專利名稱：：一種解聚海參糖胺聚糖組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥
技術領域：
，具體而言，本發明涉及一種分子量為8000Da至12000Da解聚海參糖胺聚糖組合物及其制備方法，以及含有該聚海參糖胺聚糖組合物的藥物及其在預防和治療心腦血管疾病方面的應用。
背景技術：
：隨著人口老齡化程度的提高，心腦血管疾病已經成為人類健康的最大威脅。據報道心腦血管疾病是老年人三大主要死因之一，目前因心腦血管疾病死亡者占總死亡人數的34％，在存活中越3/4左右的患者有不同程度的勞動能力和生活自理能力的喪失。而缺血性中風是心腦血管中最常見的一種疾病，占腦血管病的43-65％，該疾病發病病率高、病死率高、致殘率高、復發率高，嚴重的危害著人類生存和生活質量。中風病世界人口標化發病率為239.4/10萬，其中缺血性中風占53.6％。隨著人口老齡化和人類生活方式的變化，其發病率還有逐年增長的趨勢。心腦血管疾病已成為人類死亡的頭等原因，因此積極開展預防該疾病的藥物研制和開發迫在眉睫。目前，臨床中用于抗凝作用的藥物主要以下幾類1、肝素(UFH)肝素是一種常用的抗凝劑，用于預防和治療血栓疾病已有十幾年的歷史。肝素在體內和體外均具有抗凝作用，其通過與血漿中的抗凝血酶III(AT-III)結合成復合物來抑制凝血酶的凝血作用，但肝素本身并不能溶解已經形成了的血栓。另外，靜脈注射肝素時還可以使脂蛋白質酶釋放和穩定，可以降低血漿甘油三酯。但是，肝素不是理想的抗凝劑，臨床應用上有很多局限性。肝素可產生一個威脅生命的并發癥，即肝素誘導的II型血小板減少癥(heparin-inducedthrombocytopenia-II，簡稱為HIT)，可以導致血栓栓塞性并發癥。如果，心臟手術后出現HIT，51％的病人可出現血栓栓塞性并發癥，死亡率為37％。2、肝素(LMWH)肝素是80年代初從標準肝素(Standardheparin，SH)或成為組分肝素(Unfractionatedheparin)中分離出來的分子量較小的肝素片斷，分子量的范圍一般為4000-7000。肝素雖然抗凝作用起效快，但是半衰期僅為1.5小時，且只能注射給藥，故僅用于心腦血管疾病的第一期治療。3、纖溶酶類藥物(PA)纖溶酶類藥物主要通過溶解血栓而廣泛應用于心腦血管血栓性疾病。但是由于纖溶酶原激活可導致腦血管基質降解和神經毒性的作用，使PA類藥物的應用受到了挑戰。4、水蛭素(Hirudin)天然水蛭素是水蛭口腔腺體分泌物中含有的抗凝血物質。它不需要輔助因子，不依賴于AT-III，能夠阻滯與血凝塊結合的凝血酶的活性。但是目前臨床上還沒有直接對抗其作用的拮抗劑，而且臨床用量大(250mg/支)，價格昂貴，加重了患者的負擔。5、前列腺素E1(PGE1)PGE1可減少單核細胞的組織因子表達及活性血小板表面凝血因子的表達，因而可作為一種抑制外源性凝血途徑的抗凝血酶藥物使用，但是PGE1應用的一個主要問題是其血管舒張效應，有可能導致血壓明顯下降。除了以上已經投入藥用的物質，人們也很關注提取自海參的糖胺聚糖及其衍生物的抗凝血作用。中國專利申請CN1440985A公開了可提取自海參的多糖的制備方法，制備出的海參多糖合物中的多糖分子量大，而且還難以將糖胺聚糖中混有的海參巖藻糖除去，質量難以達到藥用標準。為此，中國專利申請CN1579415A和HidekiNagase等人(可參見ThrombRes；2003，112(1-2)83-91；KidneyInt.，2003，63(4)1548-55；ThrombHaemost.，1997，77(6)1148-53；ThrombHaemost.，1997，77(2)399-402；ThrombRes.，1996，15；84(2)111-20；ThrombRes.，1996，83(3)253-64；JBiochem(Tokyo).，1996，119(1)63-9；Blood.，1995，85(6)1527-34，這些文獻的全文均納入本文參考)分別通過進一步解聚來自海參的糖胺聚糖來獲得分子量分布在10000Da至15000Da范圍內的解聚海參糖胺聚糖組合物，這樣的組合物可以在一些體內或體外實驗中起到替代肝素等藥物的抗凝血作用，然而這些文獻沒有充分的實驗證據表明這些組合物的藥用安全性，更沒有提示平均分子量更低的解聚海參糖胺聚糖組合物作為抗凝血藥物預防和治療的安全性和有效性。另外，目前努力中的分子量大的海參糖胺聚糖藥物還存在著容易引起血小板聚集等副作用有待于解決。
發明內容本發明為解決
背景技術：
