專利名稱：抗細胞間粘附分子－1單抗作為制備治療禽流感藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗體的應用，確切地說是抗細胞間粘附分子-1單抗作為制備治療禽流感藥物的應用。
背景技術：
高致病性禽流感(HPAIV)的頻繁發生，嚴重影響了我國乃至世界家禽養殖業的發展，目前HPAIV已由亞洲蔓延至非洲和歐洲。與此同時，禽流感病毒跨越禽類感染哺乳動物的種類也不斷有增多報道。AIV感染人的數量也有不斷增高的趨勢，HPAIV對人類構成了巨大的威脅。AIV很有可能突破種間屏障，在人間大流行，導致人類禽流感的大流行或暴發，所以預防和控制這種可能的傳播是目前全球防控禽流感最首要的任務。高致病性禽流感感染人類，多數死亡病人的直接死因是急性重癥病毒性肺炎。部分患者病情發展迅速，出現進行性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液等多種并發癥而死亡。肺部病理改變彌漫廣泛，兩肺高度間質性及肺泡水腫，間質及肺泡以單核淋巴細胞為主的混合性炎癥細胞浸潤，肺泡腔內有漿液滲出，形成典型的彌漫性肺損傷。炎性細胞的粘附是肺損傷發生的重要環節，在炎癥細胞的游走、聚集，免疫細胞的激活過程中，粘附分子的表達起著關鍵作用。以前研究證明，呼吸道合胞病毒等病毒感染可播及肺間質和肺泡而引起肺炎，而炎性細胞粘附是其導致肺部感染的重要環節，粘附分子及其受體在其發病中發揮了重要作用。而細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)簡稱ICAM-1與其受體結合是炎性細胞粘附、聚集的關鍵。
細胞間粘附分子-1是一種分子量為76 000～114 000的細胞表面粘附分子，屬免疫球蛋白超家族，能通過與其配體——白細胞功能相關抗原1(LFA-1)即CD11a/CD18的結合導致白細胞聚集、滲入和遷移，從而發生炎癥反應。故ICAM-1與LFA-1被認為在炎癥的激發中起著重要的介導作用。1986年，R.Rottclein等人在研究佛波脂刺激的同種異型淋巴細胞的粘附中發現了一種LFA-1的配體，這是細胞粘附必需的，定名為細胞間粘附分子-1，后統一命名為CD54，ICAM-1可與多種細胞表面成分包括LFA-1，Mac-1(CD 11b/CD 18)，P150.95(CD11c/CD 18)形成黏附，在免疫監督、炎癥反應、吞噬過程、動脈粥樣硬化等過程中起著重要的作用。ICAM-1還是鼻病毒的受體，并參與炎癥變態反應及移植排斥反應等。
由于高致病性禽流感在動物間以及人和人之間水平傳播的能力，在人禽流感疫情發生時，還沒有一種有效的預防和控制措施，發病后更沒有什么有效的治療手段。

發明內容
本發明的目的是抗細胞間粘附分子-l單抗作為制備治療禽流感藥物的應用。
本發明的目的特別是抗細胞間粘附分子-1單抗作為制備治療H5N1亞型高致病性禽流感藥物的應用。
本發明的目的還是抗細胞間粘附分子-1單抗作為制備治療哺乳動物特別是人禽流感藥物的應用。
