專利名稱：：尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈與蜂毒素的融合蛋白及其制備的制作方法尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈與蜂毒素的融合蛋白及其制備發明領域本發明涉及融合蛋白質及其制備，特別是涉及人尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈(uPAa)與蜂毒素的結合形成的融合蛋白，及其制備方法和在腫瘤治療中的應用。
背景技術：
：一百多年前，PaulEhrlish提出的"魔彈"("magicbullet")概念為腫瘤的靶向治療提供了最初的構想。他的理論為以后研究人員構建單克隆抗體一毒素結合物，即免疫毒素以及其他嵌合毒素奠定了理論基礎。腫瘤的重組免疫毒素治療，是近年來隨著腫瘤靶向治療發展而出現的一種新型治療方法。重組免疫毒素(RIT)是將某些細菌和植物產生的毒素蛋白，通過基因重組或者短肽連接等方式與抗體或某些細胞因子等連接形成的，具有細胞靶向識別和耙細胞殺傷兩種功能，用以殺傷表面帶有特定抗原或受體的靶細胞的新型嵌合分子。目前，腫瘤的生物治療方法已成為繼手術、放療和化療之后的第四種腫瘤治療模式。隨著越來越多的腫瘤細胞表面分子被發現并用作腫瘤靶向治療的耙分子，重組免疫毒素在腫瘤靶向治療中的地位日漸突出，已經成為腫瘤的生物治療中的重要手段。腫瘤的靶向治療是利用腫瘤細胞表面富含突變或過量表達的致癌基因的產物作為藥物作用的靶點，因此在腫瘤治療的同時不會損害正常的組織或細胞。靶向分子可以是腫瘤抗原的特異性抗體或腫瘤細胞表面過量表達的受體。而效應分子可以是放射性同位素、細胞毒藥物、小分子細胞毒素或毒素大分子。尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)系統是基質降解酶系統的重要組成之一。降解細胞外基質需要一系列的蛋白酶的參與，纖溶酶(Pm)除直接降解細胞外基質成份外，還可激活金屬蛋白酶參與細胞外蛋白水解作用，而腫瘤細胞分泌的uPA是纖溶酶形成的啟動物。uPA作為體內重要的生理性調控分子參與多種生理和病理過程的調節，其本身的表達亦受多種因子包括激素、生長因子和細胞因子等的影響。uPA系統在腫瘤組織中的高表達與細胞的致癌性轉化有關。細胞學實驗表明，某些細胞致癌基因的激活可直接導致uPA系統成分的高表達。實驗研究和臨床資料均顯示，尿激酶系統中的uPA和uPA受體(uPAR)與腫瘤轉移呈明顯的正相關。普遍認為，uPA系統可能成為一種新的抗腫瘤轉移治療的耙點。通過干擾uPA/uPAR的相互作用及抑制uPA活性來抑制腫瘤細胞侵襲轉移，成為抗腫瘤侵襲轉移治療的一種新思路。uPA以其單鏈的前體尿激酶原(pro-uPA)的形式分泌，其纖溶活性較雙鏈的uPA至少低幾百倍。通過在lys158處催化斷裂肽鍵K158-1159，pro-uPA轉化為雙鏈形式的uPA。a鏈含有生長因子樣結構域，b鏈含有催化結構域。纖溶活性顯著增強，但失去了纖維蛋白的特異性。這種活化可經纖溶酶、組織蛋白酶B和L、凝血因子XIIa、神經生長因子，前列腺特異性抗原等催化完成。uPA通過其生長因子結構域識別并結合uPAR的結構域使兩者達到高效的結合。蜂毒素是蜂毒中發揮作用的主要物質，由26個氨基酸殘基組成。蜂毒素分子的結構特征決定了它既可以溶于水中，又可以與膜自然結合，進而溶解細胞，而無需經過細胞內化。因此可以用蜂毒素替代b鏈(uPAb)發揮抗腫瘤作用，主要作用機理是使細胞膜的通透性增加，導致細胞內容物泄露和細胞裂解。蜂毒素分子量小，比起其他的一些如蓖麻毒素、白喉毒素等分子量較大的毒素免疫原性低，不易產生過敏反應，這些優點使其更具有研究與應用價值。本發明首次制備并提供了一種由人尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈(uPAa)與蜂毒素組成的融合蛋白，其制備方法及其在腫瘤治療中的應用。
發明內容本發明的一個目的是提供一種由尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈(uPAa)與蜂毒素(蜂毒素)結合形成的融合蛋白，其中所說的uPAa鏈和蜂毒素分別與天然人uPA和天然蜂毒素至少有85%的序列同源性。在本發明的融合蛋白中，可以是與人uPAa鏈同源的區域位于融合蛋白的N-端，與天然蜂毒素同源的區域位于融合蛋白的C-端；也可以是與人uPAa鏈同源的區域位于融合蛋白的C-端，與天然蜂毒素同源的區域位于融合蛋白的N-端。也就是說，融合蛋白分子中，uPAa與蜂毒素的連接次序或位置是可以互換的。根據本發明的優選實施方案，所說的融合蛋白是以DNA重組技術產生的。根據本發明的優選實施方案，其中所使用的重組表達系統是酵母表達系統，更優選的是畢赤酵母，最優選的是畢赤酵母X-33。