中存在的上述技術問題，而提供一種、療效確切且出血副作用小的分子量為8000Da至12000Da解聚海參糖胺聚糖組合物及其制備方法，以及含有該解聚海參糖胺聚糖組合物的心腦血管疾病的藥物。本發明的技術解決方案是本發明為一種解聚海參糖胺聚糖組合物，其含有90-99.89％重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖。一種制備上述的解聚海參糖胺聚糖組合物的方法，包括如下步驟1)從海參中提取海參多糖；2)降解提取出的海參多糖；3)收集重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖組合物。其中步驟1)中的海參選自花刺參、梅花參、綠刺參、玉足海參和黑海參，優選為黑海參。其中步驟1)從海參中提取海參多糖的步驟包括對海參進行絞碎、酶解并沉淀獲得海參多糖粗品，然后對海參多糖粗品純化、脫色，得到海參多糖。其中步驟1)中的酶解是用堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行酶解；對海參多糖粗品純化是用DEAE-纖維素柱進行純化。其中步驟2)降解提取出的海參多糖的步驟包括在5％雙氧水的條件下，將提取的海參多糖降解成重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖組合物。其中步驟3)是用凝膠過柱來收集解聚海參糖胺聚糖組合物。其中步驟3)收集的解聚海參糖胺聚糖組合物的多分散度小于2，優選小于1.5，更優選小于1.4。其中步驟3)后還包括冷凍干燥的步驟。一種的藥物組合物，其包括解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體。其中藥物組合物為注射劑時低分子解聚海參糖胺聚糖組合物的含量為0.03-2.5％(重量)，優選為1％(重量)；藥物組合物為口服制劑時每片含低分子解聚海參糖胺聚糖組合物50-200mg，優選為100mg。其中藥物組合物為凍干粉針劑時，藥學上可接受的載體選自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種；藥物組合物為口服制劑時，藥學上可接受的載體選自淀粉、乳糖、微晶纖維素、交聯PVP和羧甲基淀粉鈉中的一種或幾種。藥物組合物在預防和/或治療心腦血管疾病中的應用。其中心腦血管疾病是凝血性和血栓性疾病，優選是缺血性腦血管疾病或血栓性疾病，更優選是缺血性腦中風。發明人將傳統中藥的特點和優勢與現代醫學技術相結合，在現有技術的提示之外，獲得了一種制備解聚海參糖胺聚糖組合物的方法，并由此獲得了一種重均分子量介于8000Da至12000Da之間(相應地，數均分子量更低)的解聚海參糖胺聚糖組合物。經大量實驗研究表明，該組合物能安全、有效地預防和治療心腦血管疾病，尤其是用于預防和治療凝血性和血栓性疾病。具體而言，其抗凝效應可以被硫酸魚精蛋白(PS)所糾正，所以更能確保其使用中的安全性。此外，相對于肝素等當前臨床應用的藥物，本發明的解聚海參糖胺聚糖組合物的原料為海洋生物，資源豐富、價格低廉，解聚海參糖胺聚糖純度高；而且，其藥效突出，抗凝活性強，小劑量即可有效；抗凝機制不同于肝素，抗凝效應與劑量明顯相關，抗凝機理及安全性方面更優，可以作用于凝血瀑布多個環節，阻斷凝血瀑布的發展，在有效抗血栓形成同時而無顯著的出血副作用；另外，通過本發明明確了有效藥物成分并減少了不必要的無效成分，因此更容易控制生產成本和產品質量，作用機理明確，制劑穩定性高。圖1本發明的解聚海參糖胺聚糖組合物的純度圖。圖2本發明的解聚海參糖胺聚糖組合物的分子量分布圖譜。具體實施例方式海參是棘皮動物門海參綱動物，傳統上已經認識到其具有滋陰養血、溫經通絡、補生益精等功效。海參體壁內包含多糖物質，包括海參糖胺聚糖(Seacucumberglycosaminoglycan，簡稱為SC-GAG)和海參巖藻多糖(HolothurianFucan，簡稱為HF)，其中海參糖胺聚糖具有抗癌、提高免疫力、促進纖溶、降低血粘度、調節血脂、抗凝等多種生理活性，而且在抗凝方面海參糖胺聚糖較海參巖藻多糖具有更強的活性。優選本發明的海參選自花刺參、梅花參、綠刺參、玉足海參、糙海參和黑海參，尤其優選為黑海參。其中，黑海參產于我國南海海域，分布廣、資源量大、價格便宜、而且含糖量高，是最理想的原材料。本發明中所稱的“解聚海參糖胺聚糖組合物”指的就是提取自海參的含有海參糖胺聚糖的提取物，也就是指由海參多糖降解而產生的、包含解聚了的糖胺聚糖的組合物，從海參體壁提取海參多糖的方法是本領域技術人員所熟悉的，如韓慧敏等(海參多糖提取工藝研究。湖南中醫雜志，16(1)56-57)報道了制備海參多糖的方法，可以獲得高分子量的海參糖胺聚糖。為了克服血小板聚集等副作用并取得良好療效，本發明將海參多糖降解成為的解聚海參糖胺聚糖(depolymerizedholothurianglycosaminoglycan，簡稱為DHG)組合物。而且該組合物中解聚海參糖胺聚糖占總組合物重量的90％以上。優選解聚海參糖胺聚糖組合物中解聚海參糖胺聚糖占95％以上，為了達到理想的藥用效果，更優選占98％以上，更優選占99％以上，在本發明的一個具體實施方式中，解聚海參糖胺聚糖的純度達到了99.89％。