專利名稱：一種非病毒基因轉染載體、其與質粒dna復合物顆粒及制備方法和用法的制作方法
技術領域：
本發明屬于非病毒基因轉染載體的技術領域，涉及非病毒基因轉染載體、其與質粒DNA復合物顆粒及制備方法和用法。
背景技術：
基因治療是指運用DNA轉移來治療甚至預防人類疾患的一種治療方法。近年來，基因治療的發展使得醫治遺傳疾病或癌癥成為可能。成功的基因治療依賴于有效的基因載體。利用病毒載體介導基因轉移是基因治療中應用最廣泛的方法，其中包括逆轉錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等載體。但是病毒類載體在臨床應用中存在著很大的安全隱患。非病毒類載體因其安全、有效、無免疫原性等優點，已成為病毒類載體最有希望的替代者，而且非病毒類載體相對而言便宜易得，在價格上有優勢。
陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)是非病毒類載體受到關注最多的一個，它已經在體外和體內的轉染實驗中得到應用。PEI是通過靜電作用與基因物質復合，形成尺寸合適的復合物顆粒，然后通過細胞對該復合物顆粒的吞噬達到基因轉染的目的。由于PEI自身的“質子泵效應”，它與聚(L-賴氨酸)相比，既不需要裂解胞內體的試劑也不需要溶酶體類或是任何易于受體介導的試劑，因此PEI是陽離子聚合物類基因載體中綜合性能最優異的一個。
但是，PEI作為基因載體仍然存在兩個突出的問題。(1)和病毒類載體相比，其轉染效率不高；(2)PEI胞毒性較大。這兩個問題影響了PEI在臨床治療上的進一步應用，因此對PEI進行改性得到低毒高效的基因轉染載體顯得尤為迫切。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種非病毒基因轉染載體、其與質粒DNA復合物顆粒及制備方法和用法。
本發明的一個目的是提供一種非病毒基因轉染載體，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物；所述的聚乙烯亞胺和含有苯環的疏水單元的質量比為1∶9～4∶6；所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺；所述的含有苯環的疏水單元為γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-芐氧羰基賴氨酸、苯丙氨酸的任一種、兩種以任意比例組合的產物或三種以任意比例組合的產物。
本發明的第二個目的是提供上述一種非病毒基因轉染載體的制備方法。其步驟和條件如下按照聚乙烯亞胺含有苯環的疏水性的氨基酸的N羧酸酐環狀單體的質量比為1∶9～4∶6，將聚乙烯亞胺和含有苯環的疏水性的氨基酸的N羧酸酐環狀單體分別溶于氯仿，攪拌充分溶解，再在攪拌條件下，3小時內將含有苯環的疏水性的氨基酸的N羧酸酐環狀單體的氯仿溶液滴加到聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫反應72小時，將反應液濃縮為為原體積的三分之一以下，然后用是濃縮體積的5～10倍的乙醚沉降，真空干燥得到產物，然后將產物溶于水中，置于透析袋中，用蒸餾水透析48小時，透析液冷凍干燥后，得到一種非病毒基因轉染載體；所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺；所述的含有苯環的疏水單元，選自γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-芐氧羰基賴氨酸、苯丙氨酸的任一種、兩種以任意比例組合的產物或三種以任意比例組合的產物，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物。
本發明的第三個目的是提供上述的一種非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒的制備方法。
(1)一種非病毒基因轉染載體/綠色熒光蛋白質粒DNA復合物顆粒的制備方法，步驟和條件如下取一種非病毒基因轉染載體加水溶解，得到一種非病毒基因轉染載體的水溶液，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌；用二次水配制質粒DNA水溶液，按照一種非病毒基因轉染載體綠色熒光蛋白質粒DNA的質量比為0.1∶1～100∶1，將一種非病毒基因轉染載體的水溶液和質粒DNA水溶液混合，把該水溶液置室溫30分鐘，進一步促進一種非病毒基因轉染載體與質粒DNA復合物顆粒的形成，得到一種非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒；所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺；所述的含有苯環的疏水單元，選自γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-芐氧羰基賴氨酸、苯丙氨酸的任一種、兩種以任意比例組合的產物或三種以任意比例組合的產物，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物。
該復合物顆粒的直徑在50～300nm，表面電位為+5mV～+40mV。
(2)一種非病毒基因轉染載體/熒光素酶質粒DNA復合物顆粒的制備方法，步驟和條件如下一種非病毒基因轉染載體熒光素酶質粒DNA質量比為0.1∶1～100∶1，按照步驟(1)的條件，得到一種非病毒基因轉染載體/熒光素酶質粒DNA復合物顆粒。其粒徑為50-300nm，表面電荷為+5mV～+40mV。
本發明的第四個目的是提供一種非病毒基因轉染載體在體外轉染中的應用方法，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物，其步驟和條件如下(1)HeLa細胞的培養取人宮頸癌細胞(HeLa細胞)，在含有10％小牛血清的培養液中，置于5％CO2、37℃孵箱中連續培養，取對數生長期細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔4×105細胞的密度接種于6孔培養板，孵箱內預培養24小時。
(2)體外轉染轉染前24小時內，將HeLa細胞按4×105/孔種于6孔培養板中，置于5％CO2、37℃孵箱中繼續培養至80～90％融合，轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次，加入一種非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒，以及無血清或者含有10％FBS的DMEM培養基至終體積0.5ml，繼續培養48小時。
(3)體外轉染效率的測定取出培養板，用PBS清洗細胞兩次，然后加入胰酶消化，離心除去上清，然后加入PBS重懸，用流式細胞儀測定細胞轉染效率。
取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計測定轉染效率。
本發明的一種非病毒基因轉染載體還可以對Vero細胞和293T細胞進行轉染，其步驟和條件按照目的四中步驟(1)、(2)和(3)進行。
本發明的第五個目的是提供一種非病毒基因轉染載體在體內轉染中的應用的動物實驗取13周體重為22～25克的BALB/c老鼠，取復合物溶液100μL在后腿肌肉分別注射，48小時后用精諾真活體成像儀觀測體內轉然效果。在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內注入200uL熒光素。10分鐘后，用活體成像系統觀察體內轉染效果。
本發明的一種非病毒基因轉染載體/綠色熒光蛋白質粒DNA復合物顆粒，其對在體外對HeLa細胞的轉染效率最高為75％。轉染的特點是轉染效率高，細胞毒性小。
本發明的一種非病毒基因轉染載體/熒光素酶質粒DNA復合物顆粒，其在體外對HeLa細胞的轉染效率最高為1.7×105RLU/mg。轉染的特點是轉染效率高，細胞毒性小。
本發明的優點是本發明將含苯環的疏水單元引入超支化聚乙烯亞胺，降低了聚乙烯亞胺的電荷密度，降低了細胞毒性。同時由于帶苯環的疏水單元可以增加載體與細胞膜的融合作用，這可以增加細胞對載體的吞噬效率，有利于提高轉染效率。


