專利名稱：含有jeryl－lynn病毒株的抗流行性腮腺炎疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種流行性腮腺炎疫苗，它含有從腮腺炎病毒的Jeryl-Lynn株衍生來的一種均一純化分離株。
背景技術：
流行性腮腺炎基本上是一種兒童患疾病，通常只有輕微的臨床癥狀。但某些病例中流行性腮腺炎感染的臨床結果是嚴重的。例如，在英國流行性腮腺炎是15歲以下兒童患腦膜腦炎的最常見病因，也是兒童永久性感覺神經性耳聾的一個病因。盡管30～40％的自然腮腺炎感染不出現癥狀，但會累及唾液腺，而且在成年人群中，除了上面提到的神經性并發癥外，流行性腮腺炎還會導致第一個三月期流產和睪丸炎，這些都是勿容置疑的事實，它使許多國家都施行了人群預防接種的計劃。
腮腺炎病毒屬于副粘病毒科，它由大約15.3kb的負鏈單鏈基因組RNA構成，基因順序是3′N-P-M-F-SH-HN-L5′(N為核衣殼蛋白，P為磷蛋白，M為基質蛋白，F為融合蛋白，SH為潛在表達(potentially expressed)的小疏水性蛋白，HN為血凝素神經氨酸酶，L為大蛋白)。在眾多腮腺炎病毒株中，Jeryl-Lynn(B-水平，B-level)是一種減毒活變種，經序列分析，其特征在于F，P，HN，M基因。
最近有兩種腮腺炎病毒株已獲準用于抗流行性腮腺炎的預防接種Urabe Am 9和Jeryl-Lynn。但Urabe Am 9在報道了一例無法接受的副作用水平[European Journal of Pediatrics(1993)152387]后，于1992年9月被取消。
Jeryl-Lynn病毒株多年來一直由Merck Sharp and Dohme以“MumpsVax”的商品名售出。它是從一例患流行性腮腺炎的病人身上取得臨床標本，經雞胚羊膜接種而得的(Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.123(3)(1966))。
Afzal等人最近報道(J.ofGen.Virology 199374917)，在英國用作腮腺炎疫苗的Jeryl-Lynn病毒株事實上是JL-2和JL-5這兩種病毒的混合物。
Takeuchi等人，Virology(1991)181p364-366也報道說，不同的腮腺炎病毒株在SH基因水平上會產生實質性(substantial)的核苷酸序列變異。
Afzal等人還強調，目前的“MumpsVax”疫苗商品是在嚴格控制的條件下制備出的，這些條件包括一個細胞庫(cell bank)，有傳代限度，以及傾向于在不同批的產品之間保持兩種變異體的比例的條件。然而隨著Jeryl-Lynn株的進一步傳代，無法保證能維持上述兩種變異體之間的這種平衡。而且也很難估計這兩種變異體在任何一批疫苗里的比例。

發明內容
本發明提供一種疫苗，它包括基本上均一(substantially homogenous)的免疫原性Jeryl-Lynn分離株，所述病毒株為減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，它包含如圖1所示的核苷酸序列。該序列編碼HN基因的N末端以及SH基因。這種病毒株在本文中被稱為SBB JL-1。與現有腮腺炎疫苗商品相比，這種分離株在臨床試驗中能誘導出更高的零轉化，并具有最高的腮腺炎抗體幾何平均滴度。
所謂基本上均一是指，根據對圖1所示序列區段的限定，所述分離株被另一種Jeryl-Lynn分離株污染的程度不超過10％，優選少于5％，更優選少于1％。在本發明一個優選實施方案中，該疫苗包含一個純系Jeryl-Lynn分離株，即該疫苗未被其它在圖1所示基因區段中有差異的Jeryl-Lynn腮腺炎病毒分離株污染。
本發明的一個實施方案提供了一種疫苗，它包含無JL-2污染的純化SBB JL-1。
這種純化分離株不會有亞毒株在不同批之間的潛在差異所帶來的不便，它提供一種更易確保符合一貫質量標準(consistent quality guideline)。
本發明的均一(homogenous)Jeryl-Lynn可以如下獲得將MumpsVax商品在雞胚成纖維細胞(CEF)中傳代并篩選純培養物，所述篩選可以是進行有限稀釋并檢查所得分離株，或者是進行單個空斑分離。其它合適的細胞系包括Vero細胞和MRC5細胞。這就要求存在能有效檢測出群體中較小比例的已知病毒變異株的方法。這類檢查方法包括由Chumakov等人提出的針對減毒脊髓灰質炎病毒的Maprec檢測(WO 92/07958和PNAS 1991，88；199-203)，還有直接對病毒空斑進行測序和對病毒空斑進行差異雜交。