本發明將人uPAa鏈分子，或其有至少85%序列同源性的類似物與蜂毒素或其有至少85%序列同源性的類似物相融合，所形成的融合蛋白既保留了與uPAR相結合的活性，又保留了蜂毒素溶解細胞的活性。因此，本發明的融合蛋白既可以通過人uPAa鏈與表達uPAR的腫瘤細胞結合，在腫瘤細胞周圍富集高濃度的rhuPAa-蜂毒素，借助蜂毒素的溶解細胞的活性，達到靶向殺傷腫瘤細胞的目的，同時，當uPAa-蜂毒素與uPAR結合后，還可以與雙鏈活性的uPA競爭uPAR的結合位點，從而減弱了uPA降解細胞外基質的作用，最終達到抑制腫瘤細胞的粘附、遷移及侵襲的作用。實驗研究證實本發明的rhuPAa-蜂毒素融合蛋白具有高效結合、靶向殺傷腫瘤細胞的活性。可以使用本領域熟知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法和構建篩選cDNA文庫等方法獲得編碼人uPAa鏈的多聚核苷酸和編碼蜂毒素的多聚核苷酸。用作PCR模板和用于構建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應mRNA或cDNA的組織、細胞及文庫等，如從人卵巢癌組織和工蜂毒腺cDNA文庫獲得，也可以用人工合成的方法獲得。人工合成時可選用宿主偏愛的密碼子，借以提高產物的表達效率。必要時，可采用本領域周知的方法對多聚核苷酸進行突變、缺失、插入和與其它多聚核苷酸連接等。可以使用本領域周知的各種方法，如通過PCR的方法，在保持各自閱讀框不變的前提下，在編碼序列的兩側引入適當的限制性內切酶位點，通過酶切產生粘性末端，并在DNA連接酶作用下，實現編碼人uPAa鏈和編碼蜂毒素的多聚核苷酸的粘性末端彼此連接，得到編碼本發明融合蛋白的基因。如果需要，可在本發明的融合蛋白基因兩側引入適當的限制性內切酶識別位點。可用本領域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的基因序列克隆到各種適當的表達載體中。所用標準的分子克隆方法參見丄薩姆布魯克等《分子克隆試驗指南》第三版，科學出版社，2002。許多表達載體和其對應的宿主如酵母表達載體pPICZa，pPIC9，pHIL-sl(InvitrogenCorp.SanDiego，California,USA.)均可從市場上購得。可以將編碼本發明融合蛋白或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表達載體中。本發明優選的巴斯德畢赤酵母表達系統可以是胞內表達的，也可以是分泌表達的。這些載體都包括一個由大約0.9kb的5'醇氧化酶操縱子(AOX1)序列和大約0.3kb的轉錄終止基因的3'--序列組成的表達盒，因此可以便于目的基因在酵母染色體中整合與表達。表達融合蛋白的宿主可以是酵母、細菌、動物細胞、植物細胞等，但本發明優選的是酵母。融合蛋白或多肽可以存在于宿主細胞內，也可以是從宿主中分泌出來，但最好是在信號肽的幫助下從宿主細胞內分泌出來。本發明優選的信號肽是ci因子(aMF)。a因子信號序列由87個氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S.cerevsia)的a性成熟因子前導序列。編碼融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色體，或以游離質粒形式存在。得到攜帶融合蛋白基因的重組表達載體后，可使用通常的方法，如鋰鹽法、PEG法、原生質球法和電穿孔法等方法轉化宿主細胞。其中，本發明優選的轉化方法是電穿孔法。可通過人們熟知的技術加以鑒定，如收集并裂解細胞，提取DNA，然后用PCR方法鑒定被成功轉化的細胞，即含有本發明DNA構建體的細胞。或者，可用抗人uPAa鏈或抗蜂毒素的抗體檢測細胞培養上清或細胞破碎液中的蛋白。可以使用搖瓶或生物反應器，培養含有本發明DNA構建體的宿主細胞，以生產本發明的融合蛋白。所使用的培養基應能提供菌體(或細胞)生長和產物表達所需的物質，包含氮源、碳源、pH調節成分等，培養基配方應根據不同培養對象，通過試驗獲得。培養可分為兩個階段，第一階段主要用于菌體(或細胞)生長，第二階段主要用于產物的合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細菌或細胞培養物中分離、純化融合蛋白，如鹽析、有機溶劑沉淀、超濾、液相層析等技術及這些技術的組合。其中液相層析可以用分子篩、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術。我們的實驗結果表明，本發明獲得的融合蛋白rhuPAa-蜂毒素具有"一耙雙效"的特點，一效是rhuPAa-蜂毒素與腫瘤細胞的uPAR結合后，蜂毒素釋放殺傷腫瘤細胞；二效是當rhuPAa-蜂毒素與uPAR結合后，與雙鏈活性的uPA競爭uPAR的結合位點從而減弱了uPA降解細胞外基質作用，抑制了腫瘤細胞的粘附、遷移及侵襲作用。