本發明的解聚海參糖胺聚糖組合物中含有一種或一種以上分子量的海參解聚海參糖胺聚糖，其中所含有的海參解聚海參糖胺聚糖的重均分子量介于8000Da至12000Da之間。本文中的“重均分子量”是本領域技術人員所熟知的術語，指的是對高分子聚合物(對于本發明而言，尤其是解聚海參糖胺聚糖)中不同分子量進行個數和重量加權平均后得到的聚合物分子量的表征值。本發明的海參解聚海參糖胺聚糖組合物中所含有的海參解聚海參糖胺聚糖的重均分子量介于8000Da至12000Da之間，優選介于9000Da至11000Da之間，更優選介于9500Da至10500Da之間，在本發明的一個具體實施方式中，獲得的重均分子量為10000Da。要獲得符合分子量要求的解聚海參糖胺聚糖組合物可以通過收集相應分子量的解聚海參糖胺聚糖來實現，例如，可以通過嚴格地控制降解海參多糖的條件使解聚海參糖胺聚糖的分子量基本介于8000Da至12000Da之間，收集全部解聚海參糖胺聚糖；或者，可以在降解后只收集分子量基本介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖；也可以綜合使用以上兩種方式。本發明解聚海參糖胺聚糖制備方法中步驟(1)可以包括，對海參進行絞碎、酶解并沉淀獲得海參多糖粗品，然后對海參多糖粗品純化、脫色，得到海參多糖。其中，酶解優選是用堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行酶解。雙酶解法不但能提取組織中多糖成分，而且所得的多糖純度高，工藝條件緩和，廢棄物易處理。酶解提取液中，糖胺聚糖與蛋白質斷開，但溶液中仍然存在部分未被蛋白酶水解的蛋白質，可以根據蛋白質在等電點溶解度最小的特性，選擇適當的pH值，可以將部分蛋白質從溶液中沉淀出。動物組織中一般酸性蛋白遠多于堿性蛋白，調節溶液的pH至酸性，可以除去較多雜蛋白。沉淀可以通過有機溶劑進行沉淀，其中有機溶劑優選為乙醇。從海參體壁提取海參多糖的方法是本領域技術人員所熟悉的，如韓慧敏等(海參多糖提取工藝研究.湖南中醫雜志，16(1)56-57)報道了通過絞碎、酶解、沉淀和純化、脫色來制備海參多糖，其全文納入本文參考。在本發明中為更有效地收集分子量介于100000Da至120000Da之間的高分子量的海參糖胺聚糖以方便后續步驟進行，優選對海參多糖粗品純化是用DEAE-纖維素柱進行純化。脫色可以采用活性碳吸附脫色或雙氧化脫色，在本發明的具體實施方案中，優選采用雙氧化脫色，即使用3％雙氧水脫色除熱源。本發明解聚海參糖胺聚糖制備方法中步驟(2)包括，在5％雙氧水的條件下，將步驟(2)提取的海參多糖降解成重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖組合物。例如，可以向步驟(1)提取的海參多糖加入高濃度雙氧水使最終雙氧水的濃度達到5％，在這種條件下，控制降解的溫度和時間，使解聚海參糖胺聚糖組合物中解聚海參糖胺聚糖的重均分子量達到8000Da至12000Da之間。最終產物的重均分子量可以通過色譜分析來確定，收集重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖。降解的溫度和時間可以根據具體情況，如海參的種類、步驟(1)制得的海參多糖含量及分子量大小，通過設置不同溫度和時間的預實驗來獲得，通常溫度為20至60攝氏度，優選為35至50度；時間為6至72小時，優選為12至48小時。在本發明的具體實施方案中，對從黑海參中提取的海參多糖可以在45攝氏度下降解24小時。本發明解聚海參糖胺聚糖制備方法中，其中步驟(3)是用能分離不同分子量的技術來收集解聚海參糖胺聚糖組合物，優選是用凝膠過濾色譜來收集解聚海參糖胺聚糖組合物。本領域技術人員可以通過購買已經商品化的凝膠過濾色譜產品(如Sephadex-G75柱)來進行收集。收集的解聚海參糖胺聚糖組合物中的解聚海參糖胺聚糖的多分散度小于2，優選介于1.1至2之間，優選小于1.5，優選介于1.2至1.5之間，更優選小于1.4，更優選介于1.3至1.4之間。多分散度(polydispersity)是本領域常用的衡量聚合物分子量分布的指數，用于表征聚合物分子量分布的寬度。多分散度在本文或其他文獻中又被稱多分散指數、多分散性或分布寬度指數，是重均分子量(Mw)與數均分子量(Mn)之比，即Mw/Mn。這個比值隨分子量分布寬度而變化。在單分散時，Mw/Mn等于1，隨著分子量分布變寬，Mw/Mn值逐漸變大。在本發明的優選實施方案中，制備得到的解聚海參糖胺聚糖組合物中的解聚海參糖胺聚糖多分散指數為1.36。通過多分散度的值可以將重均分子量換算為數均分子量，如本發明的優選實施方案中的重均分子量為10000Da的解聚海參糖胺聚糖，其數均分子量僅僅為7352Da，遠遠小于HidekiNagase等人報道的數值。步驟(3)后還可以包括進一步處理的步驟，如冷凍干燥的步驟，從而方便保存、運輸和/或進一步應用。