本發明涉及體外診斷醫學檢驗領域。具體地說，本發明涉及一種血清的制備方法。

背景技術：

血清是血液凝固析出的淡黃色透明液體。如將血液自血管內抽出，放入試管中，不加抗凝劑，則凝血反應被激活，血液迅速凝固，形成膠凍。凝血塊收縮，其周圍所析出之淡黃色透明液體即為血清，也可于凝血后經離心取得。在凝血過程中，纖維蛋白原轉變成纖維蛋白塊，所以血清中無纖維蛋白原，這一點是與血漿最大的區別。而在凝血反應中，血小板釋放出許多物質，各凝血因子也都發生了變化。這些成分都留在血清中并繼續發生變化，如凝血酶原變成凝血酶，并隨血清存放時間逐漸減少以至消失。這些也都是與血漿區別之處。但大量未參加凝血反應的物質則與血漿基本相同。為避免抗凝劑的干擾，血液中許多化學成分的分析，都以血清為樣品。

血漿的各種化學成分常在一定范圍內不斷地變動，其中以葡萄糖、蛋白質、脂肪和激素等的濃度最易受營養狀況和機體活動情況的影響，而無機鹽濃度的變動范圍較小。血清與血漿的區別，主要在于血清不含纖維蛋白原，纖維蛋白原能轉換成纖維蛋白，具有凝血作用。

在體外診斷試劑行業，血清和血漿是體外診斷試劑生產的初級及重要的原料之一，常用于校準品、稀釋液的配制以及內部參考品的建立。其中血清由于其清澈雜質較少，干擾較小等因素，是兩者中的首選。但血清的獲取量較少，無法滿足大體積的需求。而血漿的供應量雖大，但是干擾性較強，且大量的纖維蛋白容易有絮狀沉淀，會影響產品質量。此外，本領域制備血清的方法往往存在得率低、操作繁瑣、仍存在纖維蛋白絮狀沉淀等缺點。

因此，本領域急需操作簡便，得率高，將血漿轉化為血清的制備方法，所得到的血清中纖維蛋白充分去除，并且對待測物影響較小。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種血清制備方法，該方法制備的血清的得率高，制備工藝簡單，易于重復，且對于待測物無影響，測值回收率好。

本發明的另一目的在于提供本發明方法所制得血清以及包含這種血清的檢測試劑盒。

在第一方面，本發明提供一種血清的制備方法，所述方法包括在血漿中添加經氯化鈣激活的凝血酶溶液，從而制得血清。

在具體的實施方式中，所述方法包括以下步驟：

(1)將凍存血漿平衡至室溫，過濾；

(2)孵育后，在血漿中添加經氯化鈣激活的凝血酶溶液，混勻；

(3)將處理后的血漿平衡至室溫，然后凍存；

(4)取出再次平衡至室溫，離心，過濾后，制得血清。

在優選的實施方式中，步驟(3)中將處理后的血漿平衡至室溫，然后在-15℃以下保存。

在優選的實施方式中，步驟(1)中的過濾是將平衡至室溫的血漿經醫用紗布過濾，收集濾液。

在具體的實施方式中，步驟(2)所述的孵育是在37℃孵育15～60分鐘；優選地，孵育為30分鐘。

在具體的實施方式中，所述凝血酶溶液的濃度為50～200U/mL；優選地，濃度為75-125U/mL；最優選地，濃度為100U/mL。

在具體的實施方式中，所述經氯化鈣激活的凝血酶溶液是將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:4～1:19的比例混合，反應30分鐘后制得；優選地，將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:9的比例混合。

在具體的實施方式中，步驟(3)所述的處理后的血漿平衡至室溫的時間為60～180分鐘；優選地，平衡時間為120分鐘。

在具體的實施方式中，步驟(4)中離心轉速為4000rpm，過濾孔徑為0.8μm。

在優選的實施方式中，步驟(4)還包括在制得的血清中添加質量分數為0.1％的Proclin 300。

在優選的實施方式中，所述制備方法制得的血清的得率達到80％以上，優選85％以上，更優選90％以上；總蛋白回收率達到93％以上，優選95％以上，更優選97％以上。

在第二方面，本發明提供一種血清，所述血清通過本發明第一方面所述的制備方法制備得到。

在優選的實施方式中，所制備的血清的得率達到87％以上，優選90％以上，更優選93％以上；總蛋白回收率達到93％以上，優選95％以上，更優選97％以上。

在第三方面，本發明提供一種試劑盒，所述試劑盒裝有本發明第二方面所述的血清或本發明第一方面所述的制備方法制備的血清。

在優選的實施方式中，所述血清用作檢測試劑盒中的校準品、稀釋液、質控品或內部參考品。

在第四方面，本發明提供本發明第一方面所述的制備方法制備的血清或本發明第二方面所述的血清在制備檢測試劑盒中的用途。

在優選的實施方式中，所述血清用作檢測試劑盒中的校準品、稀釋液、質控品或內部參考品。

應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了通過本發明方法從不同血漿制備血清后，待測物的回收率、總蛋白濃度的比較。