本發明人多年來一直致力于禽流感的研究，在已建立的小鼠H5N1高致病性禽流感病毒性肺炎(HPAIVP)模型，通過免疫組織化學分析、流式細胞檢測及酶聯免疫吸附實驗(ELISA)技術，分別檢測小鼠感染H5N1亞型高致病性禽流感病毒后肺部和血清ICAM-1及其受體CD11b、CD18的表達水平，以評價它們與HPAIV肺炎的相關性，從分子水平探討HPAIVP的發病機理，為人類HPAIVP的防治措施的研究提供方向和依據，對嚴防HPAI在人間大流行從技術儲備方面提供理論基礎；目前發現的HPAI都是由H5和H7亞型禽流感病毒引起。而多數感染HPAIV死亡病人的直接死因是急性、進行性病毒性肺炎。我們制作的HPAIVP模型小鼠肺組織的主要病理改變是肺泡間隔不同程度增寬，肺內小血管及肺泡間隔的毛細血管擴張、淤血，可見中等量淋巴細胞和單核細胞浸潤，符合間質性肺炎的病理特點。本人應用免疫組織化學染色方法和ELASA方法發現高致病性禽流感病毒性肺炎組小鼠支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及支氣管肺組織微小血管內皮細胞ICAM-1及其受體表達顯著增強(與對照組相比P＜0.05)(結果見附圖1、2)。高致病性禽流感病毒性肺炎組小鼠外周血白細胞表面CD11b、CD18、CD54的陽性細胞百分率(PPC)和/或平均熒光強度(MFI)與對照組比較也普遍升高。此結果表明支氣管肺組織和外周血中ICAM-1及其受體表達上調可能在HPAIVP發生中發揮了重要作用。依據我們的研究結果可以推測當HAIV進入呼吸道后，引起支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及支氣管肺組織微小血管內皮細胞ICAM-1及其受體表達顯著增強，支氣管肺組織微小血管內皮細胞上調的ICAM-1對于白細胞跨越血管內皮具有重要作用；而支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞的ICAM-1表達上調則有助于中性粒細胞與上皮細胞的粘附；進而引起中性粒細胞進入氣道導致一系列炎癥的病理變化。而在感染HPAIV后的第4～5天ICAM-1及其受體表達增強最明顯，與模型小鼠肺指數變化趨勢相一致。說明HPAIV進入呼吸道后，隨著病毒復制的增多，感染后第4～5天，肺部炎性滲出及炎性細胞浸潤增多，肺部實變最明顯，故肺重增加，肺指數增大。HPAIV侵入肺部后，感染上皮細胞通過高表達的ICAM-1促進其與中性粒細胞的粘附，從而導致氣道損傷。故本實驗的結果提示ICAM-1及其受體通過介導中性粒細胞等炎性細胞的跨內皮遷徙及向氣道游走和聚集參與了HPAIVP氣道炎癥的過程。ICAM-1與其受體結合是炎性細胞粘附、聚集的關鍵，并且白細胞粘附和游走過程是受白細胞上的CD11b/CD18和內皮細胞上的ICAM-1共同調節的。
用抗細胞間粘附分子-1單抗作為哺乳動物禽流感、特別是感染H5N1亞型禽流感治療措施之一有著潛在而廣闊的前景。
本研究采用純品的抗細胞間粘附分子-1單抗治療用H5N1亞型禽流感小鼠模型，結果表明其對禽流感小鼠有一定的治療作用，治療組小鼠的存活率明顯高于病毒對照組，其肺部的病理變化差異顯著；同時反映小鼠發病狀態和病情輕重的體重和肺指數的變化同樣顯示治療組小鼠的各項指標明顯高于病毒對照組。說明抗細胞間黏附分子-1單抗對禽流感小鼠有明顯的治療作用，而ICAM-1單抗對小鼠的肺部沒有毒副作用；如果再加上一些輔助性治療效果會更好。本研究結果為將來抗ICAM-1單抗應用于人及哺乳動物禽流感的治療提供了依據。


圖1為小鼠感染禽流感病毒后的肺部病理變化，其中A正常對照；B禽流感病毒感染小鼠。
圖2為電鏡下肺部上皮細胞中的禽流感病毒。
圖3為用ELISA方法檢測禽流感病毒感染小鼠和用抗ICAM-1單抗處理后小鼠肺部ICAM-1的表達情況。