上述解聚海參糖胺聚糖組合物可以通過上述的制備方法制備得到，或可以將多次采用本發明上述的制備方法制備得到的提取自不同海參種類和/或不同分子量分布的組合物混合而得到，優選就是直接由上述的制備方法制備得到。在本發明的制備解聚海參糖胺聚糖組合物一個優選實施方案中，為了獲得適合于靜脈注射的高純度解聚黑海參糖胺聚糖組合物，可以依次將干燥的黑海參體壁絞碎，經酶解后離心，上清液用乙醇醇沉，干燥得沉淀物①；將該沉淀物①加水溶解后，加入氯化鈣，離心，上清液用乙醇醇沉，干燥得沉淀物②；將沉淀物②加水溶解后，加入醋酸鉀，取上清液，加乙醇沉淀，干燥得海參多糖粗品；將海參多糖粗品過DEAE-纖維素柱，用乙醇醇沉，加入雙氧水脫色處熱源，可得分子量為100000-120000的海參多糖；將該海參多糖在5％雙氧水條件下控制解聚，然后用乙醇沉淀，沉淀物加水溶解后，過Sephadex-G75柱，冷凍干燥。由此可得到純度高達98％以上的解聚海參糖胺聚糖，其重均分子量介于8000-12000之間，多分散度小于1.5。本發明還提供了一種藥物組合物，其包括解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體。藥學上可接受的輔劑包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分相容。運用藥學上可接受的輔劑制備藥物組合物對本領域普通技術人員來說是公知的。本發明的藥物組合物包含一種或多種解聚海參糖胺聚糖組合物作為活性成分，將該解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的輔劑(如本領域普通技術人員所熟知的載體、賦形劑、稀釋劑等)組合在一起，配制成各種制劑，優選為固體制劑和液體制劑。本發明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑、等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥方式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等的給藥形式。優選本發明的藥物制劑為注射劑、凍干粉針劑或口服制劑。載體、賦形劑、稀釋劑是藥學上可接受的并與活性成分相容?？梢赃x用的合適的賦形劑優選但不僅限于水、生理鹽水、葡萄糖，甘油、乙醇或其類似物及其組合。當本發明的藥物制劑為凍干粉針劑時，優選其中藥學上可接受的載體選自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種。而當本發明的藥物制劑為口服制劑時，優選其中藥學上可接受的載體選自淀粉、乳糖、微晶纖維素、交聯PVP和羧甲基淀粉鈉中的一種或幾種。本發明的藥物組合物中活性成分的含量可以根據具體劑型、給藥方式以及給藥對象的情況而定，如，優選注射劑中解聚海參糖胺聚糖組合物的含量為0.03-2.5％(重量)，優選為1％(重量)；又如，口服制劑每片含解聚海參糖胺聚糖組合物50-200mg，優選為100mg。本發明還提供了該藥物組合物的制備方法，其包括將本發明解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體混合的過程。藥物的制備方式可以采用本專業的一般技術人員所公知的方法從而制備成合適的制劑。例如，可包括將解聚海參糖胺聚糖組合物稀釋成注射劑的過程。更具體地，可以取解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體，用注射用水溶解，向溶解產物加入針用活性炭，攪拌，過濾。在一個具體實施方案中，取解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體，用注射用水溶解，向溶解產物加入針用活性炭，攪拌5分鐘，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾，然后將濾液通過0.22μm微孔濾膜除菌過濾，接著無菌分裝，冷凍干燥，如果要進行冷凍干燥，還可以包括冷凍干燥的步驟，最后軋蓋、包裝，即得相應藥品。在另一個具體實施方案中，本發明還提供了口服制劑的具體方法，即將解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體，混合制軟材，制粒，干燥，整粒，壓片，包衣，可得到相應的片劑藥品。本發明提供了本發明的藥物組合物在預防和/或治療心腦血管疾病的藥物中的應用。優選其中心腦血管疾病是凝血性和血栓性疾病，優選是缺血性腦血管疾病或血栓性疾病，更優選是缺血性腦中風。給藥的劑量和形式一般由醫師根據患者的具體情況(如年齡、體重、性別、患病時間、身體狀況等)確定。一般而言，以解聚海參糖胺聚糖計，給藥的劑量為0.01～100mg/kg患者體重，優選為0.05～10mg/kg，優選為0.1～1mg/kg。