具體實施方式

在研發實踐中，本發明人發現直接采用血漿作為體外診斷試劑的校準品、稀釋液及參考品時，其穩定性不佳，且由于血漿中纖維蛋白的影響，往往形成絮狀沉淀，造成質量問題；此外，直接采用血漿，其抗凝劑對待測物的測定形成干擾。而現有的制備血清的方法存在得率低、操作繁瑣、需要反復凍融等缺點，并且制得的血清中仍有纖維蛋白絮狀沉淀存在。發明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發現，在血漿中添加經氯化鈣激活的凝血酶溶液并且控制凝血酶的用量，所制備的血清的得率較高，作為體外診斷試劑校準品、稀釋液及參考品對后續檢測的干擾小，測值回收率好，并且該制備工藝簡單，易于重復，具有較大的工藝放大及推廣前景，能廣泛應用于體外診斷領域。在此基礎上完成了本發明。

本發明的血清的制備方法以及制備得到的血清

基于以上發現，本發明首先提供一種血清的制備方法，所述方法通過在血漿中添加經氯化鈣激活的凝血酶溶液而制得血清。

基于本發明的教導以及本領域的常規技術手段，本領域技術人員可以想到本發明的血清制備方法的各種具體實現方式。例如，可以將凍存血漿平衡至室溫，過濾，孵育后，在血漿中添加經氯化鈣激活的凝血酶溶液，混勻；將處理后的血漿平衡至室溫，凍存；取出再次平衡至室溫，離心，過濾后，即制得所述血清。

在具體的實施方式中，本發明的血清制備方法包括以下步驟：

(1)將凍存血漿平衡至室溫，過濾；

(2)孵育后，在血漿中添加經氯化鈣激活的凝血酶溶液，混勻；

(3)將處理后的血漿平衡至室溫，然后凍存，例如在；

(4)取出再次平衡至室溫，離心，過濾后，制得血清。

本領域技術人員可以基于本發明的教導以及本領域的常規要求確定本發明方法的一些細節。例如，步驟(1)的過濾是將平衡至室溫的血漿經醫用紗布過濾，收集濾液；步驟(2)所述的孵育是在37℃孵育15～60分鐘；優選地，孵育為30分鐘；步驟(3)中，可以將處理后的血漿平衡至室溫，然后在-15℃以下保存；

本發明人發現，凝血酶溶液的用量對于通過本發明方法獲得高質量的血清也有影響。在具體的實施方式中，所述凝血酶溶液的濃度為50～200U/mL；優選地，濃度為75-125U/mL；最優選地，濃度為100U/mL。在優選的實施方式中，所述經氯化鈣激活的凝血酶溶液是將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:4～1:19的比例混合，反應30分鐘后制得；優選地，將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:9的比例混合。

在優選的實施方式中，所述處理后的血漿平衡至室溫的時間為60～180分鐘；更優選，平衡時間為120分鐘。

在優選的實施方式中，所述步驟(4)中離心轉速為4000rpm，過濾孔徑為0.8μm。在另一優選的實施方式中，所述步驟(4)還包括在制得的血清中添加質量分數為0.1％的Proclin 300。在另一優選的實施方式中，所述步驟(4)還包括在制得血清后將其在2～8℃保存。

相比于現有技術，本發明的血清制備方法能夠制備得到具備優異特性的血清，例如，得率高，總蛋白回收率高等等。而具有如此優異特性的血清是現有技術無法獲得的。在具體的實施方式中，本發明制備方法制得的血清的得率達到80％以上，優選85％以上，更優選90％以上；總蛋白回收率達到93％以上，優選95％以上，更優選97％以上。

本領域技術人員公知，血清可以在試劑盒中用作校準品、稀釋液、質控品或內部參考品。因此，本發明制備方法制得的血清的可以用于各種檢測試劑盒中，從而提高這些檢測試劑盒的性能。

