專利名稱：膠原－殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種適應組織工程皮膚構建的多孔支架材料及其制備方法，具體得說是涉及膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架及其制備方法和應用。
背景技術：
臨床上，燒傷、創傷、糖尿病、靜脈潰瘍等各種原因引起的皮膚缺損是一種常見的疾病。目前常規的治療方法便是做皮膚移植，如自體皮移植、同種異體皮或者是異種皮移植。其中自體皮移植由于沒有排斥反應的問題，被作為首選的治療方法。但是卻常常存在自體皮源不足的問題，尤其是遇到大面積的燒傷病人時，這種供需矛盾更加突出。近20年來，隨著材料科學和生命科學的發展，組織工程學迅速興起。組織工程化皮膚的出現為臨床上皮膚缺損的創面修復提供了一條嶄新的途經。具有很大的研究前景和應用價值。但是要構建出理想的組織工程皮膚，就必須制備出一種生物相容性良好，機械性能適宜的，并具備特定微觀結構的支架材料。
膠原和殼聚糖都是天然的高分子材料。作為組織工程的支架材料，膠原具有許多優越條件，它擁有最好的生物相容性，并且具有可降解、低免疫原性的特點。殼聚糖亦具有良好的生物相容性，且有促進創面愈合，抗感染的特性。這兩種材料在自然界中來源廣泛，成本低廉，由他們按適當比例混合后制備的支架材料可以取長補短，從而獲得一種性質更加優化的支架材料。
中國發明專利申請CN02112498.1公開了一種采用天然生物材料膠原和殼聚糖為原料，通過冷凍-凍干，再進一步通過真空干熱法、醛類化合物或碳化二亞胺類化合物交聯，制備具有微結構可控、適宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。該發明的膠原/殼聚糖支架的生物相容性好，降解速率可控，且材料來源廣泛，成本低，制備工藝簡單可行，重復性好，所構建的支架可以廣泛地應用于組織工程領域，具有良好的臨床應用前景。
中國發明專利申請CN200610041912.9公開了一種制備可生物降解的組織工程用支架材料的方法。該發明提供的可生物降解組織工程用支架材料具有適宜的微觀結構和空隙率，具有優良的機械強度和可控的降解速率，可廣泛應用于皮膚、神經修復管、血管以及心臟瓣膜等多種組織的修復與重建。
中國發明專利申請CN200510061872.X公開了一種膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架及其制備方法。該皮膚再生支架由膠原/殼聚糖多孔支架和硅橡膠薄膜通過生物相容性良好的膠粘劑粘結而成。其中膠原/殼聚糖多孔支架可以有效誘導缺損組織處細胞的遷移、增殖和分化，原位誘導缺損真皮組織的再生；硅橡膠薄膜則起到了臨時表皮層的作用，可以有效控制水分的揮發和防止細菌的侵入等，對創面起到了臨時保護作用。本發明所制備的膠原-殼聚糖/硅橡膠復合支架具有良好的生物相容性，可控的降解速率和優異的創面修復能力，具有較良好的臨床應用前景。
纖維蛋白膠由纖維蛋白原在凝血酶的催化下轉化而來，具有良好的組織和細胞相容性，在體內可降解，臨床上主要被用于手術過程中的止血劑和組織粘合劑。研究表明它具有促進細胞黏附、增值和遷移的作用，目前亦被作為一種良好的載體材料用于組織工程的創傷修復中。
現在還未有將纖維蛋白膠與膠原/殼聚糖多孔支架復合制成適應組織工程皮膚構建的多孔支架材料的相關報道。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種生物相容性良好，機械性能適宜，并具備特定微觀結構，完全適應組織工程皮膚構建，可以有效促進皮膚創面修復愈合的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架。
本發明的一個目的是提供上述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法。
本發明的一個目的是提供上述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的應用。
為了實現本第一個目的，本發明采用了以下的技術方案膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架，該不對稱支架包括膠原-殼聚糖多孔材料層和纖維蛋白膠層，纖維蛋白膠層均勻設置在膠原-殼聚糖多孔材料層的表面，兩者之間形成有交界面。
作為優選方案，上述的膠原-殼聚糖多孔材料具有80～150um的孔徑結構；纖維蛋白膠具有5～20um的微小孔徑。
為了實現本第二個目的，本發明采用了以下得技術方案上述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，包括如下步驟1)制備得到膠原-殼聚糖多孔支架；2)將膠原-殼聚糖多孔支架進行浸泡消毒，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗；3)將纖維蛋白原用DMEM培養基或PBS配成濃度為4mg/ml～80mg/ml；4)將凝血酶(杭州普濟醫藥技術開發有限公司)用DMEM培養基或PBS稀釋成濃度為30IU/ml～600IU/ml；5)將纖維蛋白原溶液均勻涂覆在已消毒的膠原-殼聚糖多孔支架表面，然后再將凝血酶滴加在其上，靜置直至多孔膜材料表面形成一層固態的纖維蛋白膠，從而獲得膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架。
作為優選，上述的纖維蛋白原的較佳濃度可以為20mg/ml～80mg/ml。凝血酶的較佳濃度可以為150IU/ml～600IU/ml。纖維蛋白原溶液的涂覆量較佳可以為25ul/cm2～100ul/cm2。步驟)5中靜置可以采用室溫或37℃溫箱，靜置時間為30分鐘～2小時。
上述的步驟1)中膠原-殼聚糖多孔支架的制備方法可以如下1)用酸性溶液分別配置質量濃度為0.5％～5％的膠原溶液和殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，攪拌均勻，得膠原-殼聚糖混合溶液；2)將膠原-殼聚糖混合液注入模具中，采用冷凍-凍干法，冷凍成固體，凍干，得到膠原-殼聚糖多孔支架；3)將上述所得的膠原-殼聚糖多孔支架在80℃～130℃溫度下真空干熱物理交聯處理，再置于醛類化合物或碳化二亞胺類化合物中交聯12～48小時，清洗后，再次冷凍、凍干。