給藥形式根據各種藥物制劑的劑型及其生物利用度來確定，適合的給藥形式有口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等給藥形式，優選注射給藥。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。實施例11.1海參多糖的提取取干燥的黑海參(Holothuriaatra)體壁1000g，加水浸泡，洗凈淋干，絞碎，補水至8kg，用氫氧化鈉調節pH值為8.0，加入堿性蛋白酶(無錫市酶制劑廠)20ml，60℃進行酶解，酶解結束后，再加入胰酶(四川德陽酶制劑廠)2g進行二次酶解，將該酶解產物室溫離心，取上清液。用鹽酸調節pH值為2.5，離心去除酸性蛋白沉淀。加入0.8倍體積乙醇，4℃離心，其上清液，得到沉淀物。將該沉淀物加10倍重量的水溶解，加熱至90℃，加入氯化鈣使氯化鈣的濃度為2％，保溫20min，冷卻，離心，收集上清液，用飽和碳酸鈉溶液調節pH為11.0，離心，收集上清液，用鹽酸調節pH為6，加入0.8倍體積乙醇醇沉，收集沉淀物。將該沉淀物加2倍重量的水溶解，加入醋酸鉀使其最終濃度為2mol/L使該溶液沉淀，4℃離心，上清液加0.6倍體積的乙醇醇沉，4℃離心，收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌，離心收集沉淀物，干燥得到海參多糖粗品。將該粗品溶于醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液中，過DEAE纖維素柱(上海恒信化學試劑有限公司)，用1mol/L的氯化鈉和醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液進行洗脫，收集洗脫液，加入等倍量體積的乙醇進行醇沉，離心，收集沉淀，干燥得白色固體。將該固體溶于水中，在pH值為11，溫度為60℃的條件下，加入3％的雙氧水進行脫色除熱源，等體積量的乙醇醇沉，靜置，4℃離心，得海參多糖純品。1.2解聚海參糖胺聚糖的制備以下將描述降解海參多糖并收集符合要求的解聚海參糖胺聚糖的步驟。首先，將上述海參多糖純品用5％醋酸配成1％的溶液，加入30％的雙氧水使溶液中雙氧水的濃度為5％，45℃進行控制解聚24小時。將該溶液用0.001mol/L的氫氧化鈉中和至中性，加入5倍體積量的乙醇進行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品。將該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過Sephadex-G75柱，用0.5mol/L的氯化鈉進行洗脫，脫去鹽及小分子雜質，脫鹽后的樣品冷凍干燥即得12g解聚海參糖胺聚糖，其分子量都在8000-12000，D值＜1.5，純度達98％以上。該實例得到的解聚海參糖胺聚糖，經蒸發光散射分析儀(ELSD200蒸發光檢測器，美國澳泰公司生產)可得到純度為99.89％的純品(圖譜見圖1)。經該實例得到的解聚海參糖胺聚糖經凝膠柱(TSKgelG4000PWXL，日本TOSOH公司)色譜分析知該產品的均重分子量為10000，D值為1.36(圖譜見圖2，相應參數見表A)。表A色譜分析得到的樣品分子量及多分散性1.3注射用含有解聚海參糖胺聚糖的藥物組合物的制備以上10g解聚海參糖胺聚糖加入注射用水，配成1％的溶液，再加入甘露醇20g溶解，精濾，灌裝，冷凍干燥，得到1000支注射用解聚海參糖胺聚糖的凍干粉針劑。1.4含有解聚海參糖胺聚糖的藥物組合物的片劑的制備可制成1000片解聚海參糖胺聚糖片劑的配方如下解聚海參糖胺聚糖50-100g乳糖30-80g微晶纖維素10-30g羧甲基淀粉鈉5-10g3％PVP80％乙醇溶液10-15ml硬脂酸鎂0.3-0.5g制成1000片其制法如下1)將解聚海參糖胺聚糖與乳糖、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉分別粉碎，過80目篩，備用；2)上述粉碎后，主藥及輔料混合均勻，用3％PVP80％乙醇溶液制軟材，20畝篩制粒，濕顆粒在60-70℃干燥2小時，20目篩整粒，加入硬脂酸鎂混勻，壓片，包薄膜衣，即得。實施例2解聚海參糖胺聚糖的藥效學試驗1、實驗材料1.1動物SD品系大白鼠，♂性，體重250-320g，質量合格證陜醫動證字08-005號；新西蘭品系大白兔，♀♂各半，體重1.8-2.2kg，質量合格證陜醫動證字08-18號。1.2藥物注射用解聚海參糖胺聚糖規格10mg/支(以有效成分——解聚海參糖胺聚糖計)陽性對照藥物血塞通注射液(規格2ml/100mg/支)(一)注射用解聚海參糖胺聚糖對局灶性腦缺血大鼠的影響(1)實驗方法取SD品系，雄雌各半，體重280-320g大鼠足量，適應實驗室7天后開始稱重，編號，隨機分為6組，每組多于10只。