圖4為用免疫組化方法檢測禽流感病毒感染小鼠和用抗ICAM-1單抗處理后小鼠肺部ICAM-1的表達情況，其中A正常對照組；B病毒攻毒組；C用ICAM-1處理組。
圖5為不同實驗組小鼠體重變化圖。
圖6為本發明抗ICAM-1單抗治療禽流感小鼠肺指數變化圖。
圖7為實驗各組小鼠存活情況圖。
圖8為實驗組小鼠肺部病理變化圖，其中A正常對照組；B正常對照給藥組；C病毒攻毒組；D攻毒后給藥治療組。
具體實施例方式
實施例1禽流感小鼠模型的制備本實施例的目的用于制備本發明所需要的實驗動物模型。
請參見附圖1、2，本研究所用實驗動物為清潔級Balb/C小鼠，18～20g，購自長春生物制品研究所，許可證號為SCXK-2002-0001；高致病性禽流感病毒(H5N1亞型)(A/Tiger/Harbin/01/2001)，為SPF雞胚增殖后收集的病毒尿囊液，血凝效價(HA)26，小鼠LD50為10-7.25，由本研究所病毒室提供。所有實驗均在生物安全III級實驗室中進行，ICAM-1單抗為自制和從美國R&D公司購買，抗體純度為95％，濃度為1mL/mg；效價為1∶51200。小鼠ICAM-1 ELISA檢測試劑盒，兔抗小鼠ICAM-1抗體以及生物素-親和素-過氧化物酶免疫組化檢測系統均購自武漢博士德生物公司。
將SPF收的H5N1禽流感病毒用PBS緩沖液稀釋成10-6.25稀釋度的病毒液，使其病毒量為10個LD50(下面所有實驗中病毒攻毒組和攻毒后給藥組均用此病毒稀釋度的病毒攻毒，正常對照組和正常給藥組以PBS緩沖液作對照)；在攻毒之前，先用乙醚麻醉小鼠，之后將稀釋好的病毒液以滴鼻方式攻入小鼠肺內，每只小鼠50μl；對照組則相應滴鼻攻入50μl的PBS來代替；攻毒后密切觀察各組小鼠臨床癥狀，每日稱重，監測小鼠的體重變化，并于瀕死前眼球放血處死，解剖小鼠無菌取肺，稱重，計算肺指數(每只小鼠的肺臟濕重/體重，可作為小鼠肺部病理變化的指標，肺指數越大，說明小鼠肺部病變越明顯)；并于右下肺矢狀面最大周徑處橫貫取肺，4％多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，進行組織病理檢測。結果顯示，感染小鼠早期表現出精神沉郁、反應遲鈍、食欲減退、消瘦、眼半閉；后期出現被毛逆立、弓背等臨床癥狀。部分小鼠出現后肢或前肢麻痹、盲目轉圈、翻滾等神經癥狀；肺指數變化明顯感染小鼠平均肺重為0.372±0.02g～0.5±0.01g；死亡小鼠的平均肺指數為0.0205±0.004～0.0281±0.005；死亡小鼠的肺臟濕重增加明顯，和對照比差異極顯著(P＜0.01)。死亡小鼠的肺指數也相應增高，和對照比差異顯著(P＜0.05)。
感染小鼠肺部病理變化和電鏡觀察結果剖檢可見感染小鼠肺臟有明顯充血和水腫，肺體積變大，肺部病理組織學光鏡觀察，可見感染的肺組織肺內間隔不同程度增寬，肺內小血管及肺泡間隔毛細血管擴張、淤血，周圍炎性細胞浸潤；部分管壁細胞壞死、脫落；肺泡腔內有大量巨噬細胞浸潤和少量蛋白樣漿液滲出(圖1)。電鏡下肺泡腔內可見流感病毒樣顆粒，呈圓形、橢圓形，直徑80～120nm，核衣殼表面有囊膜包裹，囊膜表面有纖突(圖2)。
實施例2禽流感病毒引發的小鼠肺部炎癥與ICAM-1相關性研究2.1本實施例的目的是通過夾心ELISA方法探討禽流感病毒導致的小鼠肺部炎癥與ICAM-1的相關性。