圖1是不同材料不同濃度條件下的細胞毒性與聚乙烯亞胺比較的結果。
圖2是PP-1064介導綠色熒光蛋白質粒對HeLa細胞轉染后的熒光照片(bar＝50μm)。
圖3是體內轉染實驗效果圖。由圖3可見，聚乙烯亞胺-谷氨酸卞酯共聚物載體可以介導熒光素酶質粒在小鼠體內有適當的目的基因表達。
具體實施例方式
實施例1聚乙烯亞胺-γ-卞酯-L-谷氨酸共聚物的制備取分子量分別為1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亞胺1g，加100mL氯仿溶解。
γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體溶于氯仿中，配成1％wt濃度的氯仿溶液。磁力攪拌下，按照聚乙烯亞胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體的質量比為1∶9～4∶6的比例，將γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體的氯仿溶液滴加到聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，3小時內滴加完畢，反應在室溫下進行72小時。反應完全后，用乙醚將反應物沉降出來，真空干燥。然后將產物溶于二次水，對該二次水溶液透析48小時，透析液冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺-γ-卞酯-L-谷氨酸共聚物。產物低溫干燥保存。產物的組成和分子量用核磁和元素分析的方法來確定，結果見表1。
表1聚乙烯亞胺-γ-卞酯-L-谷氨酸共聚物共聚物的合成

實施例2聚乙烯亞胺-ε-芐氧羰基賴氨酸共聚物的制備取分子量分別為1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亞胺1g，加100mL氯仿溶解。
ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐環狀單體溶于氯仿中，配成1％wt濃度的氯仿溶液。磁力攪拌下，按照聚乙烯亞胺和ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐環狀單體的質量比為1∶9～4∶6，將ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐環狀單體的氯仿溶液滴加到聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，3小時內滴加完畢，反應在室溫下進行72小時。反應完全后，用乙醚將反應物沉降出來，真空干燥。然后將產物溶于二次水，對該二次水溶液透析48小時，透析液冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺-ε-芐氧羰基賴氨酸共聚物。產物低溫干燥保存。產物的組成和分子量用核磁和元素分析的方法來確定，結果見表2。
表2聚乙烯亞胺-ε-芐氧羰基賴氨酸共聚物的合成