每組給藥的藥物均以藥物的有效成分計算(下同)，具體分組如下①假手術對照組(生理鹽水5mg/kg)；②腦缺血模型組；③陽性藥血塞通注射組(41.2mg/kg)；④注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組(4mg/kg)；⑤注射用解聚海參糖胺聚糖中劑量組(2mg/kg)；⑥注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組(1mg/kg)；術前，各組動物按預設劑量靜脈注射1次·d-1，給藥體積均為5ml/kg，連續一周；腦缺血手術后12h，各組動物再給藥一次。采用大腦中動脈阻斷MCAO法致大鼠持續性腦缺血法。假手術對照組動物，使中動脈可見后，對其不做電凝燒灼，其他手術操作仍按照MCAO法進行操作。術后，選用表現有霍納(Horner)綜合癥(同側瞳孔縮小，眼球內陷，眼裂變小)和拖尾時左前肢曲內收著方列為合格的實驗研究對象。Horner模型具有較高死亡率，最終應確保每組10例合格動物數。(2)觀察觀察試藥對動物神經行為、腦梗死體積、腦指數的影響。于腦缺血手術后24h，根據Bederson評分標準，對實驗動物進行神經行為學平分。動物的行為障礙越嚴重，Bederson評分分值越高。隨后斷頭處死各組大鼠，迅速取出鼠腦并稱腦重，隨后除嗅球，小腦和低位腦干，置于冰鹽水中10min，冠狀切成五片2mm厚腦片，迅速將腦片置于2％氯四氮唑(TTC)磷酸緩沖溶液中，37℃避光溫孵染色30min，其間每隔7-8min翻動一次。溫孵完畢后用數碼相機拍照雙側腦片，輸入計算機并采用美國ScionCorporation的ScionImageBeta4·0·2圖像處理軟件測量梗塞面積，獲取每鼠腦片總梗塞面積值，與腦片總面積值，按照下面的公式分別計算出腦梗塞體積、腦指數。Vs(單片體積)＝Asi(單片面積值)×2(厚度，mm)S＝0，1i＝1，2，3，4，5Σ2A1i]]>=i=1Σ2A0j×100%,i,j=1,2,3,4,5]]>j=1]]>腦指數I=N×100W]]>其中N全腦重；W大鼠體重結果注射用解聚海參糖胺聚糖對腦缺血大鼠神經行為障礙有改善作用，與模型組比較，大劑量P＜0.01，中劑量組P＜0.05；可降低腦缺血大鼠梗塞體積，與模型組比較，大劑量均P＜0.01；對腦缺血大腦指數無影響。與模型組比較，三個用藥組均P＞0.05。結果見表1-表3表1注射用解聚海參糖胺聚糖對腦缺血大樞神經行為的影響(X±5，n＝10)<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="810">組別劑量(mg/kg)Bederson’s積分值假手術對照組腦缺血模型組血塞通注射液組解聚海參糖胺聚糖大劑量組解聚海參糖胺聚糖中劑量組解聚海參糖胺聚糖小劑量組41.242109.80±0.428.90±0.57※※8.20±0.42※※▲▲9.30±0.48※9.60±0.70</table></tables>與模型組※P＜0.05※※P＜0.01；與陽性藥組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01表2注射用解聚海參糖胺聚糖對腦缺血大鼠腦梗死體積的影響(X±s，n＝10)<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="768">組別劑量(mg/kg)腦梗塞體積比率(％)</table></tables>與模型組※P＜0.05※※P＜0.01；與陽性藥組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01表3注射用解聚海參糖胺聚糖對大腦缺血腦指數的影響(x±s，n＝10)與模型組※P＜0.05※※P＜0.01；與陽性藥組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01(二)注射用解聚海參糖胺聚糖對數血液流變學的影響試驗方法取經實驗室適應5天后健康SD品系大鼠60只，體重196.51±10.3g，隨機分為10組。①假手術對照組(生理鹽水5mg/kg)；②腦缺血模型組；③陽性藥血塞通注射組(41.2mg/kg)；④注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組(4mg/kg)；⑤注射用解聚海參糖胺聚糖中劑量組(2mg/kg)；⑥注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組(1mg/kg)；以上動物，除①②組外的其余動物連續靜脈注射給藥一周，容量為5ml/kg。動物取血前一天，采取正常動物組外，其余動物皮下注射Adr0.08ml/100g，一天兩次，間隔4h，第一次注射后2小時將大鼠浸入冰水內5min做血瘀模型后，禁食不禁水。次日早晨將大鼠斷頭取血2.7ml，其中1.5ml血迅速注入肝素抗凝管中搖勻后，置入35℃的恒溫水浴箱中備用，1.2ml血迅速注入檸檬酸鈉抗凝管，搖勻備用。