本發明將uPA/uPAR系統作為治療腫瘤的靶點，構建融合蛋白uPAa-蜂毒素，實現特異性靶點、高效結合、靶向殺傷腫瘤細胞，為腫瘤的治療開辟一個全新的設計思路與途徑。進一步的生物學實驗表明，按照本發明方法制備的融合蛋白可以與卵巢癌細胞表面的受體靶向結合并且能夠抑制卵巢癌細胞的生長。rhuPAa-蜂毒素抑制卵巢癌細胞生長的機制可能與其能夠誘導卵巢癌細胞凋亡有關，而卵巢癌細胞的凋亡途徑可能與線粒體途徑有關。本發明中的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾后產物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進行修飾。所用的修飾劑可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。本發明中的融合蛋白或其衍生物可以單獨使用，優選的為與一種或多種藥學上可接受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應與融合蛋白相容且不能對受體自身有害，典型的載體為水、鹽水、糖類、醇類或氨基酸，它們須無菌且無致熱原。藥物制劑可通過本領域已知的方法制備。這些方法包括將融合蛋白與一種或多種輔助成分混合的步驟。優選的藥物制劑包括含水的液體制劑和含水量低于10%或不含水的凍干制劑。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類，小分子糖類等。本發明中的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物可以通過任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入等方法給藥。優選的方法為靜脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時間內使用單一劑量或復合劑量。下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。圖1顯示重組質粒rhuPAa-蜂毒素-pPICZa轉化酵母菌DNA的PCR鑒定電泳圖譜其中泳道l、3~5、7-8為不同酵母菌轉化子基因組DNA的PCR產物；泳道2為DNAmarker;泳道6為空質粒轉化的酵母菌基因組DNA的PCR產物。圖2顯示純化的rhuPAa-蜂毒素蛋白質的十二垸基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果(考馬斯亮藍染色)。其中泳道1為純化后的rhuPAa-蜂毒素，M為寬分子量蛋白marker。圖3顯示融合蛋白rhuPAa-蜂毒素的Western免疫印跡分析結果。其中泳道1、2、3和4是本發明制備的rhuPAa-蜂毒素樣品。圖4顯示SKOV3細胞中uPAR免疫熒光染色的結果。圖5顯示透射電子顯微鏡下觀察不同濃度的rhuPAa-蜂毒素對人卵巢癌細胞系SKOV3細胞超微結構的影響。其中圖5A為使用16.0ng/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞超微結構的變化，圖5B為使用g/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞超微結構的變化。圖6顯示不同濃度rhuPAa-蜂毒素對人卵巢癌細胞系SKOV3細胞的增殖周期及凋亡的影響。其中圖6A為使用0ug/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞的增殖周期及凋亡的圖像，圖6B為使用2.0ng/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞的增殖周期及凋亡的圖像，圖6C為使用4.0ug/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞的增殖周期及凋亡的圖像，圖6D為使用8.0yg/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞的增殖周期及凋亡的圖像，圖6E為使用g/mlrhuPAa-蜂毒素組細胞的增殖周期及凋亡的圖像。具體實施方式以下借助實施例描述本發明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。實施例1:人UM3鏈基因的克隆和擴增1、.RNA的制備取手術過程中經快速病理證實為漿液性囊腺癌的卵巢癌組織放入液氮中速凍。使用Trizol試劑(InvitrogenCorp.SanDiego,California，USA.),以一步法提取卵巢癌組織RNA。具體步驟如下-具體地說，首先將冰凍的小塊卵巢癌組織放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀。