專利名稱：無指盤臭蛙免疫調節肽、其基因和變異體及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明提供一種無指盤臭蛙(Rana grahami)免疫調節肽、其基因和變異體及其在制藥中的應用，屬生物醫學技術領域。
背景技術：
在中國的傳統中藥和民族醫藥中，許多兩棲類動物被作為藥材而被廣泛的應用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylaranaguentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報道藥理活性有廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮痛、免疫調節、對心血管系統的作用等，另一方面，傳統中藥藥物成分的復雜性及其炮制方法的局限性也是造成藥物活性成分不能更好發揮作用的重要原因，因而從這些傳統藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現代化的重要內容之一。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經成為新藥發明的熱點。國外學者已從東方鈴蟾中分離出一低分子量具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的多肽BSTI，而國內學者從大蹼鈴蟾中分離到了具有絲氨酸蛋白酶抑制作用的多肽BMTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到了具有舒張血管和降壓作用的bufokinin和ranakinin。從北美豹蛙和阿伯蛙中分離到了具有免疫調節和抗腫瘤作用的亮精肽和酪精肽。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發前景。
我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性蛋白肽類物質的研究還較少。無指盤臭蛙主要分布于我國的云南，四川和廣西等省，是我國的特色資源動物之一。
發明人將本發明的無指盤臭蛙免疫調節多肽及其變異體全序列氨基酸結構經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽。發明人將本發明的無指盤臭蛙免疫調節肽編碼基因經基因數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同基因。

發明內容
本發明的目的是基于上述現有技術基礎，提供一組具有強烈的免疫調節活性，同時具有較強的腫瘤細胞生長抑制活性的無指盤臭蛙指盤臭蛙免疫調節多肽、其基因和變異體及其在制藥中的應用。
為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案無指盤臭蛙免疫調節多肽其特征是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點9.84，具有強烈的免疫調節活性和抗腫瘤活性，無指盤臭蛙免疫調節肽的全序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。
無指盤臭蛙免疫調節肽基因的克隆包括無指盤臭蛙皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法篩選無指盤臭蛙蛋白酶抑制劑基因。擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3‘PCR Primer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定。基因測序結果表明編碼無指盤臭蛙免疫調節肽的基因由307個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct 120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt 180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat 240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300aaaaaaa 307編碼成熟無指盤臭蛙免疫調節肽序列的為第141-186位核苷酸，其氨基酸序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙免疫調節肽的變異體，其變異體如下免疫調節肽2，第7位的甘氨酸突變為谷氨酸Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體的制備方法根據編碼無指盤臭蛙免疫調節肽的基因推斷無指盤臭蛙免疫調節肽的氨基酸序列，利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙免疫調節肽的突變體，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱脫鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
本發明的無指盤臭蛙免疫調節肽、基因和變異體作為制備免疫調節、腫瘤治療、化療藥物的應用。
本發明的有益效果在于由無指盤臭蛙免疫調節肽編碼基因推導其氨基酸結構，利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙免疫調節肽的突變體，合成的無指盤臭蛙免疫調節肽及其突變體具有顯著的免疫調節和抑制腫瘤生長的作用。該組無指盤臭蛙免疫調節肽及其突變體具有結構簡單、人工合成方便、抑制腫瘤效果明顯的有益特點。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于此。
無指盤臭蛙免疫調節肽基因克隆I、無指盤臭蛙皮膚總RNA提取A.活體無指盤臭蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為無指盤臭蛙皮膚總RNA。
II、無指盤臭蛙皮膚mRNA的純化無指盤臭蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的PolyATtractmRNAIsolation Systems試劑盒。
A.取無指盤臭蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。
C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的無指盤臭蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III、無指盤臭蛙皮膚cDNA文庫構建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNALibrary Construction Kit質粒cDNA文庫構建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)1.在0.5ml無菌的離心管加入1μl無指盤臭蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達到5μl。
2.混勻離心管中的試劑并以12000rpm離心1分鐘，72℃保溫2分鐘。
3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
4.在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、
