針狀結晶就會出現(xiàn)在底部2cm升華管壁上。該項試驗采用先常壓再減壓升華的方法，可以減少升華中苦馬豆素的損失。下面結合附圖對本發(fā)明的從瘋草中提取苦馬豆素的新方法的做進一步的說明。圖1是從瘋草中提取苦馬豆素的新方法的工藝流程框圖。圖2提取的苦馬豆素與標準品的出峰時間相同對照圖。圖3苦馬豆素的IR光譜數(shù)據(jù)圖。圖4苦馬豆素的MS光譜數(shù)據(jù)圖。圖5苦馬豆素的1H光譜數(shù)據(jù)圖。圖6苦馬豆素的13C光譜數(shù)據(jù)據(jù)圖。具體實施例方式為了容易理解本發(fā)明，以下結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明以分布廣泛，儲量豐富，并且可以再生的瘋草為材料，根據(jù)苦馬豆素極性大、分子量小、不易提取等特性，采用二氯甲烷萃取提取出苦馬豆素粗品，用先常壓后減壓的升華措施得到苦馬豆素純品。1操作工藝流程參見圖11)瘋草草粉按草粉∶乙醇＝1∶6～10的比例熱回流提取3次，每次4h，過濾，回收乙醇，殘留物用草粉6～10倍量乙醇反復溶解，直到液體變?yōu)榈S色，再回收乙醇，得到浸膏。2)浸膏中加入濃度為2％醋酸溶解酸化至pH為4.5～6之間，再加入浸膏重量10～20倍的氯仿，回收氯仿層；酸水部分再用10倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水經50～60℃的通風干燥，得到粗生物堿。3)粗生物堿加入濃度為1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物堿加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反復萃取至液體顏色變淡，再加氨水至殘余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收萃二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品。4)苦馬豆素粗品用甲醇溶解，移入升華管中，揮干甲醇，升華管置于115～120℃的油鍋中，先常壓10～20min升華，再減壓至0.1MP左右升華，30～50min左右的得到白色的針狀結晶結晶物?？囫R豆素為白色針狀晶體，熔點為143～145℃。純度≥98％，GC，IR，MS，NMR光譜數(shù)據(jù)與苦馬豆素標準光譜數(shù)據(jù)完全吻合，具體見附圖2-。圖2提取的苦馬豆素與標準品的出峰時間相同，為1.67h。圖3苦馬豆素的IR光譜數(shù)據(jù)IRmax(KBr，cm-1)3423(O-H)，2943，2891(C-H)，2828～2724(Bohlmann帶)，1072(C-O)吸收峰。圖4苦馬豆素的MS光譜數(shù)據(jù)EI-MSm/e173(M+)，155(M-H2O)，138(M-H2O-OH)，116(M-2H2O-OH)，115，96，84，72，43圖5苦馬豆素的1H光譜數(shù)據(jù)1HNMR(400M，D2O，ppm)δ4.340(m，J＝2.0and8.0Hz，H-2)，δ4.245(dd，J＝4.0and5.6Hz，H-1)，δ3.792(td，J＝4.4and10.4Hz，H-8)，δ2.896(m，H-5eq)，δ2.868(dd，J＝2.0and8.0Hz，H-3eq)，δ2.543(dd，J＝8.0and11.2Hz，H-3ax)，δ2.031(m，H-7eq)，δ1.945(m，H-8a)，δ1.918(m，J＝3.6and12.8Hz，H-5ax)，δ1.708(br，d，J＝13.6Hz，H-6eq)，δ1.504(qt，J＝4and13.2Hz，H-6ax)，δ1.228(qd，J＝4and12.8Hz，，H-7ax)圖6苦馬豆素的13C光譜數(shù)據(jù)13CNMR(400M，D2，ppm)δ75.1(C-2)，δ72.0(C-1)，δ71.4(C-8)，δ68.7(C-8a)，δ62.9(C-3)，δ54.0(C-5)，δ34.8(C-7)，δ25.5(C-6)。實施例1冰川棘豆中苦馬豆素的提取1浸膏的提取1Kg冰川棘豆草粉加入6L乙醇提取3次，每次4h，過濾，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，殘留物用6L乙醇溶解，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇得到浸膏420.5g。2)每40g的浸膏中加入2％醋酸和500mL氯仿，收集氯仿層，回收氯仿；酸水部分再用500mL氯仿萃取2次，酸水液置于20×20cm的玻璃烤盤中，50℃的通風烘箱中烘干水分，共得到得到粗生物堿51.8g。3)粗生物堿用1M氨水溶解，加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷萃取，殘余物再用氨水溶解，二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品0.6g。