實施例3聚乙烯亞胺-苯丙氨酸共聚物的制備取分子量分別為1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亞胺1g，加100mL氯仿溶解。苯丙氨酸的N羧酸酐環狀單體溶于氯仿中，配成1％wt濃度的氯仿溶液。磁力攪拌下，按照聚乙烯亞胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體的質量比為1∶9～4∶6的比例，將γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體的氯仿溶液滴加到聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，3小時內滴加完畢，反應在室溫下進行72小時。反應完全后，用乙醚將反應物沉降出來，真空干燥。然后將產物溶于二次水，對該二次水溶液透析48小時，透析液冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺-苯丙氨酸共聚物。產物低溫干燥保存。產物的組成和分子量用核磁和元素分析的方法來確定，結果見表3。
表3聚乙烯亞胺-苯丙氨酸共聚物的合成

實施例4聚乙烯亞胺-(γ-卞酯-L-谷氨酸-ε-芐氧羰基賴氨酸-苯丙氨酸)共聚物的制備取分子量分別為1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亞胺1g，加100mL氯仿溶解。γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體、ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐環狀單體和苯丙氨酸苯丙氨酸的N羧酸酐環狀單體按照任意比例溶于氯仿中，配成1％wt濃度的氯仿溶液。磁力攪拌下，按照聚乙烯亞胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐環狀單體、ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐環狀單體和苯丙氨酸苯丙氨酸的N羧酸酐環狀單體混合物的質量比為1∶9～4∶6的比例，將混合的環狀單體的氯仿溶液滴加到聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，3小時內滴加完畢，反應在室溫下進行72小時。反應完全后，用乙醚將反應物沉降出來，真空干燥。然后將產物溶于二次水，對該二次水溶液透析48小時，透析液冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺-(γ-卞酯-L-谷氨酸-ε-芐氧羰基賴氨酸-苯丙氨酸)共聚物。產物低溫干燥保存。產物的組成和分子量用核磁和元素分析的方法來確定，結果見表4表4聚乙烯亞胺-(γ-卞酯-L-谷氨酸-ε-芐氧羰基賴氨酸-苯丙氨酸)共聚物的合成

實施例5一種非病毒基因轉染載體的細胞毒性評價材料的細胞毒性采用MTT方法評價。在96孔細胞培養板的每孔中植入1.0×105的細胞，DMEM培養液中含10％FBS，100units/ml青霉素，100μg/mL鏈霉素，在37℃，5％CO2孵箱中培養24h。配制不同濃度的載體的PBS溶液。然后在每孔中加入100μL的載體聚合物溶液，在37℃，5％CO2孵箱中繼續培養24h。然后加入20μL MTT溶液[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，5mg/ml in PBS]。混合物在37℃繼續作用4h，加入200μL DMSO溶解MTT甲臢(formazan)結晶10min。然后用ELISAmicroplate reader(Bio-Rad)酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細胞存活率按下公式計算細胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100Asample是與聚合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，Acontrol是不與聚合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次。圖1是不同材料不同濃度條件下的細胞毒性與聚乙烯亞胺比較的結果。由圖1可見，濃度為0.5mg/mL的PEI和細胞作用24小時后，只有不超過25％的細胞存活，而濃度為5mg/mL的含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物和細胞作用24小時，仍然有超過40％的細胞存活。由此可見，含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物的細胞毒性和聚乙烯亞胺相比有了顯著的下降。
實施例6一種非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒的制備取一種非病毒基因轉染載體，加二次水溶解，配置成濃度為0.02～2mg/mL的水溶液，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌、待用。取質粒，用二次水溶解配置成濃度為0.02mg/mL的水溶液。將不同濃度的含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物水溶液和質粒水溶液等體積混合，保證含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物和質粒的質量比在0.1∶1～100∶1之間。混合后的復合物顆粒水溶液在室溫下孵育10分鐘后，再進行下一步的轉染實驗。按照上述方法制備的復合物顆粒的組成及性能如表5所示。
表5一種非病毒基因轉染載體與質粒DNA的復合