4.在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉錄酶。
5.混合離心管中試劑并以12000rpm離心1分鐘，在42℃保溫1小時。
6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.采用長末端聚合酶鏈式反應(LD-PCR)方法擴增第二鏈1.95℃預熱PCR儀。
2.將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage2 PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應。
3.在PCR儀中按以下程序擴增①95℃20秒鐘②22個循環95℃5秒鐘68℃6分鐘4.循環結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。
C.PCR產物用PROMEGA公司的WizardSV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行抽提回收，步驟如下1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結合。16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
3.重復步驟2。
4.16,000g以12000rpm離心5分鐘。
5.將離心純化柱置于新的離心管中。
6.加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備1.挑取單個DH5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃培養過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養液中，37℃振蕩2小時。當OD600值達到0.35時，收獲細菌培養物。
2.將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培養物冷卻至0℃。
3.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細胞。
4.倒出培養液，將管倒置1min以使最后的痕量培養液流盡。
5.每50ml初始培養液且30ml預冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細胞。
7.倒出培養液，將管倒置1min以使最后的痕量培養液流盡。
8.每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份細胞沉淀，分裝后備用。
E.酶切、連接以及連接產物的轉化1.在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl無指盤臭蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。
3.16℃反應2小時。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養基890μl，37℃緩慢振蕩培養60分鐘。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養基上37℃培養16小時，形成單菌落。
8.每個LB平皿用5ml LB液體培養基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構建的cDNA大約含1×106個單獨克隆。
IV、無指盤臭蛙免疫調節肽基因克隆篩選擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。
PCR反應在如下條件下進行94℃30秒鐘，60℃30秒鐘和72℃45秒鐘，35個循環。
首先滴定構建的細菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基稀釋至適當的細菌濃度(大約5000個細菌/毫升，和30個細菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養。按行、列分別合并細菌培養液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。
V、無指盤臭蛙免疫調節肽基因序列測定和結果提取質粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國AppliedBiosystems373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTMSequencing PrimerRV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencing Primer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因測序結果自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct 120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt 180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat 240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300aaaaaaa 307無指盤臭蛙免疫調節肽基因核苷酸的序列表為序列長度為307個堿基，序列類型核酸，鏈數單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源無指盤臭蛀皮膚。
編碼成熟無指盤臭蛙免疫調節肽氨基酸序列的為第141-186位核苷酸，其氨基酸序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15無指盤臭蛙免疫調節肽基因作為基因工程制備無指盤臭蛙免疫調節肽的應用。
無指盤臭蛙免疫調節肽變異體作為蛋白質工程制備指盤臭蛙免疫調節肽變異體的應用。
制備無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體I、無指盤臭蛙免疫調節肽的制備方法根據編碼無指盤臭蛙免疫調節肽的基因推斷無指盤臭蛙免疫調節肽的氨基酸序列，利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙免疫調節肽的突變體，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
II、分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油∶間硝基芐醇∶二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發射電壓為25Kv。
III、純化的無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
無指盤臭蛙免疫調節肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點9.84，具有強烈的免疫調節活性和抗腫瘤活性，無指盤臭蛙免疫調節肽的全序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val CysSer(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。