優選本發明的疫苗還包含其它成分，諸如減毒麻疹病毒，和/或減毒風疹病毒，它們的滅活形式或亞單位形式，從而能提供抗麻疹和/或風疹感染的保護作用。三價的腮腺炎、麻疹和風疹疫苗在本領域已廣為人知，本發明中的腮腺炎分離株也可以按照與現有那些疫苗相似的方式配制成三價疫苗。更進一步地，或者備選地，本發明的疫苗可包含減毒水痘-帶狀皰疹活病毒，以提供抗水痘(varicella，chicken pox)或帶狀皰疹(Zoster，shingle)的保護作用。在一優選實施方案中，水痘-帶狀皰疹病毒是Andre F E PostgraduateMED J.(1985)61(Suppl.4)，113-120或Veskari T等，Acta paediatr.Scand.801051-1057，1991公開的OKa株。優選本發明疫苗是四價的，能提供抗腮腺炎病毒，風疹麻疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒的保護作用。
本發明還提供了制備全病毒疫苗的方法，例如在有合適穩定劑存在的條件下將病毒凍干，或將本發明的病毒株與合適的載體或佐劑混合。還優選將本發明病毒株配制在脂質體中或是用載體顆粒進行配制。更進一步地，或者備選地，該配制劑中還可加入免疫刺激物，如3-脫氧酰基化的單磷酰類脂A(3 de-O-acyl monophosphoryl Lipid A，Ribi Immunochem)或是皂素(saponin)衍生物QS21(Cambridge Biotech)。
另一方面，本發明還提供了一種治療人類流行性腮腺炎感染的方法，包括給有相應需要的病人施用免疫有效劑量的本發明疫苗。
本發明疫苗的施用方式，可以是任一種能將免疫保護量的病毒株和疫苗中其它免疫原性成分運送給受試者的合適途徑。但優選經肌肉或深部皮下途徑的非腸道方式施用所述疫苗。還可以根據需要采用其它施用方式，如口服或經其它非腸胃途徑，即皮內、鼻內、或靜脈。
此種疫苗的既能提供免疫保護作用又無毒的適當劑量，可以由本領域的技術人員很容易地測定出來，意即，本發明疫苗中所含有的、既引起免疫保護又無毒性的本發明病毒量，落在傳統全病毒疫苗中的抗原有效量的范圍之內。但應理解，任何具體病人的具體劑量水平將取決于多種因素，包括年齡，總體健康水平，性別和飲食；用藥的時間，用藥的途徑；與施用的任何其它藥物的協同效應；以及想要達到的保護反應程度。當然，如果需要的話，可以以適當的間隔重復施用。在單價疫苗中較典型的是每劑至少3.7log TCID50的病毒，而更常用的是每劑4.5log TCID50。在腮腺炎、麻疹、風疹三價疫苗中，腮腺炎病毒成分將達到4.8log TCID50左右，以補償其它兩種病素成分的干擾。


圖1顯示了JL-1腮腺炎病毒分離株的SH基因編碼區以及SH-HN基因間區段的cDNA序列。
具體實施例方式
1)對SH基因進行初步測序在25cm2培養瓶內長滿的單層Vero細胞上，用dMEM Biorich培養基(50/50V/V)加0.5％胎牛血清，接種約3.0log TCID50的MumpsVax病毒商品，進行傳代。34℃溫育7天，然后收獲受感染的細胞，用Ferré和Garduno(Nucleic Acids Research 1989，17；2141)的方法提取RNA，置于100mcl水中，用二乙基焦碳酸鹽于100℃處理5分鐘。取5mcl這樣的提取物加入以下試劑進行逆轉錄40個單位的RNAsin(Boehringer Mannheim，Germany)，4mcl 5X濃縮的逆轉錄酶緩沖液(Bethesda Besearch Labs)，2mcl四種脫氧核苷三磷酸的混合物濃度為10mM，10pmole NH2寡核苷酸引物，1mclMoloney鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶(Bethesda Research Labs，每mcl200個單位)，加水使終體積為20mcl。寡核苷酸NH2與腮腺炎病毒Urabe株的F基因具有同源性。