作為優選其中步驟1)中配制膠原溶液的膠原材料是牛腿膠原、豬皮膠原、鼠尾膠原；殼聚糖的含量(重量)可以為5％～30％；配制膠原溶液和殼聚糖溶液所用的酸為乙酸、甲酸、鹽酸中的一種或其混合物。其中步驟2)中冷凍-凍干法溫度可以為-20℃～-50℃。其中醛類化合物可以是甲醛或戊二醛；碳化二亞胺類化合物可以采用摩爾濃度比為0.5～5∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液和N-羥基丁二酰亞胺混合溶液。其中較佳是1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液濃度為20～80mmol/L。
為了實現本第三個目的，本發明公開了上述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架在構建組織工程皮膚中的應用。
本發明制備的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架具有雙層結構。由纖維蛋白膠和膠原-殼聚糖多孔材料淺層所構成的表皮面層，孔徑在5um-20um，適合表皮細胞的接種，而由膠原-殼聚糖多孔材料構成的真皮面層，孔徑為80-150um，適合真皮成纖維細胞的接種和生長。因此，本發明所制備的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架具有良好的細胞相容性，是一種適應組織工程皮膚尤其是復合皮膚構建的皮膚再生材料。


圖1是本發明膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架石臘切片，HE染色照片200x。
圖2是本發明膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架石臘切片，HE染色照片400x。
圖3是纖維蛋白膠(纖維蛋白原80mg/ml，凝血酶600IU/ml室溫下聚合成膠)的掃描電鏡(SEM)照片。
圖4、圖5是纖維蛋白原濃度為40mg/ml時，膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架掃描電鏡(SEM)照片。
圖6、圖7是纖維蛋白原濃度為8mg/ml時，膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架掃描電鏡(SEM)照片。
圖8是人真皮成纖維細胞在不對稱支架中培養2W后的掃描電鏡(SEM)照片。
圖9是膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用于組織工程皮膚構建，氣液界面培養2W，HE染色照片200x。
圖10是不含纖維蛋白膠的膠原-殼聚糖多孔支架用于組織工程皮膚構建，浸入培養1W，HE染色照片200x。
圖11是不含纖維蛋白膠的膠原-殼聚糖多孔支架用于組織工程皮膚構建，氣液界面培養2W，HE染色照片200x。
圖12是不含纖維蛋白膠的膠原-殼聚糖多孔支架用于組織工程皮膚構建，氣液界面培養3W，HE染色照片200x。
圖13是膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用于組織工程復合皮膚構建，氣液界面培養1W后，HE染色照片40x。
圖14是膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用于組織工程復合皮膚構建，氣液界面培養3W后，HE染色照片100x。
圖15是膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用于組織工程復合皮膚構建，氣液界面培養3W后，HE染色照片400x。
具體實施例方式
實施例1膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架組織形態觀察。
將膠原和殼聚糖分別溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配置濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，其中殼聚糖的含量(按重量)為10％，攪拌均勻；采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍2小時，然后置凍干機中凍干24小時。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯24小時，置于摩爾濃度比為2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液(40mmol/l)和N-羥基丁二酰亞胺混合溶液中交聯24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯的膠原-殼聚糖多孔支架。將膠原-殼聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分鐘，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗5次以上；將纖維蛋白原(原濃度為80mg/ml)用DMEM培養基配成濃度為40mg/ml；將纖維蛋白原溶液以50ul/cm2的量均勻涂覆在已消毒的膠原-殼聚糖多孔支架表面，再以等量(體積)的凝血酶(300IU/ml)滴加在其上，室溫或37℃溫箱靜置30分鐘，多孔膜材料表面形成固態的纖維蛋白膠，獲得膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架。
將制備的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架置于福爾馬林溶液中固定，做石臘包埋HE染色。見圖1、圖2(箭頭示纖維蛋白膠嵌入膠原-殼聚糖多孔材料內部，形成類似釘突樣錨定結構)。
實施例2膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架掃描電鏡下的超微結構觀察。