請參見附圖3，實驗小鼠120只，隨機分3組，隨機分為正常對照組、病毒攻毒組和攻毒后給藥組，每組40只。按實施例1方法攻毒，攻毒后給藥組在攻毒后第1、3、5天給藥，每只小鼠尾靜脈注射ICAM-1單抗純品40μg(2μg/g小鼠)，共3次。攻毒后第1天開始至第8天，每天每組處死小鼠5只，將肺臟用1ml PBS緩沖液研磨，離心后取上清液，用夾心ELISA方法檢測各小鼠肺部ICAM-1含量，其中包被抗體為抗小鼠ICAM-1單抗，二抗為生物素標記的抗ICAM-1抗體。在酶標儀490nm處讀取OD值，取其平均值作為相對含量。結果顯示(圖3)病毒攻毒組小鼠肺部ICAM-1的表達情況隨著攻毒時間的加長而不同，攻毒后第1天表達量開始增加，在攻毒后第3、4、5天，ICAM-1的表達量最高，之后有所回落，而用ICAM-1單抗處理之后的小鼠，由于攻毒后第1天還沒給藥，因此這天小鼠肺部ICAM-1的表達情況與病毒對照組基本一致，但從給藥后，即第2天開始，其肺部ICAM-1的表達量明顯低于病毒攻毒組，可見在H5N1禽流感引發的小鼠肺炎的發病過程中，ICAM-1表達量明顯增高，說明其在禽流感小鼠的發病過程中起到重要的作用，而經過抗體的處理之后，其表達量明顯下降，顯示可以用其作為防治禽流感的重要手段和措施。
2.2本實施例的目的是通過免疫組化方法探討禽流感病毒導致的小鼠肺部炎癥與ICAM-1的相關性。
請參見附圖4，實驗小鼠30只，隨機分成3組，正常對照組、病毒攻毒組和攻毒后給藥組，每組10只，病毒組和攻毒后給藥組按實施例1所示攻毒，正常對照組以PBS代替；攻毒后給藥組在攻毒后第1、3、5天給藥，每只小鼠尾靜脈注射ICAM-1單抗純品40μg(2μg/g)，共3次。病毒組小鼠以PBS代替，每只小鼠尾靜脈注射200μl PBS緩沖液。正常對照組則觀察其生長狀態，不攻毒也不給藥。攻毒后監測小鼠的發病情況，瀕于死亡的，臨死前眼球放血處死，稱體重及肺重。取右肺葉矢狀面最大周徑處橫貫取肺，4％多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，用采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法檢測小鼠肺部ICAM-1的表達情況。未死小鼠第8天全部處死，同樣處理。正常對照標本除以PBS代替一抗外，其它步驟與實驗組被測標本相同，一抗為兔抗小鼠ICAM-1抗體，二抗為生物素標記的抗兔抗體；陽性反應為胞漿中出現棕黃色顆粒；結果顯示(圖4)，光鏡下在病毒攻毒組小鼠肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞的游離面、血管內皮細胞以及浸潤的單核細胞胞漿內可見ICAM-1陽性染色或較強陽性染色；而攻毒后給藥組小鼠的肺部上皮細胞、支氣管上皮細胞以及血管內皮細胞上染成棕黃色的陽性顆粒明顯少于病毒攻毒組，但數量略高于正常對照組；正常對照組有少量微弱陽性表達。
實施例3ICAM-1單抗治療禽流感小鼠的實驗研究本實施例的目的是檢測抗ICAM-1單抗對禽流感小鼠的治療作用。
請參見附圖5、6、7、8，實驗小鼠80只鼠，隨機分為正常對照組、正常給藥對照組、病毒攻毒組、靜脈注射組和腹腔注射組4組，其中，正常對照和正常給藥組2組各10只小鼠，其余每組20只小鼠；除正常對照和正常給藥組外，其余小鼠按實施例1方式制備禽流感小鼠模型，正常給藥對照組、靜脈注射組和腹腔注射組在攻毒后的第1、3、5天給藥，共給藥3次，給藥劑量為2μg/g；即每只小鼠平均給藥40μg，用PBS(pH7.4)緩沖液稀釋至200μl；正常對照組小鼠和病毒攻毒組小鼠采取靜脈注射的方式作對照，攻毒后的第1、3、5天尾靜脈注射PBS(pH7.4)緩沖液200μl作對照。攻毒后密切觀察各組小鼠臨床癥狀，每日稱重，監測小鼠的體重變化，并于瀕死前眼球放血處死，解剖小鼠無菌取肺，稱重，計算肺指數；并于右下肺矢狀面最大周徑處橫貫取肺，4％多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，進行組織病理檢測。