將混合物在37℃溫育45分鐘，然后于95℃加熱5分鐘。以寡核苷酸NH8和NH14作引物將cDNA經連續兩輪PCR反應進行擴增，用1mcl 1000倍稀釋的第一輪反應物作為第二輪反應的起始物。每輪PCR由25個循環組成，每個循環均是94℃加熱1分鐘，53℃加熱1分鐘，72℃加熱1分鐘。在有氟二脫氧核苷酸終止物的情況下，以NH8或NH14作引物進一步進行PCR擴增，其產物用Applied Biosystems自動測序儀(373ADNA Sequencer)按儀器配有的操作程序和說明進行分析，從而從兩個方向對相應于SH基因的PCR產物進行測序。結果發現，在所述序列中，有多個位置存在不同讀取結果(ambiguity)，經證實兩條鏈上都是如此。所得序列與Takeuchi等人(Viroloy 1991，181364-366)報道的Jeryl-Lynn序列相比，在361個堿基中有17個不同，其中包括4個未確定(unassign)堿基。所得基因序列與Afzal等人(J.Gen.Virol.1993，74；917-920)報道的JL-5分離株的序列相比，319個堿基中有9個不同，其中有4個未確定堿基。另一種情況是，不在Vero細胞上傳代，而是用超速離心收獲4.0～5.0log TCID50的MumpsVax病毒，再用隨機引物將這些病毒RNA逆轉錄成cDNA，然后以寡核苷酸NH30bis和NH3 1bis作引物進行PCR擴增，最后直接對相同區段進行測序，結果還是會發現不同讀取結果。
2)對SH基因進行克隆用MumpsVax病毒感染Vero細胞，再按上述方法制備總RNA。該RNA用隨機引物進行逆轉錄，并用寡核苷酸NH22和NH23作引物進行PCR擴增。(NH22包含Hind III限制位點，NH23包含BamHI限制位點，從而便于對擴增的DNA片段進行克隆)。將擴增的DNA用HindIII和BamHI這兩種限制性核酸內切酶切割后，克隆到載體pUC9上。最后得到11個克隆，它們各有一個相應于腮腺炎病毒SH基因區段的插入子。所有11個克隆具有與Takeuchi等的(在上述引文中)報道的序列相對應的序列。此外，有5個克隆具有DdeI酶切位點，而其它6個克隆沒有。未發現與JL-5序列相應的插入子。該結果，以及測序得到的不同讀取結果，都暗示由Afzal等人鑒定出的JL-2變異體是MumpsVax病毒中的一個重要或容易檢測的部分。
3)直接從MumpsVax傳代MumpsVax也直接在雞胚成纖維細胞(CEF)上傳代。從包括lot MJ05在內5個不同批次的細胞的第三代培養中回收病毒，以便制備MJ05A42的凍干樣品用來注射動物。用這5批病毒制備物感染Vero細胞，回收RNA，按上述方法以NH8和NH14作引物進行擴增，以備DNA測序，唯一不同的是用隨機引物啟動逆轉錄酶反應。所有5批病毒均顯示出與JL-2(Takeuchi等人)相同的序列，而且沒有不同讀取結果。
為了更進一步調查這一點，按上述方法對病毒空斑進行直接測序。用上述5批病毒感染Vero細胞培養物，對所得空斑進行處理以備測序，其中用到NH30bis和NH31bis作引物。5批中一共測了26個空斑，其中13個空斑給出與Takeuchi等報道的JL-2序列相同的序列；5個空斑給出與JL-5非常相似的序列，只有第270和279位的兩個堿基有差別；8個空斑的序列有不同讀取結果，暗示它是病毒混合物。
4)直接對病毒空斑進行測序MumpsVax的三種稀釋液，估計每0.50ml等份有100，50和10個病毒顆粒，用它們感染5cm Petri培養皿中已鋪滿、并棄去培養液的單層Vero細胞，用不含血清的dMEM Biorich(50∶50 V/V)培養基(Biorich)洗皿。在34℃使病毒吸附30分鐘。用保持在42℃的瓊脂覆蓋細胞，瓊脂層包括2.5 mldMEM Biorich培養基，0.5％胎牛血清，以及2.5ml 3％(W/V)的低膠化溫度瓊脂糖。固化后，將該瓊脂層用3ml dMEM Biorich培養基(含0.5％胎牛血清)覆蓋，并在34℃溫育。溫育7天后，棄去表面的液體培養基，加0.03％(W/V)中性紅溶液擴散1小時后，就可見到空斑。然后去掉液體和瓊脂，將一張干尼龍膜用手指壓在培養皿的底部。將該膜加數滴2x SSC浸濕，再提起。將膜在2x SSC中浸泡5分鐘，再在含0.2％(W/V)SDS的2x SSC中浸泡30分鐘，然后在UV光下暴露3至5分鐘，使病毒固定在膜上。