將膠原和殼聚糖分別溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配置濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，其中殼聚糖的含量(按重量)為10％，攪拌均勻；采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍2小時，然后置凍干機中冷干24小時。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯24小時，置于摩爾濃度比為2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液(40mmol/l)和N-羥基丁二酰亞胺混合溶液中交聯24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯的膠原-殼聚糖多孔支架。將膠原-殼聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分鐘，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗5次以上；將纖維蛋白原(原濃度為80mg/ml)用DMEM培養基配成濃度為40mg/ml和8mg/ml，將凝血酶(原濃度為600IU/ml)用DMEM培養基配成濃度為300IU/ml和60IU/ml；將纖維蛋白原溶液以50ul/cm2的量均勻涂覆在已消毒的膠原-殼聚糖多孔支架表面，再以相應濃度的等量(體積)的凝血酶滴加在其上，室溫或37℃溫箱靜置30分鐘，多孔膜材料表面形成固態的纖維蛋白膠，獲得膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架。
將制備的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用乙醇梯度脫水后，餓酸固定，臨界點干燥，做掃描電鏡。鏡下可見膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架有兩種不同的孔徑，由纖維蛋白膠和膠原-殼聚糖多孔材料淺層所構成的表皮面層，孔徑在5um-20um，而由膠原-殼聚糖多孔材料構成的真皮面層，孔徑在80um-150um。見圖4，圖5，圖6，圖7。(箭頭示表皮面層的孔隙結構)。
實施例3膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架細胞相容性的研究將膠原和殼聚糖分別溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配置濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，其中殼聚糖的含量(按重量)為10％，攪拌均勻；采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍2小時，然后置凍干機中凍干24小時。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯24小時，置于摩爾濃度比為2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液(40mmol/l)和N-羥基丁二酰亞胺混合溶液中交聯24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯的膠原-殼聚糖多孔支架。
將膠原-殼聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分鐘，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗5次以上。將培養的人真皮成纖維細胞消化后重懸，細胞計數，濃度調整到2×106/ml，接種到膠原-殼聚糖多孔支架中，加入含10％胎牛血清和青、鏈霉素各100IU/ml的DMEM高糖培養基，浸沒，置37℃，5％CO2飽和濕度孵箱中培養，每三天還一次液。一周后取出，轉入另一六孔板中，置孵箱中放置30分鐘，使材料表面略干燥后，在其上依次涂預先配置好濃度的纖維蛋白原和凝血酶溶液，再將其置于孵箱中30分鐘，待纖維蛋白膠體形成之后再加入含10％胎牛血清，100IU/ml青、鏈霉素的DMEM高糖培養液，放回孵箱繼續培養。一周后取材做掃描電鏡(SEM)。2.5％戊二醛固定后，乙醇梯度脫水，然后餓酸固定，臨界點干燥，最后上鏡觀察。掃描電鏡下可見成纖維細胞呈典型的長梭形，附著在支架纖維上生長，在細胞的周圍有大量的細胞外基質分泌，體現了不對稱支架良好的細胞相容性。見圖8。(箭頭示細胞外基質)
實施例4膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用于體外組織工程皮膚構建。
將膠原和殼聚糖分別溶于的0.5mol/L乙酸溶液中，配置濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，其中殼聚糖的含量(按重量)為10％，攪拌均勻；采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍2小時，然后置凍干機中凍干24小時。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯24小時，置于摩爾濃度比為2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液(40mmol/l)和N-羥基丁二酰亞胺混合溶液中交聯24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯的膠原-殼聚糖多孔支架。
將膠原-殼聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分鐘，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗5次以上.置孵箱中放置30分鐘使材料表面略干燥后，在其上依次涂預先配置好濃度的纖維蛋白原和凝血酶，等待30分鐘，纖維蛋白膠體形成后，將培養的表皮細胞以0.5×106/cm2接種到纖維蛋白膠體的表面，加入含10％胎牛血清，100IU/ml青、鏈霉素的DMEM高糖培養液浸沒材料，置37℃，5％CO2飽和濕度孵箱中培養，一周后改為氣液界面培養。同樣在沒有涂纖維蛋白膠的膠原-殼聚糖多孔材料上接種相同濃度的表皮細胞，同樣條件下培養作為對照。1、2、3周取材作組織切片，HE染色。見圖9～圖12。(箭頭示纖維蛋白膠層)實施例5膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架用于體外組織工程復合皮膚構建。