然后，將碾碎的組織移入1.5ml無RNA酶EP管中，加入約lmlTrizol。再加入200ul氯仿，劇烈振蕩搖勻，室溫下放置30秒。4'C離心(12000r/min)5分鐘后，將上清液小心轉移到另一個無RNA酶的EP管中。向其中加入等體積異丙醇，室溫放置5分鐘，并于4。C離心(12000r/min)5分鐘，棄去上清。加入70%乙醇lml洗滌沉淀兩次，4'C離心(12000r/min)5分鐘。室溫下空氣蒸發殘存乙醇后，將沉淀溶于50ulDEPC水中，進行RNA的分析與定量，取lul樣品稀釋100倍后經紫外分光光度計測定0026。和0028。，按下列公式計算其濃度和純度。RNA含量RNA(ug/ml)40XOD26。X稀釋倍數，0D26。/0D28。=1.82.O表示純度合格。以瓊脂糖凝膠電泳法，觀察RNA的完整性。2、人"Wa鏈基因的克隆(RT-PCR法)取如上提取的人卵巢癌組織總RNAlug，按如下比例建立逆轉錄(RT)反應體系人卵巢癌組織總RNA1yg;10XRNAPCR緩沖液2u1;MgCl2(25腿ol/L)4ul;腦A酶抑制劑(40U/ul)0.5ul;dNTPs(各10mmol/L)2ul;AMV逆轉錄酶(200U/ul)lul;OligodT(20pmol/ul)lul;無RNA酶滅菌水加入至終體積20u1。于PCR儀上42。C反應60分鐘，然后99°C5分鐘使逆轉錄酶滅活。合成cDNA后，按照如下比例建立PCR反應體系上述cDNA反應液20y1;MgCl2(25國ol/L)6u1;10XLAPCR緩沖液8ul;上游引物5，-GTTCCATCGAACTGTGACTG-3，(SEQIDNO:1)1y1(20pmo1/u1);下游引物5'-GGTTCTCGATGGTGGTGAAT-3,(SEQIDNO:2)1"1(20pmol/y1);TaKaRaLATaq(5U/ul)lul;;滅菌超純水至終體積100u1。PCR反應條件是94°C4分鐘；94°C30秒，50°C30秒，72°C1分鐘，共30個循環，然后72。C8分鐘。對擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察片段大小，確定是否得到正確目的基因。3、克隆載體的構建、轉化與擴增回收RT-PCR擴增的人uPAa鏈基因片段進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。回收后，將人uPAa鏈基因片段與T載體16'C連接30分鐘。連接反應體系包括人uPAa鏈RT-PCR產物0.10.3pmol;T載體0.03pmol;溶液I(含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載體試劑盒)5ul;滅菌超純水至終體積10y1。按照常規方法，從37。C培養16小時的XL,-Blue陰性培養板(不含抗生素的LB瓊脂平板)上挑取單個菌落(直徑23mm)，接種于含有100mlLB培養基的1L培養瓶中，以制備感受態大腸桿菌細胞，并于-8(TC凍存備用。取一份凍存的感受態細胞，融化后加入上述連接產物，進行常規轉化。然后取200ul已轉化的感受態細胞涂布于含X-Gal、IPTG(二者可在涂菌前半小時涂于LB瓊脂平板表面)和氨芐青霉素(lOOlig/ml)的LB瓊脂平板上，37。C培養箱中培養1216小時。4、重組載體的鑒定隨機t兆取轉化后的白色單菌落("藍白篩選")，接種于含氨芐青霉素G00ug/ml)的LB培養基中，37t:強烈震蕩培養過夜，然后常規提取質粒DNA。取1u1溶解的DNA沉淀物進行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37。C下用Sall、BglII雙酶切鑒定消化2小時，1%瓊脂糖凝膠電泳后根據內切酶譜鑒定為正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質粒，用于DNA測序分析。實施例2:huPAa-蜂毒素畢赤酵母分泌型表達載體huPAa-蜂毒素-pPICZa表達載體的構建1、構建可任意替換uPAb鏈的huPAa基因真核表達載體骨架huPAa-X-pPICZa取上述測序鑒定正確含有huPAa的克隆質粒100ng，按如下比例在0.2mlEP管中建立PCR反應體系huPAa重組質粒100ng;含Mg"的10XLAPCR緩沖液10ul;dNTPs(各2.5,1/L)8u1;上游引物5'-CTGCTCGAGAAGAGATCTAACGAGCACCAAGTTCCATCGAAC-3，(SEQIDNO:3)lul(20pmol/ul);下游引物5'-CAGGAATTCTCAAATCTTAAACCGCGGGCCTCAGAGTCTTTT-3，(SEQIDNO:4)1yl(20pmol/yl);TaKaRaLATaq(5U/ul)lul;滅菌超純水至終體積100u1。在PCR儀上進行循環擴增。