實施例7一種非病毒基因轉染載體/綠色熒光蛋白質粒DNA復合物顆粒的體外轉染實驗1、HeLa細胞的培養取人宮頸癌細胞(HeLa細胞)，在含有10％小牛血清的培養液中連續培養(5％CO2、37℃孵箱)。取對數生長期細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔4×105細胞的密度接種與6孔培養板，孵箱內預培養24小時。
2、體外轉染轉染前24小時內，將HeLa細胞按4×105/孔種于6孔培養板中，置于5％CO2、37℃孵箱中繼續培養至80～90％融合。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次后，加入含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物/綠色熒光蛋白質粒DNA復合物顆粒以及含有10％FBS的DMEM培養基至終體2ml，繼續培養48小時。
3、體外轉染效率的測定取出培養板，用PBS清洗細胞兩次，然后加入胰酶消化，離心除去上清，然后加入PBS重懸，用流式細胞儀測定細胞轉染效率。
表6給出了表5所列的部分載體介導綠色熒光蛋白質粒對HeLa細胞的轉染效率，圖2給出了PP-1064介導綠色熒光蛋白質粒對HeLa細胞轉染后的熒光照片。
表6一種非病毒基因轉染載體介導綠色熒光蛋白質粒對HeLa細胞的轉染效率

實施例8一種非病毒基因轉染載體/熒光素酶質粒DNA復合物顆粒的體外轉染實驗細胞培養同實施例7的方法。
2、體外轉染轉染前24小時內，將HeLa細胞按1×104/孔種于96孔培養板中，置于5％CO2、37℃孵箱中繼續培養至80～90％融合。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次后，加入含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物/熒光素酶質粒DNA復合物顆粒以及含有10％FBS的DMEM培養基至終體積200μL，繼續培養48小時。
3、體外轉染效率的測定取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計測定轉染效率。
表7給出了表5所列的部分包含熒光素酶質粒的復合物的轉染效率。
表7一種非病毒基因轉染載體介導熒光素酶質粒對HeLa細胞的轉染效率

實施例9一種非病毒基因轉染載體/綠色熒光蛋白質粒DNA復合物顆粒對不同細胞的體外轉染實驗Vero細胞和293T細胞的培養同實施例7中HeLa細胞的培養方法。按照實施例7中的轉染方法和測試方法，采用表5中的PP-256400形成的復合物，對HeLa細胞、Vero細胞和293T細胞進行體外轉染，其轉染效率如表8所示。
表8 聚乙烯亞胺載體介導綠色熒光蛋白質粒對不同細胞的體外轉染實驗

一種非病毒基因轉染載體/綠色熒光蛋白質粒DNA復合物顆粒，對HeLa細胞的轉染效率最高，對Vero和293T細胞的轉染效率要低一些。
實施例10一種非病毒基因轉染載體在不含血清條件下的體外轉染1、HeLa細胞的培養如實施例7。
2、體外轉染轉染前24小時內，將HeLa細胞按4×105/孔種于6孔培養板中，置于5％CO2、37℃孵箱中繼續培養至80～90％融合。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次后，加入復合物顆粒以及不含血清的DMEM培養基至終體2mL，繼續培養6小時。然后吸去培養液，加入2mL的含有10％FBS的DMEM培養基，繼續培養42小時。
3、體外轉染效率的測定如實施例7。
表9給出了一種非病毒基因轉染載體在不含血清條件下的體外轉染并且與含血清條件下的轉染效率進行了對比。
表9一種非病毒基因轉染載體在含血清和不含血清條件下的體外轉染效率比較

