專利名稱：：一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標準的制作方法
技術領域：
：本發明屬于中藥研究領域，具體涉及一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標準。技術背景馬兜鈴酸類成分是一系列硝基菲類化合物，普遍存在于馬兜鈴屬(^7'sto/oc;'a印p.)、細辛屬植物中，長期或超量不規范的服用含馬兜鈴酸的中藥可導致馬兜鈴酸腎病。國家食品藥品監督管理局取消關木通、廣防己、青木香的藥用標準，并規定以木通、粉防己、土木香代替入藥或臨床配方。然而含馬兜鈴酸的中藥材尚有很多應用于臨床，如馬兜鈴、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風、細辛等，所涉及的中成藥近300種，僅靠替代品代替原來的藥材使用或者簡單禁用并不能有效解決所有含馬兜鈴酸中藥的問題，應該充分發揮中醫藥的優勢，采用炮制手段達到減毒、去毒的目的，保證臨床安全合理用藥。為此，根據馬兜鈴酸類成分的性質，設計了一種去除馬兜鈴酸類毒性成分的方法。馬兜鈴酸難溶于水，或較少被水煎出，分子結構中具有羧基，可以與強堿弱酸鹽發生置換反應而溶于水，用清水洗去殘余的鹽溶液及飲片中殘余的馬兜鈴酸鈉；并且碳酸氫鈉不和藥材中的其它酚類成分結合，可以使飲片中的酚類化合物得到保留而不流失；醋制的方法可使飲片中的痕量馬兜鈴酸鹽(易于被水煎出)還原為馬兜鈴酸(難溶于水)，臨床水煎時，才不易被煎出，同時醋制還能增強藥材的止痛作用。有關馬兜鈴酸的專利只有一個含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血液樣品預處理方法(申請號200410033845)，該專利涉及含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特點為含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的血漿或血清樣品用鹽酸酸化后釆用乙酸乙酯進行萃取處理，所述的血漿或血清包括人、大鼠、小鼠、家兔等，釆用該方法制備得到的血漿或血清樣品中馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的提取回收率均大于95%。該專利與本申請的內容無關。糊贈本發明的目的在于提供一種去除含馬兜鈴酸類成分的中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標準，以保證臨床用藥安全。具體實施方式為達到上述目的，本發明通過下述技術方案予以實施。1、本發明通過以下步驟去除藥材中的馬兜鈴酸類成分(1)藥材采用濃度為0.01N-0.2N的鹽浸泡12h48h，鹽水用量為510倍(V/W)，優選0.05NaHC036倍量浸泡24h;清水淋洗35次，洗去藥材中殘余的鹽溶液及殘余的馬充鈴酸鈉；切片212mm，優選56mm;清水浸泡2~6h，優選3h;重復上述鹽泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程3~12次，優選67次；瀝干，再用米醋進行浸泡或淋灑，悶制3h，文火炒干，米醋用量為原藥材量10%~40%(V/W)，優選20%。表1鹽制工藝參數的優選\^號實^\A(NaHC03濃度)B(水用量)C(切片厚度)D馬兜鈴酸A去除率(％)11(0.2NNaHCO3)1(IO倍量)1(1(M2m)186.4021(0.2NNaHCO3)2(8倍量)2(5~6mm)287.8931(0.2NNaHCO3)3(5倍量)3(2~3mm)388.5942(0.1NNaHCO3)1(IO倍量)2(5~6mm)391.992(0.1NNaHCO3)2(8倍量)3(2~3mm)191.1562(0.1NNaHCO3)3(5倍量)1(1(M2m)28謹73(0.05NNaHCO3)1(IO倍量)3(2~3mm)296.5583(0.05NNaHCO3)2(8倍量)1U(M2m)392.1693(0.05NNaHCO3)3(5倍量)2(5~6mm)193.82EI262.88274.94267.16271.37EII271.74271.20273.70273.04￡111282.53271.01276.29272,74￡Y=817.15I均值87.6391.6589.0590.46CT=74192.68II均值90.5890.4091.2391.01III均值94.1890.3492.10卯.91方差分析結果表明，A因素對藥材中馬兜鈴酸去除率有極其顯著影響；C因素對去除率有顯著的影響，直觀分析中水平2和3的差距很小；B因素對去除率無顯著的影響。