從尼龍膜上剪下20個獨立的空斑，將這些膜片浸在100mcl水中，加1mcl RNAsin(Boehringer Mannheim，40個單位)，65℃加熱30分鐘。將100mcl液體轉移到新試管里，加10mcl 3M醋酸鈉，再加250mcl乙醇，使核酸沉淀。將混合物于-20℃過夜或于-70℃放置1小時，然后離心。沉淀物干燥后，加入以下溶液進行逆轉錄4mcl 5x濃縮的逆轉錄酶緩沖液(Bethesda ResearchLabs)，2mcl 0.1 M二硫蘇糖醇，1mcl脫氧核苷三磷酸混合物(PerkinElmer-Cetus，10mM濃度)，1mcl N6隨機引物寡核苷酸(New England Biolabs，濃度100mcg/ml)，11mcl水。然后加1mcl MMLV逆轉錄酶，37℃溫育1小時，然后95℃溫育5分鐘。取此混合物10mcl，加寡核苷酸引物NH30bis和NH31bis各500ng，并加PCR緩沖液，和1mcl Stoffel DNA聚合酶(PerkinElmer-Cetus，10μg/100 mcl終體積。將此混合物加熱30個循環，每循環為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。所得片段用Magicprep試劑盒(PromegaBiotech A7170)照其說明進行純化。用NH30bis或NH31bis作引物，采用氟二脫氧核苷酸終止物進行不對稱PCR擴增，在Applied Biosystems(373A)自動測序儀上用廠家提供的方法和反應物通過非放射性方法進行測序。結果發現，這20個來自MumpsVax的空斑中，19個與Takeuchi等人(上文)報道的JL-2序列在275個堿基中有11個堿基不同，與Afzal等人(上文)報道的JL-5序列有2個堿基不同。有1個空斑給出不同的讀取結果。該結果暗示MumpsVax可能包含一或多種在這個區段內與Afzal等發現的JL-5優勢株有差異的變異體。JL-5與所測序的空斑不同的兩個堿基是在第279和290的位置，位于SH和HN編碼區之間的基因間區段中。
5)空斑雜交為了嘗試更直接地測定MumpsVax及其衍生培養物中JL-5和JL-2型變異體的比例，采用了一種空斑雜交方法。以MumpsVax病毒和傳代的MJ05病毒感染Vero細胞單層，得到空斑，印到尼龍膜上，按前述方法固定核酸。尼龍膜先在200ml下述溶液中于65℃預雜交3小時5x SSC(SSC是0.15M氯化鈉0.01M檸檬酸鈉pH 7.2)，10x濃縮的Denhardts溶液(它是0.2％W/VFicoll 400，0.2％小牛血清，0.2％聚氯乙烯，0.1％(W/V)SDS，50mcg/ml鮭精DNA。然后在50ml溶液中于65℃輕微振蕩2.5小時，以便進行雜交，所用的溶液具有與前述溶液相同的成分、已預熱至65℃、還加入了放射性探針和冷的競爭探針溶液。用作變異體特異性探針的寡核苷酸是BC 252(能與JL-5變異體雜交)和BC 253(能與JL-2變異體雜交)。它們都要在包含下列成分的溶液中激活(kination)而標記為γ32P-ATP100ng待標記的寡核苷酸，3mcl 10x濃縮的激酶緩沖液(包括0.5M Tris-HCl pH7.6，0.1M MgCl2，50mM二硫蘇糖醇，1mM亞精胺和1mM EDTA pH8.0)，3mcl32P-ATP(Amersham International，3000Ci/nmole，10mCi/mcl)和2mcl T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)，用無菌水補足30mcl。將此混合溶液于37℃溫育30分鐘后，在95℃加熱5分鐘終止反應，然后加入重量比為100∶1的冷的競爭寡核苷酸探針，即每100ng標記探針要加10mcg冷競爭寡核苷酸，然后將混合物加入雜交溶液中。雜交后，將膜在100ml與雜交溶液成分相同的溶液中于65℃30分鐘洗滌一次，再在100ml下述溶液中65℃洗2個30分鐘SSC 5x，0.1％SDS。然后使膜干燥，并用增感屏使膜在X-射線膠片上曝光。當MumpsVax用這種技術檢測時，與JL-5變異體特異性BC 252寡核苷酸雜交的空斑大大多于與BC 253雜交的空斑。當檢查MJ05時，雖然與兩種探針雜交的空斑數基本相等，但與BC253雜交的空斑要比與BC252雜交的空斑相對多一點。