擴增程序為94°C4分鐘；94°C30秒，50°C30秒，72°Cl分鐘，共30個循環，然后72t:8分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，然后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，分離并回收適當大小的PCR產物。2、huPAa-X-pPICZa表達載體的構建用Xhol和EcoRI消化如上述回收的PCR產物huPAa和載體pPICZa，瓊脂糖凝膠電泳定量后，16'C連接過夜。連接反應體系如下目的基因0.10.3pmol;酶切后的載體pPICZa0.03pmol;IOX連接緩沖液1u1;T4DNA連接酶(350U/iU)lul;滅菌超純水至終體積10ul。將連接產物與感受態細胞XLl-blue輕輕混勻，常規方法轉化。取200y1已轉化的大腸桿菌細胞涂布于含Zeocin(25ug/ml)的低鹽LB瓊脂平板上，37°C培養箱培養1216小時。挑取不同的克隆，于LB液體培養基中培養過夜，然后提取質粒，并進行Xhol和EcoRI雙酶切鑒定。選取酶切鑒定正確的克隆，用質粒快速提取試劑盒提取質粒。進行DNA序列測定。3、huPAa-蜂毒素-pPICZa表達載體的構建根據genebank檢索序列，人工合成帶有特異性酶切位點的蜂毒素一組互補的寡核苷酸，5'-AATTCTCATTGTTGTCTCTTTCTCTTAATCCA織甜CM紅TGGCAAACCAGTAGTCAAAACCTTCAAAACAGCACCAATCTTGAACCGC-3'(SEQIDNO:5);5'-GGTTCAAGATTGGTGCTGTTTTGAAGGTTTTGACTACTGGTTTGCCAGCTTTGATTTCTTGGATTAAGAGAAAGAGACAACAATGAG-3，(SEQIDNO:6)兩條鏈各取25umol與0.5molNaCl6ul建立20ul體系，95。C煮2分鐘，80'C煮3分鐘，緩慢冷卻至室溫。互補鏈退火后分別形成帶有SacII和EcoRI粘性末端雙鏈的接頭。用SacII和EcoRI酶切huPAa-X-pPICZa載體，回收并進行瓊脂糖凝膠電泳定量后，16'C連接過夜。連接反應體系如下退火的蜂毒素基因0.10.3pmol;huPAa-X-pPICZa0.03pmol;IOX連接緩沖液1u1;T4DNA連接酶(350U/U1)1U1;滅菌超純水至終體積10nl。將連接產物與感受態細胞XLl-blue輕輕混勻，常規方法轉化。取200ul已轉化的大腸桿菌細胞涂布于含Zeocin(25ug/ml)的低鹽LB瓊脂平板上，37°C培養箱培養1216小時。挑取不同的克隆，于LB液體培養基中培養過夜，然后提取質粒并進行雙酶(XhoI和SacII)切鑒定。選取酶切鑒定正確的克隆，用質粒快速提取試劑盒提取質粒。進行DNA序列測定。實施例3:rhuPAa-蜂毒素畢赤酵母表達體系的建立及篩選取測序正確的培養菌液，按質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進行定量分析。取2025ug表達載體huPAa-蜂毒素-pPICZa，經SacI酶消化(線性化)后用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質粒用10ul超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母X-33的YPD陰性培養板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個菌落，接種于5mlYPD培養基中，250rpm，3(TC震蕩培養8小時，常規方法制備酵母感受態細胞。然后取80u1上述感受態細胞，與2025yg線性化的重組表達質粒混合，移入0.2cm電轉化杯內進行電轉化。取50100y1轉化后的菌液涂布于含Zeocin(100iig/ml)的YPD平板上，30'C培養箱培養23天，觀察轉化子的生長狀況。然后用PCR方法(所使用的引物為上游引物5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，(SEQIDNO:7)和下游引物5'陽ATCGATCTCACAGTGTTGACC-3，(SEQIDNO:8)，反應條件同上)篩選轉化酵母菌。離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進行PCR鑒定，擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否得到預期大小的基因片段。鑒定結果如附圖l所示。實施例4:rhuPAa-蜂毒素的表達和純化1、rhuPAa-蜂毒素的表達取上述鑒定結果陽性的克隆接種于10mlBMGY(pH6.0)培養基中，30。C震蕩培養24小時，至0D6。。達到2.06.0時收集細胞。