因此，綜合考慮工業生產的要求，實現卯％以上的馬兜鈴酸A的去除工藝優選NaHCO3濃度為0.05N，水用量為6倍量，切片厚度為56咖。為得到馬兜鈴酸A殘留量在lOppm的飲片，我們繼續重復上述工藝，結果見表2，在第6天以后，馬兜鈴酸A(簡稱AA)的殘留量逐步降低，均在10ppm以下。表2不同炮制時間青木香中馬兜鈴酸A去除率比較第6天第1批第6天第2批第6天第3批第7天第l批第7天第2批第7天第3批第9天第l批第9天第2批第9天第3批AA含量5.287.516.232.803.172.771.051.140.97AA去除率/%99.4999.2799.4099.7399,6999.7399.9099.8999.91平均值/%99.3899.7299.90注青木香生品中AA含量為1033.89嗎'g—1。(2)醋制藥材經鹽泡、清水浸泡、淋洗過程，飲片中尚含有痕量的馬兜鈴酸鹽，煎煮時易于被水煎出，考慮采用醋酸(弱酸)將馬兜鈴酸鹽還原為難溶于水的馬兜鈴酸，同時醋制還能增強藥材的止痛作用。表3醋制工藝參數優選醋用量水煎液中馬兜鈴酸A水煎液中馬兜鈴酸AMean(kg/100kg原藥材)含量(pg/g)煎出率(％)(o/o)4.9714.2204.1911.914.25.8216.68.0622.9156.5818.720.36.7919.35.9917.0106.7519.218.46.6819.02、本發明所得飲片中馬兜鈴酸含量的限量標準色譜條件與系統適應性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-乙酸(68:32:1)為流動相；檢測波長為390nm。理論塔板數按馬兜鈴酸A峰計算應不低于2000。對照品溶液的制備精密稱取馬兜鈴酸A對照品11.83mg，用無水乙醇溶于10mL容量中，搖勻、定容。精密稱取lmL至10mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每lmL中含馬兜鈴酸A0.lmg)。供試品溶液的制備取本品粉末(過40目篩)約1.5g，精密稱定，置于50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇10%甲酸水(4:1)25mL，浸泡1小時后，稱重。超聲處理3次，每次15分鐘，補足重量，從中吸取約13mL，離心GOOO轉'min—1，lOmin)，精密吸取10mL至蒸發皿中，蒸干，用甲醇10%甲酸水(4:1)溶解，定容至2mL容量瓶中，濾過，取續濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20wL，注入液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算，含馬兜鈴酸A不得超過10ppm(mg/kg)。實例l關木通炮制稱取關木通生品500g，用濃度為0.1NNaHC03溶液10倍量浸泡24h，以清水洗3次，每次約10倍量水，洗至無色后再浸泡下一次，重復浸泡一淋洗5次，瀝干，醋制，悶透，炒干，得去除馬兜鈴酸的關木通制品，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進行分析，制品中馬兜鈴酸的去除率在93%以上。實例2青木香炮制河北安國青木香生品10kg，用濃度為0.05NNaHCO3溶液6倍(V/W)浸泡24h，清水淋洗3次，切片56mm，清水浸泡3h,重復上述堿泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程6次，瀝千，醋制，悶制3h，文火炒干，即得去除馬兜鈴酸的青木香飲片，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進行分析，制青木香中馬兜鈴酸的去除率達99%以上，馬兜鈴酸A殘留量為5ppm。