與一些商業化的陽離子基因轉染載體不一樣，本專利制備的一種非病毒基因轉染載體在含血清條件下比不含血清條件下的轉染效率更高一些，這對本發明制備的一種非病毒基因轉染載體體內應用是非常有益的。
實施例11一種非病毒基因轉染載體的體內轉染實驗取13周體重為22～25克的BALB/c老鼠，在后腿肌肉分別注射復合物取表5中的復合物溶液1#和2#100L，48小時后用精諾真活體成像儀觀測體內轉然效果。在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內注入200uL熒光素。10分鐘后，用活體成像系統觀察體內轉染效果，結果如圖3。
由圖3可見，含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物可以介導熒光素酶質粒在小鼠體內有適當的目的基因表達。
權利要求
1.一種非病毒基因轉染載體，其特征是其是含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物；所述的聚乙烯亞胺和含有苯環的疏水單元的質量比為1∶9～4∶6；所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺；所述的含有苯環的疏水單元為γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-芐氧羰基賴氨酸、苯丙氨酸的任一種、兩種以任意比例組合的產物或三種以任意比例組合的產物。
2.根據權利要求1所述的非病毒基因轉染載體的制備方法，其特征在于，其步驟和條件如下按照聚乙烯亞胺∶含有苯環的疏水性的氨基酸的N羧酸酐環狀單體的質量比為1∶9～4∶6，將聚乙烯亞胺和含有苯環的疏水性的氨基酸的N羧酸酐環狀單體分別溶于氯仿，攪拌充分溶解，再在攪拌條件下，3小時內將含有苯環的疏水性的氨基酸的N羧酸酐環狀單體的氯仿溶液滴加到聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫反應72小時，將反應液濃縮為原體積的三分之一以下，然后用是濃縮體積的5～10倍的乙醚沉降，真空干燥得到產物，然后將產物溶于水中，置于透析袋中，用蒸餾水透析48小時，透析液冷凍干燥后，得到一種非病毒基因轉染載體；所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺；所述的含有苯環的疏水單體，選自γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐、ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐、苯丙氨酸的N羧酸酐的任一種以及γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐與ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐兩者以任意比例混合在一起、ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐與苯丙氨酸的N羧酸酐混合在一起、γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐與苯丙氨酸的N羧酸酐兩者混合在一起、γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐和ε-芐氧羰基賴氨酸的N羧酸酐和苯丙氨酸的N羧酸酐三者以任意比例混合在一起，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物。
3.一種非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒的制備方法，其特征在于，其步驟和條件如下取一種非病毒基因轉染載體加水溶解，得到一種非病毒基因轉染載體的水溶液，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌；用二次水配制質粒DNA水溶液，按照一種非病毒基因轉染載體∶質粒DNA的質量比為0.1∶1～100∶1，將一種非病毒基因轉染載體的水溶液和質粒DNA水溶液混合，把該水溶液置室溫30分鐘，進一步促進一種非病毒基因轉染載體與質粒DNA復合物顆粒的形成，得到一種非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒；所述的非病毒基因轉染載體是指含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物，所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺；所述的含有苯環的疏水單元，選自γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-芐氧羰基賴氨酸、苯丙氨酸的任一種、兩種以任意比例組合的產物或三種以任意比例組合的產物，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物，所述的一種非病毒基因轉染載體為含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物。
4.如權利要求3所述的非病毒基因轉染載體/質粒DNA復合物顆粒的制備方法，其特征在于，所述的質粒DNA是綠色熒光蛋白質粒。
5.如權利要求3所述的一種非病毒基因轉染載體，/質粒DNA復合物顆粒的制備方法，其特征在于，所述的質粒DNA是熒光素酶質粒。
6.如權利要求1所述的一種非病毒基因轉染載體的應用，其特征在于，利用含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物在體外基因轉染中作為基因轉染載體。
7.如權利要求1所述的非病毒基因轉染載體的應用，其特征在于，利用含有苯環疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物在體內基因轉染中作為基因轉染載體。
全文摘要
本發明屬于非病毒基因轉染載體的技術領域，涉及一種非病毒基因轉染載體、其與質粒DNA復合物顆粒及制備方法和用法。所述的聚乙烯亞胺和含有苯環的疏水單元的質量比為1∶9～4∶6；所述的聚乙烯亞胺為平均分子量為1.8K～25K的超支化聚乙烯亞胺(PEI)；所述的含有苯環的疏水單元為γ－卞酯－L－谷氨酸、ε－芐氧羰基賴氨酸、苯丙氨酸的任一種、兩種以任意比例組合的產物或三種以任意比例組合的產物。該含有苯環的疏水單元的水溶性聚乙烯亞胺改性物與基因物質復合形成表面帶正電荷，粒徑在50～300nm的復合物顆粒。該復合物顆粒可以將負載的基因物質轉移到細胞內，實現基因物質的表達，完成轉染過程。本發明制備的非病毒基因轉染載體具有毒性低、轉染效率高的特點，可以作為體內和體外的轉染試劑使用。
文檔編號A61K9/16GK101085356SQ20071005579
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月21日 優先權日2007年6月21日
發明者陳學思, 田華雨, 陳磊, 王宇, 夏加亮, 陳杰, 景遐斌 申請人:中國科學院長春應用化學研究所