用等體積(10ml)BMMY(pH6.0)重懸細胞沉淀，3(TC震蕩培養，誘導表達。誘導過程中，每24小時補充一次甲醇至終濃度0.5%，同時補充滅菌超純水，使發酵液總體積保持不變。在培養的第0、24、48、72、96、120、144和168小時等時間點各取0.5ml發酵液，離心收集上清用于蛋白質分析(SDS-PAGE，WesternBlot和N-端氨基酸序列分析)。2、rhuPAa-蜂毒素的純化(1)溶液與試劑溶液A:HAc-NaAc緩沖液200mmol/L(pH4.0);溶液B:20mmol/LHAc-NaAc緩沖液(pH4.0);溶液C:溶液B含2mol/LNaCl;溶液D:1%(v/v)TFA;溶液E:0.1%(v/v)TFA;溶液F:溶液E含100%乙腈。(2)1MonoS陽離子柱層析用10倍柱體積溶液B平衡MonoS陽離子層析柱(Sigma公司)。用0.5mol/LNaOH調整發酵上清液pH值為4.0,離心(12000rpm)10分鐘，去除顆粒物質，而后上清添加1/10體積溶液A緩沖液。以0.5ml/min的速率加樣至MonoS陽離子樹脂，波長280nm,260nm紫外在線監測。加樣結束后，用溶液B沖洗至OD280值降至基線。然后用溶液B和溶液C梯度洗脫，并分部收集蛋白峰。SDS-PAGE方法確定huPAa-蜂毒素的洗脫峰。(3)Source30RPC反相疏水柱層析用10倍柱體積溶液E平衡source30RPC反相疏水層析柱(Sigma公司)。然后將上述收集的蛋白樣品添加1/10體積溶液D。以0.5ml/min的速率加樣，波長280nm,260nm紫外在線監測。加樣結束后，用溶液E沖洗至0028()值降至基線。用溶液E和溶液F進行梯度洗脫，并分部收集蛋白峰。SDS-PAGE方法確定huPAa-蜂毒素的洗脫峰。15%SDS-PAGE分析結果顯示，經此方法純化的huPAa-蜂毒素純度可達到約95%(參見附圖2)。實施例5:rhuPAa-蜂毒素融合蛋白的理化性質鑒定1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用SDS-PAGE法進行蛋白質分子量測定和初步定量分析。方法如下配制15%分離膠5%濃縮膠。分別取每24小時培養物上清按4:1比例加入5XSDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸35分鐘。取上述樣品，冷卻至室溫后，離心(lOOOOrpm)30秒，取上清每孔加樣20yl。40V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調整電壓到IOOV，繼續恒壓電泳分離。考馬斯亮藍染色并脫色后，觀察分析結果。2.表達產物的Western印跡分析按照常規方法將發酵液上清經SDS-PAGE后，轉印到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥3060分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0.2%BSA的TTBS)，室溫輕輕振蕩23小時或4'C封閉過夜。然后，將NC膜放入雜交袋中按0.lml抗體溶液/cr^膜加入兔抗人uPA抗體，室溫振蕩14小時。TTBS漂洗35次后，將用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(1:2001:1000)，加入雜交袋中，與NC膜一起室溫振蕩24小時。加入lml0.3%(W/V)NiCl或CoCl2及10u130%&02溶液。洗膜后，將膜移入顯色液中，室溫下輕輕搖動并觀察顯色反應。結果如附圖3所示。3)表達產物的氨基酸序列分析蛋白質的一級結構是其高級結構的基礎，用基因重組技術表達分泌型蛋白時，表達的異源蛋白在加工成熟過程中容易出現信號肽錯誤切割現象，繼而影響表達產物的高級結構和生物學活性。因此，在SDS-PAGE確定分子量正確的情況下，應對所表達的重組蛋白進行蛋白質N-末端的氨基酸序列測定，以確定其一級結構的正確性。我們的測序結果表明，按照本發明的rhuPAa-蜂毒素融合蛋白具有與預期的氨基酸序列。實施例6:rhuPAa-蜂毒素的生物學活性本實施例通過觀察rhuPAa-蜂毒素對人卵巢癌細胞SKOV3細胞的形態、生長曲線、細胞增殖周期、凋亡、細胞凋亡相關蛋白等的影響，判斷和確定本發明生產的rhuPAa-蜂毒素的生物學活性。1.RT-PCR方法檢測SKOV3細胞株uPAR的表達收集SK0V3L5X1()6個細胞，加lmLTrizol吹打后室溫放置5分鐘。然后提取SKOV3細胞株的RNA(參見實施例1),并以RT-PCR方法檢測uPAR的表達(使用的上游引物為5，一CAGTGTAAGACCAACGGGGAT-3'下游引物5'一TCAGGTTTAGGTCCAGAGGAG-3')。結果表明，在SKOV3細胞株中，uPAR表達量較高。將預先清洗、經多聚賴氨酸處理過高壓消毒的蓋玻片放入24孔培養板。