無指盤臭蛙免疫調節肽變異體是通過蛋白組學的方法設計的一種具有改良的免疫調節活性和抗腫瘤活性的環狀多肽，它們的全序列如下臭蛙免疫調節肽2，Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15無指盤臭蛙免疫調節肽的藥理實驗
1.無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體的免疫調節作用肥大細胞在動物的先天性免疫過程中起著非常重要的作用，肥大細胞脫顆粒的同時會釋放組胺和其他一些炎癥原調節因子，這些物質的釋放吸引炎癥細胞到發炎部位，最終炎癥部位炎癥的擴散。所以肥大細胞釋放組胺可以作為活性檢測的一種手段。
健康Wistar大鼠斷頸處死，腹腔內注射10ml臺氏液(Tyrode solution)，腹部按摩10分鐘，打開腹腔吸出含有肥大細胞的臺氏液，1000rpm離心5分鐘，重復用臺氏液洗一次，再用1-2ml的臺氏液懸浮肥大細胞。取10μl樣品和90μl細胞懸液在37℃孵育10分鐘，37℃孵育10分鐘，然后加1.9ml冷的臺氏液，3000rpm離心5min，吸出上清，沉淀用2ml臺氏液懸浮，并在開水上煮10min。上清或者沉淀分別加入0.6g NaCl、2.5mL正丁醇和0.2ml 2.5mol/L NaOH，立即混勻，振蕩后低速離心5min；取2mL有機相加到已加0.6mL0.1mol/L HCl和2.5mL正庚烷的試管，振蕩后低速離心5min，棄有機相；取0.5mL HCl相用雙蒸水稀釋1倍后，加入0.25mL 0.4mol/L NaOH和0.05mL 1mg/L OPT甲醇溶液，在20℃條件下準確反應10min后，加入0.25mL 0.5mol/L HCl終止反應。空白管為先加入0.25mol/L HCl后，再加入鄰苯二甲醛。
利用PE公司的自動熒光分光光度計于激發波360nm，熒光波長450nm，狹縫10nm的條件下測定熒光強度讀數(T)。
組胺釋放率按下式計算組胺釋放率＝[(樣本的組胺釋放量-自發組胺釋放量)/組胺總含量]×100％該試驗重復三次。
結果見表1。
表1 無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體的組胺釋放作用

2.無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體抑制腫瘤生長的作用在96孔細胞培養板上，將待測樣品用1640培養基進行5倍或2倍倍比稀釋，共六個稀釋度，每個稀釋度設3個重復孔，每孔100μl，同時設置正常細胞對照。每孔滴加3×105個/ml的Hela、HepG2細胞100μl。置37℃，5％CO2培養箱內培養。48小時后用MTT法測定待測化合物對細胞的毒性作用。EC50是對腫瘤細胞產生50％抑制作用時的濃度。
表2無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體抑制腫瘤細胞生長的作用

由表1可見，無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體能顯著抑制宮頸癌細胞(Hela)和肝腫瘤細胞系(HepG2)的生長，這表明無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體具有很強的抑制腫瘤細胞生長作用，并表現出改良的性能，同時還具有序列簡單、合成方便等優點。可作為制備治免疫調節、腫瘤治療和化療藥物的應用。
無指盤臭蛙免疫調節肽、其基因和變異體及其在制藥中的應用_ST25SEQUENCE LISTING<110>中國科學院昆明動物研究所<120>無指盤臭蛙免疫調節肽、其基因和變異體及其在制藥中的應用<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>307<212>DNA<213>Rana grahami<400>1atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct 60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaaaaa 307<210>2<211>15<212>PRT<213>Rana grahami<400>2Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>Rana grahami<400>3Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser1 5 10 1權利要求
1.無指盤臭蛙免疫調節肽，其特征在于該無指盤臭蛙免疫調節肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環狀多肽，無指盤臭蛙免疫調節肽是一種環狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點9.84，無指盤臭蛙免疫調節肽的全序列為Thr Ser Arg Cys TyrIle Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。
2.無指盤臭蛙免疫調節肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由307個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct 60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaaaaa 307
3.權利要求2所述的無指盤臭蛙免疫調節肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟無指盤臭蛙免疫調節肽序列的為第141-186位核苷酸，其氨基酸序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15
4.權利要求1所述無指盤臭蛙免疫調節肽的變異體，其特征在于其變異體如下免疫調節肽2，無指盤臭蛙免疫調節肽原始序列中第7位的甘氨酸突變為谷氨酸，Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15。
5.權利要求1所述無指盤臭蛙免疫調節肽的應用，其特征在于無指盤臭蛙免疫調節肽作為制備免疫調節、腫瘤治療和化療藥物的應用。
6.權利要求4所述無指盤臭蛙免疫調節肽變異體的應用，其特征在于無指盤臭蛙免疫調節肽變異體作為制備免疫調節、腫瘤治療和化療藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及無指盤臭蛙免疫調節肽、基因和變異體及其在制藥中的應用，屬生物醫學技術領域。無指盤臭蛙免疫調節肽是一種環狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點9.84，無指盤臭蛙免疫調節肽的全序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg ArgLys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。編碼的基因由307個核苷酸組成，其中編碼成熟部分的為第141－186位核苷酸。無指盤臭蛙免疫調節肽原始序列中第4個氨基酸發生替代所產生的變異體，人工合成的無指盤臭蛙免疫調節肽及其變異體具有強烈的免疫調節活性和腫瘤抑制活性，作為制備免疫調節、腫瘤治療和化療藥物的應用。本發明還具有序列簡單、合成方便等優點。
文檔編號A61K38/12GK101037473SQ200710065669
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月12日 優先權日2007年2月12日
發明者賴仞, 李建許, 李東升, 宋玉竹 申請人:中國科學院昆明動物研究所