本發明的優點

1)本發明制備的血清的得率高，一般可達到80％以上；

2)本發明制備的血清，對待測物的測定無影響，且重復性好；

3)本發明制備的血清經反復凍融后，依舊維持澄清透明，無絮狀沉淀析出；

4)本發明的血清制備方法的工藝重復性好，操作簡單。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。

除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例

材料

血漿來自通化市紅十字會中心血站

凝血酶購自于Sigma，

二水氯化鈣購自于國藥試劑，

雙縮脲試劑盒購自于Sigma，

Proclin 300購自于Amersco。

實施例1.血清的制備

1)將凍存血漿200ml放置于室溫，使其完全融化，平衡至室溫；

2)將200ml血漿通過8層醫用紗布，記錄過濾體積V₁；

3)將14.7g的二水氯化鈣溶于純化水中，制得1M CaCl₂溶液；

4)在0.5mL 1000U/mL的凝血酶溶液中加入4.5mL 1M CaCl₂溶液，混勻，室溫反應30分鐘，制得激活凝血酶溶液；

5)在V₁mL的血漿中按照1:100的比例加入0.01V₁mL激活凝血酶溶液，混勻，37℃孵育30分鐘；

6)將血漿置于室溫平衡120分鐘；

7)將平衡后的血漿置于-15℃以下保存至少48小時；

8)將血漿置于室溫平衡4小時，4000rpm離心30分鐘，取上清；

9)將上清液過0.8μm濾膜過濾，取濾液，過濾后的體積為V₂；

10)按照0.1％的體積比加入Proclin 300，混勻；

11)置于2～8℃保存，制得血清。

實施例2.所制得血清的物理性狀比較

利用實施例1所得的血清，對外觀進行觀察，同時通過雙縮脲試劑盒測定制備前后的總蛋白含量，結果如下表所示：

從上表可以看出，本發明制得的血清，能夠去除纖維蛋白，使得液體澄清透明，無沉淀，其得率也達到了91.50％，液體損失較小。通過處理前后血漿和血清的蛋白含量的測定，其總蛋白含量的分別為75.68mg/mL和71.44mg/mL，兩者差異不大，其基本的物理性狀較為理想。

實施例3.血清制備工藝的重復性

利用實施例1所述的方法，對10份不同的血漿進行處理，考察得率情況。同時通過雙縮脲試劑盒測定制備前后的總蛋白含量，乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒測定anti-HBs，評價其處理前后總蛋白和待測物回收率，結果如下表所示：

從上表可以看出，通過比較處理前后的10份不同血漿和血清的得率為87.63％～96.34％，總蛋白回收率為92.99％～97.93％，anti-HBs測值回收率93.00％～100.97％。從結果看，血清對于總蛋白含量及anti-HBs的測值無明顯影響，且制備平均得率達到了90％，效果良好。

實施例4.含有本發明血清的乙型肝炎病毒表面抗體試劑盒性能結果

1)最低檢測限：本試劑盒的最低檢測限不高于2mIU/mL。

測定空白樣本20次，計算20次測定結果均值(M)和標準差(SD)，M+2SD對應的濃度即為試劑盒的最低檢測限。

2)準確度：本試劑盒的回收率在85％～115％之間。

3)重復性：本試劑盒的相對變異系數(CV)≤8％。

4)線性范圍：本試劑盒的線性范圍為2～1000mIU/mL。

將接近線性范圍上限的高值樣本進行系列稀釋，計算實測值與理論稀釋度之間的線性相關系數r，結果應大于或等于0.9900。

5)批間差：本試劑盒批間的相對變異系數(CV)≤15％。

6)穩定性：本試劑盒2～8℃保存12個月，試劑盒的性能仍穩定。

實施例5.含有本發明血清的超敏感C-反應蛋白定量測定試劑盒(免疫比濁法)性能結果

1)試劑空白：波長340nm左右處，試劑空白吸光度應≤1.8A。

2)準確度：測定結果在所使用質控品的允許范圍內。

3)精密度：：批內變異系數cv≤10％；批間相對極差≤15％。

4)線性范圍：在樣本濃度1.0-10mg/l范圍內，相關系數r≥0.990。在樣本濃度1.0-5.0mg/l范圍內，線性絕對偏差應不超過±0.75mg/l。在樣本濃度5-10mg/l范圍內，線性相對偏差應不超過±15％。

5)分析靈敏度：測試濃度為(2.0±0.5)mg/L的樣本，將測試結果換算成濃度為2.0mg/L的樣本時，吸光度差值(△A)應≥0.01A。

6)校準品準確度：用試劑盒內待檢校準品及上級工作校準品分別校準試劑，然后測定質控品，兩者對同一質控品的測定結果之間的相對偏差應在±15％的范圍內。

7)校準品均一性：CV瓶間≤15％。

8)穩定性：校準品在2℃-8℃遮光儲存至有效期末，試劑盒的性能仍穩定。

實施例6.含有本發明血清的心肌質控品性能結果

1)外觀：塊狀凍干品，復溶后為澄明溶液。

2)準確度：質控品的檢測值在各項目的允許范圍內。

3)均一性：質控品瓶間CV≤5％。

4)復溶穩定性：質控品復溶后放置于2℃～8℃7天和-20℃1個月，質控品靶值仍然穩定。

5)效期穩定性：質控品2～8℃保存12個月，質控品靶值仍然穩定。

6)生物安全性：檢測質控品中HBsAg、抗HIV1/2，抗HCV，抗TP，結果為陰性。

對比例1.

本發明人根據現有技術中的常規方法，在血漿中直接加入氯化鈣來制得血清。對所制得的血清重復以上實施例2-3，結果如下表所示。

從以上結果可以看出，對比例的得率、測值回收率和總蛋白回收率均比實施例低。因此，現有技術中的常規方法無法制得本發明的高質量血清。

對比例2.

本發明人重復了實施例1，區別在于將凝血酶溶液直接加入血漿，然后再加入氯化鈣溶液。對所制得的血清重復以上實施例2-3，結果如下表所示。

從以上結果可以看出，對比例的得率、測值回收率和總蛋白回收率均比實施例低。

綜上所述，以上對比例證明，現有技術中直接向血漿中加入氯化鈣無法制得高質量的血清；即便增加凝血酶的用量，依舊無法制得高質量的血清。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。