4)苦馬豆素粗品用甲醇溶解，移入升華管中，揮干甲醇，升華管置于115℃的油鍋中，先常壓后減壓升華，1h左右白色的針狀結晶出現(xiàn)在升華頭，放置冷卻到室溫，刮去結晶物，共得到26mg結晶物。實施例2甘肅棘豆中苦馬豆素的提取1浸膏的提取2Kg甘肅棘豆草粉加入14L乙醇提取3次，每次4h，過濾，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，殘留物用14L乙醇溶解，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇得到浸膏968.8g。2)每50g的浸膏中加入2％醋酸和1000mL氯仿，收集氯仿層，回收氯仿；酸水部分再用500mL氯仿萃取2次，酸水液置于20×20cm的玻璃烤盤中，60℃的通風烘箱中烘干水分，共得到得到粗生物堿131.5g。3)將131.5g粗生物堿用1M氨水溶解，加入2mL10％NaOH，10mL甲醇后，用二氯甲烷萃取，殘余物再用氨水溶解，二氯甲烷萃，回收二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品1.5g。4)苦馬豆素粗品用甲醇溶解，移入升華管中，揮干甲醇，升華管置于118℃的油鍋中，先常壓后減壓升華，1h左右白色的針狀結晶出現(xiàn)在升華頭，放置冷卻到室溫，刮去結晶物，共得到66mg結晶物。實施例31浸膏的提取2Kg甘肅棘豆草粉加入20L乙醇提取3次，每次4h，過濾，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，殘留物用12L乙醇溶解，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇得到浸膏968.8g。2)每50g的浸膏中加入2％醋酸和1000mL氯仿，收集氯仿層，回收氯仿；酸水部分再用500mL氯仿萃取2次，酸水液置于20×20cm的玻璃烤盤中，60℃的通風烘箱中烘干水分，共得到得到粗生物堿131.5g。3)將131.5g粗生物堿用1M氨水溶解，加入2mL10％NaOH，10mL甲醇后，用二氯甲烷萃取，殘余物再用氨水溶解，二氯甲烷萃，回收二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品1.5g。4)苦馬豆素粗品用甲醇溶解，移入升華管中，揮干甲醇，升華管置于120℃的油鍋中，先常壓后減壓升華，1h左右白色的針狀結晶出現(xiàn)在升華頭，放置冷卻到室溫，刮去結晶物，共得到66mg結晶物。權利要求1.一種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法，其特征在于，包括下列操作步驟1)將瘋草草粉和乙醇按1∶6～10的比例熱回流提取3次，每次4h，過濾，回收乙醇，殘留物用3～5倍乙醇反復溶解，直到液體變?yōu)榈S色，再回收乙醇，得到浸膏；2)浸膏中加入濃度為2％醋酸溶解酸化至pH為4.5～6之間，再加入浸膏重量50～100倍的氯仿，回收氯仿層；酸水部分再用50倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水經50～60℃的通風干燥，得到粗生物堿；3)粗生物堿加入濃度為1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物堿加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反復萃取至液體顏色變淡，再加氨水至殘余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收萃二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品；4)苦馬豆素粗品用甲醇溶解，移入升華管中，揮干甲醇，升華管置于115～120℃的油鍋中，先常壓10～20min升華，再減壓至0.1MP左右升華，30～50min左右的得到白色的針狀結晶物。全文摘要本發(fā)明公開了從瘋草中提取苦馬豆素的新方法，將瘋草粉與乙醇按1∶6～10的比例熱回流提取3次，每次4h，過濾，回收乙醇，殘留物用3～5倍乙醇反復溶解回收乙醇，得到浸膏加入濃度為2％醋酸至pH為4.5～6之間，再加入浸膏重量50～100倍的氯仿，回收氯仿層；酸水部分用50倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水經50～60℃干燥，得到粗生物堿加入濃度為1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物堿加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反復萃取至液體顏色變淡，加氨水至殘余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，得到苦馬豆素粗品用甲醇溶解，揮干甲醇，升華即得白色針狀結晶物。該方法容易操作且提取率高。文檔編號A61K36/185GK101050214SQ20071001784公開日2007年10月10日申請日期2007年5月14日優(yōu)先權日2007年5月14日發(fā)明者李勤凡,蒿彩菊,王建華,劉志濱申請人:西北農林科技大學