然后將已消化、離心洗滌的SK0V3細胞(用含10%胎牛血清H-DMEM培養液重懸)加入24孔板(0.5ml/孔)。將培養板置于37°C，5%C02孵箱繼續培養，約24小時后培養至細胞對數生長期。實驗組加入huPAa-蜂毒素使其終濃度達到4.0Ug/ml、8.0iig/ml,對照組加入培養液至等體積。24小時后取出24孔板，吸出培養液，加入PBS沖洗兩次。37°C，用4%多聚甲醛固定30分鐘后取出細胞爬片，用蒸餾水沖洗2次。室溫干燥，-2(TC凍存，于兩周內使用。細胞爬片加入蒸餾水水化30分鐘。滴加0.l%TritonX-100，處理10分鐘。0.01MPBS洗三次(5分鐘/次)后，用0.3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶15分鐘后，再次用PBS洗3次并用血清封閉30分鐘。然后傾去血清，加入兔抗人uPAR多克隆抗體，37°C1小時。以PBS代替一抗作為陰性對照。PBS洗3次后加入FITC標記的羊抗兔抗體，室溫避光孵育30分鐘。PBS洗30分鐘(避光)后用甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，SKOV3細胞表面的uPAR表達呈強陽性(見附圖4)。2.本發明的融合蛋白huPAa-蜂毒素對人卵巢癌細胞SKOV3的作用(1)、MTT法測定huPAa-蜂毒素對SK0V3細胞生長的抑制作用取指數生長期的SK0V3細胞(1X104)接種2塊96孔板。其中1塊96孔板為正常加藥組，另外1塊為uPAR抗體拮抗處理后加藥組。每個濃度設3個平行孔。正常加藥組huPAa-蜂毒素濃度分別為0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.4"g/ml、0.8ug/ml、1.6ug/ml、3.2ng/ml、6.4ug/ml、12.8wg/ml，對照組加入10%胎牛血清的H-DMEM培養液至等體積放入37°C，5%(;02孵箱培養。uPAR抗體拮抗后加藥組預先在每孔內加入uPAR抗體20yg/ml，37°C，5%C02培養2小時后再分別按上述濃度加入huPAa-蜂毒素，對照組加入10%胎牛血清的H-DMEM培養液至等體積后放入37r，5%0)2孵箱培養。24小時后取出96孔板，向各孔內加入MTT溶液20ul(5mg/ml)，37°C5%C02孵育4小時后終止培養。小心吸棄孔內上清液，每孔加入100ylDMSO，振蕩10分鐘。待沉淀完全溶解后在Bio-red550酶標儀上測定吸光度值(OD值)。按下列公式分別計算兩組在不同濃度huPAa-蜂毒素作用后的細胞生長抑制率(三次重復的平均值)。以細胞生長抑制率對藥物濃度做曲線，求出IC50。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>結果如下列表1所示。可見拮抗組中存活的細胞明顯多于rhuPAa-蜂毒素組，提示由于在拮抗組中預先加入uPAR多克隆抗體，該抗體可以與SK0V3細胞中的uPAR結合，從而使拮抗組中可供rhuPAa-蜂毒素結合的uPAR的受體數量減少，進而釋放蜂毒素殺傷腫瘤細胞的能力減低。結果表明本發明的rhuPAa-蜂毒素具有耙向結合受體uPAR的能力，也證明融合狀態下的rhuPAa-蜂毒素無毒或者低毒性，融合蛋白只有與其受體結合后才會發揮毒性作用。表1.拮抗組與rhuPAa-蜂毒素組對SKOV3的生長抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)、透射電子顯微鏡觀察將胰酶消化80%融合狀態的SK0V3細胞，細胞計數以1X107接種于250ml培養瓶中。實驗組加入終濃度為4.0ug/ml、8.0ug/ml，huPAa-蜂毒素作用24h。對照組加入至與實驗組等體積的培養液。PBS洗2-3次后，以0.25%胰蛋白酶細胞消化，用含血清的培養液終止反應。800rpm離心5分鐘并用PBS洗2-3次。最后一次離心后，形成的細胞團塊輕加入l一2ml的戊二醛，4'C放置2小時并用1%鵝酸在4'C固定1小時。棄去鵝酸液，PBS洗2次，每次20分鐘。0.5%醋酸雙氧鈾預染，室溫，搖床過夜。用30%、50%、70%、90%，100%梯度乙醇脫水各10—15分鐘，最后用100%乙醇脫水2次每次10分鐘。用Epon812環氧樹脂包埋，LKB-III型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片。P/。(w/v)醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染色。JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察。附圖5所示的結果表明，在一定濃度范圍內，凋亡可能是rhuPAa-蜂毒素抑制卵巢癌細胞生長的作用機制，而在濃度過高時其對卵巢癌細胞的作用可能是直接的。