將膠原和殼聚糖分別溶于的0.5mol/L乙酸溶液中，配置濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，其中殼聚糖的含量(按重量)為10％，攪拌均勻；采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍2小時，然后置凍干機中凍干24小時。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯24小時，置于摩爾濃度比為2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二業胺溶液(40mmol/l)和N-羥基丁二酰業胺混合溶液中交聯24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯的膠原-殼聚糖多孔支架。
將膠原-殼聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分鐘，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗5次以上。將培養的真皮成纖維細胞消化后濃度調整到2×106/ml，將細胞懸液接種到膠原/殼聚糖多孔支架中，加入含10％胎牛血清和青、鏈霉素各100IU/ml的DMEM高糖培養基，浸沒材料，置37℃，5％CO2飽和濕度孵箱中培養，每三天還一次液。一周后將材料取出，轉入另一六孔板中，置孵箱中放置30分鐘，使材料表面略干燥后，在其上依次涂預先配置好濃度的纖維蛋白原和凝血酶溶液，再將材料置于孵箱中30分鐘，等待纖維蛋白膠體形成。之后將培養的表皮細胞以0.5×106/cm2接種到纖維蛋白膠體的表面，再加入含10％胎牛血清，100IU/ml青、鏈霉素的DMEM高糖培養液浸沒材料，放回孵箱培養，一周后改為氣液界面培養。1、2、3周取材作組織切片。見圖13，圖14，圖15。(箭頭示表皮層嵌入真皮支架內部，形成指突樣錨定結構)。
權利要求
1.膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架，其特征在于該不對稱支架包括膠原-殼聚糖多孔材料層和纖維蛋白膠層，纖維蛋白膠層均勻設置在膠原-殼聚糖多孔材料層的表面，膠原-殼聚糖多孔材料層和纖維蛋白膠層之間形成有交界面。
2.根據權利要求1所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架，其特征在于所述的膠原-殼聚糖多孔材料具有80～150um的孔徑結構；纖維蛋白膠具有5～20um的微小孔徑。
3.根據權利要求1所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)制備得到膠原-殼聚糖多孔支架；2)將膠原-殼聚糖多孔支架進行浸泡消毒，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗；3)將纖維蛋白原用DMEM培養基或PBS配成濃度為4mg/ml～80mg/ml；4)將凝血酶用DMEM培養基或PBS稀釋成濃度為30IU/ml～600IU/ml；5)將纖維蛋白原溶液均勻涂覆在已消毒的膠原-殼聚糖多孔支架表面，然后再將凝血酶滴加在其上，靜置直至多孔膜材料表面形成一層固態的纖維蛋白膠，從而獲得膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架。
4.根據權利要求3所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于膠原-殼聚糖多孔支架的制備方法如下1)用酸性溶液分別配置質量濃度為0.5％～5％的膠原溶液和殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，攪拌均勻，得膠原-殼聚糖混合溶液；2)將膠原-殼聚糖混合液注入模具中，采用冷凍-凍干法，冷凍成固體，凍干，得到膠原-殼聚糖多孔支架；3)將上述步驟2)所得的膠原-殼聚糖多孔支架在80℃～130℃溫度下真空干熱物理交聯處理，再置于醛類化合物或碳化二亞胺類化合物中交聯12～48小時，清洗后，再次冷凍、凍干。
5.根據權利要求3所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于其中殼聚糖的含量(重量)為5％～30％。
6.根據權利要求3所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于碳化二亞胺類化合物采用摩爾濃度比為0.5～5∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液和N-羥基丁二酰亞胺混合溶液。
7.根據權利要求3～6任意一項權利要求所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于纖維蛋白原的濃度為20mg/ml～80mg/ml。
8.根據權利要求3～6任意一項權利要求所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于凝血酶的濃度為150IU/ml～600IU/ml。
9.根據權利要求3～6任意一項權利要求所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架的制備方法，其特征在于纖維蛋白原溶液的涂覆量為25ul/cm2～100ul/cm2。
10.根據權利要求1所述的膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架在構建組織工程皮膚中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種適應組織工程皮膚構建的多孔支架材料及其制備方法，具體得說是涉及膠原—殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架及其制備方法和應用。膠原—殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架，該不對稱支架包括膠原—殼聚糖多孔材料層和纖維蛋白膠層，纖維蛋白膠層均勻設置在膠原—殼聚糖多孔材料層的表面，兩者之間形成有交界面。本發明所制備的膠原—殼聚糖/纖維蛋白膠不對稱支架具有良好的細胞相容性，是一種適應組織工程皮膚尤其是復合皮膚構建的皮膚再生材料。另外，本發明還公開了上述的不對稱支架的制備方法和應用。
文檔編號A61L27/00GK101062430SQ200710068310
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者韓春茂, 孫錦章, 石海飛, 毛崢偉, 周杰, 馬列, 高長有 申請人:韓春茂