實例3青木香炮制河北安國青木香生品10kg,用濃度為0.05NNaHCO3溶液6倍(V/W)浸泡24h，清水淋洗3次，切片56mm，清水浸泡3h，重復上述堿泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程8次，瀝干，醋制，悶制3h，文火炒干，即得去除馬兜鈴酸的青木香飲片，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進行分析，制青木香中馬兜鈴酸的去除率達99.9%以上，馬兜鈴酸A殘留量為lppm。實例4細辛炮制稱取細辛生品3kg，用濃度為0.05NNaHCO3溶液6倍(V/W)浸泡24h,清水淋洗3次，清水浸泡3h,重復上述堿泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程5次，瀝干，醋制，悶制3h，文火炒干，即得去除馬兜鈴酸的青木香飲片，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進行分析，制青木香中馬兜鈴酸的去除率達99.99%以上，馬兜鈴酸A殘留量為100ppb。實例5炮制前后青木香的解痙作用比較采用新斯的明負荷小鼠模型比較青木香炮制前后的解痙作用，結果表明新斯的明在0.11mg/kg,b.w劑量下可引起小鼠腸運動加快(pO.Ol)，造成腸痙攣模型。青木香生品和炮制品在小、中劑量(10、20g飲片/kg)—次性灌胃給藥均能夠明顯抑制新斯的明誘導的胃腸運動加快(P<0.05、PO.Ol，P<0.01、PO.01);青木香生品、炮制品40g飲片/kg—次性灌胃給藥更加明顯的抑制新斯的明誘導的胃腸運動加快(PO.Ol、PO.01);抑制的作用強度為47.98、49.84%;但青木香生品和炮制品的水煎液對新斯的明誘導的胃腸運動加快與對照組比較無明顯的抑制作用。青木香炮制品/生品對新斯的明引起的腸運動加快的抑制作用呈現出劑量-效應關系，且在同等劑量下，炮品對腸蠕動的抑制率高于生品。表4青木香炮制前后醇提物對新斯的明負荷小鼠腸運動的影響(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較*P<0.05**P<0.01實例6青木香炮制前后鎮痛作用比較采用熱刺激甩尾試驗和化學刺激冰醋酸扭體試驗比較青木香炮制前后的鎮痛作用，結果表明小鼠一次性灌胃給予青木香生品、炮制品的水煎液和青木香生品醇提物7.5、15.0g飲片/kg，青木香炮制品醇提物7.5g飲片/kg后，對小鼠lh、2h熱刺激甩尾的痛閾值無明顯的影響，陽性對照藥安乃近和青木香炮制品醇提物15.0g飲片/kg分別可使小鼠lh的熱刺激甩尾的痛閾值明顯提高(P<0.05、P<0.01)。給小鼠一次性灌胃給予青木香生品水煎液7.5g飲片/kg和青木香生品醇提物7.5、15.0g飲片/kg，炮制品醇提物7.5g飲片/kg后，對冰醋酸誘導的扭體反應出現時間(潛伏期)無明顯的延長作用；青木香生品水煎液7.5g飲片/kg，炮品醇提物7.5g飲片/kg對冰醋酸誘導的小鼠扭體次數無明顯的減少作用，但青木香生品水煎液15g飲片/kg、炮制品水煎液7.5、15.0g飲片/kg、生品醇提物7.5、15.0g飲片/kg，炮制品醇提物15.0g飲片/kg均能顯著抑制冰醋酸誘導的小鼠扭體次數(P0.05、P<0.05、PO.Ol、P<0.05、PO.Ol、PO.05)。青木香生品水煎液15.0g飲片/kg，炮制品水煎液7.5、15.0g飲片/kg，炮制品醇提物15.0g飲片/kg均可明顯延長冰醋酸誘導的小鼠出現扭體反應的潛伏期(PO.Ol，P<0.05、P<0.01，PO.05),并可顯著抑制冰醋酸誘導的小鼠扭體次數P<0.01。表5青木香炮制前后醇提物對小鼠甩尾時間的影響(11=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6青木香炮制前后醇提物抑制冰醋酸扭體實驗(11=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與對照組比較*P<0.05**P<0.01實例7青木香炮制前后抗炎作用比較采用二甲苯致小鼠耳殼腫脹法比較青木香炮制前后抗炎作用，結果表明一定量的二甲苯涂抹于小鼠耳廓內外兩側可造成小鼠的耳廓炎癥模型。