取1ml肝素抗凝血注入粘度計轉筒內，轉換高切變率，低切變率開關，記錄高切率，低切率粘度標度值(高切200s-1；低切40s-1)將其輸入計算機，求得全血高切變率及低切變率粘度值。取底端平整的毛細管，扦入剛混勻的肝素抗凝血中，待血進入毛細管內4/5處，封住下端口，下端扦入橡皮泥中，垂直豎立，并計時1h后，用血沉壓積板讀出血沉值(溫氏法)。將上述毛細離心管，用3F-3型高速微量離心機離心5min，轉速12000rpm，再用壓積板讀出紅細胞壓積值。將測定壓積的毛細離心管在溫度為56±1℃的水浴中水浴5min，然后用同樣離心機離心5min，轉速仍為12000rpm，取出后用讀數顯微鏡測量毛細管內血漿長度和纖維蛋白原長度，按下列公式計算纖維蛋白原含量(熱沉淀法)。將做完全血粘度的血吸回原抗凝管，用80-2型離心機離心血漿，轉速為3000rpm，時間為15min，取1ml，按上述測全血切粘度的方法測血漿粘度。全血還原粘度由計算機根據全血高切變率粘度值和紅細胞壓積計算，軟件由中科院傳感技術公司提供。取1ml檸檬酸鈉抗凝血加入容量為5ml的長頸圓形玻璃瓶中，將其置于血小板粘附儀轉盤上，以5rpm的轉速旋轉15min后取上，再用定量取血管分別吸取20μl旋轉前和旋轉后的抗凝血注入1％0.4ml的草酸銨稀釋劑中測定旋轉前后血中的血小板數，然后按照下列公式計算以上實驗結果，給藥組與模型組比較，經間經統計學T檢驗處理，結果見表4表4注射用解聚海參糖胺聚糖對大鼠血液粘度的影響(X±s，n＝10)模型組與正常組比較▲P＜0.05▲▲P＜0.01用藥組與模型組比較※P＜0.05※※P＜0.01表4結果顯示1)模型組與正常組比較，全血高切變率粘度、低切變率粘度、血漿粘度、纖維蛋白原等指標均增高且非常顯著(※※P＜0.01)；血小板總數、血小板粘附率、血沉、PBC壓積無顯著變化，血瘀模型復制成功。2)陽性藥組與模型組比較，全血高切變率粘度、低切變率粘度、高切還原粘度、纖維蛋白原降低均有顯著性(※※P＜0.01)。9項指標中有5項改變，說明陽性藥物有效。3)注射用解聚海參糖胺聚糖給藥組與模型組比較。大劑量組全血高切變率粘度、低切變率粘度、血漿粘度、高切還原粘度、纖維蛋白原5項指標均降低，且非常顯著(※※P＜0.01)。其余4項指標均無明顯變化。中、小劑量組的纖維蛋白原、血沉變化非常顯著(※※P＜0.01)，其余指標無明顯改變。結論解聚海參糖胺聚糖可以降低血漿粘度，從而改善大鼠血液循環。(三)注射用解聚海參糖胺聚糖對大鼠血栓形成的影響取健康的SD大鼠50只，♀♂兼用，體重190-240g，每組10只，適應實驗室5天后稱重，編號，隨機均衡分為5組，①生理鹽水對照組5mg/kg；②陽性藥血塞通注射組(41.2mg/kg)；③注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組(4mg/kg)；④注射用解聚海參糖胺聚糖中劑量組(2mg/kg)；⑤注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組(1mg/kg)。以上動物靜脈注射給藥5ml/kg，每天一次，連續一周，末次給藥40分鐘后，用3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉1ml/kg后仰臥固定在大鼠手術臺上，分離右頸總動脈及左頸外靜脈，用事先準備好的聚乙烯插管(聚乙烯管內徑1mm，長5cm，內徑2mm，長8cm，在三段管中放入一根5cm長的4號手術線，用50μg/ml肝素葡萄糖溶液充滿聚乙烯管后夾住管壁)，當管的一端插入左頸外靜脈后，將管的另一端插入右頸總動脈，手術后5min開放血流，開放血流15min中斷血流迅速取出絲線稱血栓濕重(全重-線重＝血栓濕重)，各給藥組與生理鹽水組，經間T檢驗處理結果見表5表5注射用解聚海參糖胺聚糖對大鼠體外血栓形成的影響各給藥組與生理鹽水組比較※P＜0.05，※※＜0.01實驗結果表明，注射用解聚海參糖胺聚糖各劑量組對大鼠體外血栓形成的濕重有明顯的減輕作用，結果與血塞通注射液組相似(※P＜0.05，※※P＜0.01)，說明注射用解聚海參糖胺聚糖具有溶血栓作用。注射用解聚海參糖胺聚糖大、中劑量組可明顯抑制大鼠血栓形成，減輕血栓濕重(※P＜0.05)，注射用解聚海參糖胺聚糖大劑量組與血塞通注射液組作用相似(抑制率33.69％)，并可明顯抑制其血栓的長度和濕重。(四)注射用解聚海參糖胺聚糖對家兔眼結膜微血管循環的影響對家兔分別注射大、中、小劑量的解聚海參糖胺聚糖以及生理鹽水和陽性藥品，觀察解聚海參糖胺聚糖對家兔眼結膜微血管循環的影響。試驗結果見表6。表6注射用解聚海參糖胺聚糖對家兔眼結膜微循環的影響各組與給藥前比較※P＜0.05，※※p＜0.01結果以上各項試驗結果顯示，注射用解聚海參糖胺聚糖對腦缺血大鼠神經行為障礙有改善作用；可降低腦缺血大鼠梗塞體積；對腦缺血大樹腦指數無影響；可減輕大鼠血栓的重量；注射用解聚海參糖胺聚糖大、中、小各劑量組大鼠血液流變學指標，全血高切變率粘度、低切變率粘度、血漿粘度、高切還原粘度、纖維蛋白原5項指標均降低，且非常顯著。