(3)、流式細胞術檢測不同濃度huPAa-蜂毒素對SK0V3細胞周期及凋亡率的影響收集分別經0ng/ml、2.0yg/ml、4.0yg/ml、8.0ug/ml、16.0ug/mlhuPAa-蜂毒素作用24小時的各組SK0V3細胞5X106個；以0.25%胰蛋白酶細胞消化，制成細胞懸液；1000rpm5分鐘離心后PBS清洗2-3次，70%冰乙醇固定，并在4。C下保存。檢測前以1000rpm離心5分鐘，棄上清后加入20ugRNaseA;37。C水浴中保溫30分鐘后，加入800ulPI染液混勻。于4。C下避光保存30分鐘后，在流式細胞儀上檢測。附圖5所示的結果表明，rhuPAa-蜂毒素可通過影響SK0V3細胞的周期分布，使之阻斷在S期，同時誘導SK0V3細胞凋亡，進而抑制卵巢癌細胞的分裂增殖達到抑制其生長的目的。序歹ij表<no>吉林圣元科技有限公司<120>尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈與蜂毒素的融合蛋白及其制備<140><141><160>8<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建克隆載體的PCR擴增引物。<400>1GTTCCATCGAACTGTGACTG<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建克隆載體的PCR擴增引物。<400>2GGTTCTCGATGGTGGTGAAT<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。<400>3CTGCTCGAGAAGAGATCTAACGAGCACCAAGTTCCATCGAAC<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。<400>4CAGGAATTCTCAAATCTTAAACCGCGGGCCTCAGAGTCTTTT<210>5<211>93<2I2>DNA<213>人工序列<220><223>化學合成的蜂毒素的編碼序列。<400>5AATTCTCATTGTTGTCTCTTTCTCTTAATCCAAGAAATCAAAGCTGGCAAACCAGTAGTCAAAACCTTCAAAACAGCACCAATCTTGAACCGC<210>6<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>化學合成的蜂毒素的編碼序列。<400>6GGTTCMGATTGGTGCTGTTTTGMGGTTTTGACTACTGGTTTGCCAGCTTTGATTTCTTGGATTMGAGAMGAGAC.AACAATGAG<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作PCR鑒定的引物。<400>7GACTGGTTCCAATTGACAAGC<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作PCR鑒定的引物。<400>8ATCGATCTCACAGTGTTGACC<221>mutation<222>(13)...(21)<223>額外添加N-糖基化位點突變部分的引物序列<400>25ctgggcgccccaaatactactatctgt27<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220<221>mutation<222>(13)...(21)<223>額外添加N-糖基化位點突變部分的引物序列<400>26ctgggcgccccaaatcacactatctgt27<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列權利要求1、一種由尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈(uPAa)與蜂毒素結合形成的融合蛋白，其中所說的uPAa鏈和蜂毒素分別與天然人uPA和天然蜂毒素至少有85％的序列同源性。2、根據權利要求l的融合蛋白，特征在于所說的融合蛋白是以DNA重組技術產生的。3、根據權利要求1的融合蛋白，特征在于所說的融合蛋白是所使用巴斯德畢赤酵母系統表達產生的。4、根據權利要求1的融合蛋白，特征在于所說的融合蛋白分子中，uPAa與蜂毒素的連接次序是可以互換的。5、權利要求1的融合蛋白在于生產腫瘤治療藥物中的應用。全文摘要本發明提供了一種由尿激酶型纖溶酶原激活劑a鏈與蜂毒素結合形成的融合蛋白、其制備方法及該融合蛋白質在腫瘤治療中的應用。文檔編號A61P35/00GK101337992SQ200710055840公開日2009年1月7日申請日期2007年7月4日優先權日2007年7月4日發明者許天敏,顏煒群申請人:吉林圣元科技有限責任公司