對二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥模型，青木香生藥的水煎液要達到20g/kg.b.w的劑量，才有抗炎作用，而青木香炮品在5，lOgZkg.b.w劑量下就具有顯著的抗炎作用。青木香藥材的抗炎作用可能存在一個有效的劑量范圍，低于或高于這一有效劑量范圍內，其抗炎作用都不顯著。表7青木香炮制前后抗炎作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與對照組比較*P<0.05**P<0.019實例8炮制前后青木香的急性毒性比較小鼠飼養兩天無異常后，實驗前給小鼠禁食(不禁水)14h，然后隨機分組，每組10只，雌雄各半。受試藥物分兩次灌胃給藥，0.4ml/10gb.w.，組間劑量比1:0.75，觀察藥后7天內動物的狀態，死亡情況及死亡時間的分布趨勢。死亡動物立即尸解，肉眼觀察主要臟器病理改變情況，以機率單位法計算半數致死量(LD50)。表8青木香生品對小鼠LD5o的測定結果劑量(g/kg)對數劑量動物數死亡數死亡率(%)機率單位267.002.42651010100—200.302.3017108805.84150.232.1768106605.25112.702.0519102204.1684.531.92701000—表9青木香炮品對小鼠LDso的測定結果劑量(g/kg)對數劑量動物數死亡數死亡率(％)機率單位1500.001125.00843.75632.81474.60356.003.17613,05122.92622.80132.67632.551510101010101010643201006040302005.254.754.484.16從表8、9可知，青木香生品的急性毒性高于青木香炮制品的5.78倍，由此證明青木香本發明方法處理后，已經達到了減毒的目的。權利要求1.一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標準，其特征在于該方法多次重復用鹽泡-淋洗-清水浸泡-淋洗過程，再瀝干、醋制，獲得去除率達99％以上的炮制品飲片。2.權利要求1中的弱酸鹽，其特征在于馬兜鈴酸分子結構中的羧基與弱酸強堿鹽發生置換反應，使馬兜鈴酸鹽溶于水而從藥材中除去，弱酸強堿鹽包括碳酸根、碳酸氫根的鈉、鉀鹽，優選NaHC03;NaHC03的濃度為0.01N0.2N，優選0.05N;鹽水的用量為510倍，優選68倍；浸泡時間12h48h，優選1224h。3.權利要求l中的淋洗，其特征在于用純凈水洗去按照權利要求2中制備的鹽泡飲片中殘余的鹽及殘余的馬兜鈴酸鹽，淋洗次數為36次，優選23次。4.權利要求l中的清水浸泡，其特征在于按照權利要求3制備的飲片繼續用清水浸泡26h，優選3h。5.權利要求l中的多次重復，其特征在于將權利要求2~4制備的飲片繼續重復鹽泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程312次，優選57次。6.權利要求l中的瀝干，其特征在于將權利要求5制備的飲片干燥，包括曬干、瀝干、晾干、烘干，優選瀝干。7.權利要求l中的醋制，其特征在于將權利要求26制備的飲片用酸使飲片中的痕量馬兜鈴酸鹽還原為馬兜鈴酸。弱酸選擇可供藥用和食用的有機酸，優選醋酸、米醋；醋制方法采用醋泡或醋淋，悶制3h，再用文火炒干；醋的用量為原藥材量(V/W)10%~40%，優選20%。8.根據權利要求17所制備的藥材飲片，其馬兜鈴酸含量應小于10mg/kg。全文摘要本發明涉及一種去除中藥中馬兜鈴酸類有毒成分的方法及其限量標準。該方法針對含馬兜鈴酸的中藥材，多次重復弱酸強堿鹽水浸泡-淋洗-清水浸泡-淋洗過程，再瀝干、醋制，獲得馬兜鈴酸去除率達到99％以上的炮制品飲片。本發明的特點在于通過獨特的炮制方法，能夠實現選擇性去除含馬兜鈴酸中藥中有毒成分馬兜鈴酸的目的，同時通過系統的評價，制定了馬兜鈴酸的限量標準。文檔編號A61K36/185GK101264116SQ20071006439公開日2008年9月17日申請日期2007年3月14日優先權日2007年3月14日發明者劉鳳山,李建榮,王智民,王維皓,王金華,高慧敏申請人:中國中醫科學院中藥研究所