其余4項指標均無明顯變化。小劑量組對纖維蛋白原、血沉變化非常顯著；對家兔驗結膜微循環的影響結果顯示，注射用解聚海參糖胺聚糖大中小劑量均可增加毛細血管管徑、毛細血管的流速，作用非常顯著。試驗結果顯示注射用解聚海參糖胺聚糖具有明顯的溶血栓，降低血漿粘度和改善血液循環的作用。權利要求1.一種解聚海參糖胺聚糖組合物，其含有90-99.89％重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖。2.一種制備權利要求1所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的方法，包括如下步驟1)從海參中提取海參多糖；2)降解提取出的海參多糖；3)收集重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖組合物。3.根據權利要求2所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟1)中的海參選自花刺參、梅花參、綠刺參、玉足海參和黑海參，優選為黑海參。4.根據權利要求3所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟1)從海參中提取海參多糖的步驟包括對海參進行絞碎、酶解并沉淀獲得海參多糖粗品，然后對海參多糖粗品純化、脫色，得到海參多糖。5.根據權利要求4所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟1)中的酶解是用堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行酶解；對海參多糖粗品純化是用DEAE-纖維素柱進行純化。6.根據項權利要求2至5任一權利要求所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟2)降解提取出的海參多糖的步驟包括在5％雙氧水的條件下，將提取的海參多糖降解成重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖組合物。7.根據權利要求6所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟3)是用凝膠過柱來收集解聚海參糖胺聚糖組合物。8.根據權利要求6所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟3)收集的解聚海參糖胺聚糖組合物的多分散度小于2，優選小于1.5，更優選小于1.4。9.根據權利要求6所述的解聚海參糖胺聚糖組合物的制備方法，其中步驟3)后還包括冷凍干燥的步驟。10.一種藥物組合物，其包括解聚海參糖胺聚糖組合物和藥學上可接受的載體。11.根據權利要求10所述的藥物組合物，其中藥物組合物為注射劑時低分子解聚海參糖胺聚糖組合物的含量為0.03-2.5％(重量)，優選為1％(重量)；藥物組合物為口服制劑時每片含低分子解聚海參糖胺聚糖組合物50-200mg，優選為100mg。12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其中藥物組合物為凍干粉針劑時，藥學上可接受的載體選自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種；藥物組合物為口服制劑時，藥學上可接受的載體選自淀粉、乳糖、微晶纖維素、交聯PVP和羧甲基淀粉鈉中的一種或幾種。13.根據權利要求10所述的藥物組合物在預防和/或治療心腦血管疾病中的應用。14.根據權利要求13所述的藥物組合物在預防和/或治療心腦血管疾病中的應用，其中心腦血管疾病是凝血性和血栓性疾病，優選是缺血性腦血管疾病或血栓性疾病，更優選是缺血性腦中風。全文摘要本發明涉及一種解聚海參糖胺聚糖組合物，其含有90－99.89％重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖，其制備方法是1)從海參中提取海參多糖；2)降解提取出的海參多糖；3)收集重均分子量介于8000Da至12000Da之間的解聚海參糖胺聚糖組合物。解聚海參糖胺聚糖組合物能安全、有效地預防和治療心腦血管疾病，尤其是用于預防和治療凝血性和血栓性疾病。制備解聚海參糖胺聚糖組合物的原料為海洋生物，資源豐富、價格低廉，通過本發明明確了有效藥物成分并減少了不必要的無效成分，因此更容易控制生產成本和產品質量。文檔編號A61P9/10GK101057859SQ200710017839公開日2007年10月24日申請日期2007年5月14日優先權日2007年5月14日發明者張登科申請人:張登科