各組小鼠的體重變化情況(圖5)實驗結果顯示，實驗小鼠體重隨著發病狀態和死亡數量的增加而逐漸降低，病毒攻毒組尤其明顯，實驗組小鼠在治療后的4-5天進入相對較穩定期，但小鼠的狀態仍然不是很好，體重仍不穩定，有的體重還在下降，之后進入相對較穩定期，至第13、14天左右小鼠體重開始慢慢增加，小鼠恢復了正常生長狀態，飲食、活動一切自如。
各組小鼠肺部病變及肺指數變化情況(附圖6)觀察對照組死亡小鼠肺臟，發現有明顯的腫脹、充血、顏色發黑、體積增大。實驗組死亡小鼠肺臟亦有充血和腫脹現象，但多數肺部病變不均勻，部分病變較輕，顏色較淺，未死亡小鼠在觀察15天后全部處死，其肺部大部分為正常狀態，顏色發白，未見充血、腫脹現象，僅少數肺臟可見有少量充血、腫脹現象，肺指數計算結果顯示病毒對照組小鼠的肺指數明顯高于各實驗組，差異顯著(P＜0.05)。
實驗鼠的存活情況(附圖7)正常對照組小鼠全部存活，說明該批小鼠符合要求，合格。病毒對照組小鼠存活2只，存活率僅為10％。給藥各組小鼠均有不同程度的死亡，但小鼠的存活率明顯高于病毒對照組，其中靜脈注射組小鼠存活率達60％，腹腔注射組小鼠存活率達40％，初步顯示出ICAM-1單抗對感染了禽流感病毒小鼠的保護作用；實驗結果還顯示靜脈注射用藥效果好于腹腔注射。
各實驗組小鼠肺部病理變化(附圖8)病理切片結果顯示，病毒組小鼠肺部病理變化與實施例1結果一致，肺泡間隔增厚、肺內小血管及肺泡間隔毛細血管擴張、淤血，周圍炎性細胞浸潤；部分管壁細胞壞死、脫落；肺泡腔內有大量巨噬細胞浸潤和少量蛋白樣漿液滲出；經ICAM-1單抗治療后，小鼠肺部組織病理癥狀明顯減輕，炎性細胞數量減少，未攻毒用ICAM-1處理的小鼠肺部組織沒有明顯的病理變化，說明ICAM-1單抗對小鼠的肺部沒有毒副作用。
權利要求
1.抗細胞間粘附分子-1單抗作為制備治療禽流感藥物的應用。
2.根據權利要求1所述的禽流感藥物為H5N1亞型高致病性禽流感。
3.根據權利要求1或2所述的禽流感為哺乳動物禽流感。
4.根據權利要求3所述的哺乳動物為人。
全文摘要
本發明公開了抗細胞間粘附分子－1單抗作為制備治療禽流感藥物的應用，本發明采用純品的抗細胞間粘附分子－1單抗治療用H5N1亞型禽流感小鼠模型，治療組小鼠的存活率明顯高于病毒對照組，其肺部的病理變化差異顯著；同時反映小鼠發病狀態和病情輕重的體重和肺指數的變化同樣顯示治療組小鼠的各項指標明顯高于病毒對照組；抗細胞間黏附分子－1單抗對禽流感小鼠有明顯的治療作用，而ICAM－1單抗對小鼠的肺部沒有毒副作用；如果再加上一些輔助性治療效果會更好；為將來抗ICAM－1單抗應用于人及哺乳動物禽流感的治療提供了依據。
文檔編號A61P31/16GK101062414SQ20071005542
公開日2007年10月31日 申請日期2007年3月19日 優先權日2007年3月19日
發明者岳玉環, 朱平, 夏咸柱, 楊松濤, 張國利, 吳廣謀, 孫紅, 萬忠海 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所