6)對純Jeryl-Lynn分離株進行純化為獲得純的JL-5和JL-2變異體分離株，對一份標明滴度為4-6logTCID50感染單位的商品化MumpsVax(批號92A06，來自Merck Sharp andDohme，存放在Public Heath Laboratory Services，Porton Down，Wiltshire，UK，登記號為Jeryl-Lynn Mumps strainV93110585，1993年11月5日)樣品進行有限稀釋，然后在96孔微滴板上以約每孔0.1感染單位的接種量感染雞胚成纖維細胞。將這些板在34℃溫育11天以使病毒增殖。全部192個接種孔中有17孔出現細胞病變效應，說明有病毒生長。將這些孔接種到另一批CEF細胞培養物中。使滴度約4.9 log TCID50的第二次傳代物濾過0.8μm濾膜，并以42,000rpm離心1小時，將病毒沉淀用100mcl H2O重新懸浮，以此來確定所分離的病毒的特性(identity)。加入1mcl RNase抑制劑(BoehringerMannheim，40單位/mcl)，65℃溫育30分鐘，再加1/10體積的3M醋酸鈉(pH4.5)，然后加2.5倍體積的乙醇。-20℃沉淀過夜或-70℃沉淀1小時，然后在Eppendorf臺式(bench-up)離心機中4℃離心30分鐘，并將沉淀干燥。
對所得病毒RNA進行逆轉錄，方法是向所述沉淀中加入20mcl下述混合物4mcl 5x核心RT緩沖液(Bethesda Research Labs)，2mcl 10nM脫氧核苷三磷酸混合物(Perkin Elmer，Cetus)，1mcl隨機引物N6(Biolabs，100mcg/ml)，11mcl H2O，1mcl MMLV逆轉錄酶(Bethsda Research Labs)。37℃溫育1小時后，95℃經歷5分鐘以抑制逆轉錄酶。取加熱后的混合物10mcl，在終體積100mcl中，用引物NH30bis和NH31bis，按以下程序，進行30個循環的PCR擴增95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。所得片段用Magic Prep(Promega)按廠家提供的實驗程序進行純化。
將6個僅與JL-5探針反應的分離株接種到Vero細胞中，獲得空斑。再轉印到尼龍膜上，使這些膜與BC 252和BC253寡核苷酸雜交，所述兩種寡核苷酸都已如前述通過激活作用帶上32P標記。雜交是在5x SSC中，用約100ng帶標記的寡核苷酸和10mcg冷的競爭寡核苷酸，在終體積50ml中，于65℃進行2.5小時。每種分離株測試了大約200個空斑，無一與JL-2探針(寡核苷酸BC253)反應。所有空斑全都與BC 252反應。
有一株病毒分離株，源自微滴板上的9H2A孔，后進一步鑒定為SBB株JL-1，將它在CEF細胞上再傳兩代。末次傳代(從最初的MumpsVax材料算起一共傳了四代)后，用該病毒感染Vero細胞，得到空斑，轉印至尼龍膜上，通過與經激活作用而帶上32P標記的寡核苷酸BC 252和BC253雜交來進行檢驗。用JL-2特異性探針BC253檢測了2000多個空斑，沒有一個與該探針反應。用寡核苷酸BC 252測試了較少數量的空斑，所有均呈陽性反應。對CEF細胞上第四代傳代物中獲得的JL-1株的病毒集合物進行直接測序，方法是將病毒離心，用乙醇沉淀，然后用隨機引物按前述方法進行逆轉錄。cDNA通過PCR反應進行擴增，采用寡核苷酸NH14和BC265作引物，按下列程序擴增30個循環94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。所得DNA片段在Magic Prep柱(Promega Biotech)上按廠家的說明進行純化，在Applied Biosystems 373A自動測序儀上依廠家說明并使用NH14，BC265，NH30bis和NH31bis作引物進行測序。于是得到如圖1所示的序列。令人意外的是，這個序列與Afzal等得到的JL-5分離株的序列在SH和HN基因編碼區之間的基因間區段有6個位點不同。
第二個鑒定為10H5F并且僅與JL-5探針反應的病毒分離株也進行了測序，方法是用第二代病毒感染Vero細胞，將空斑轉至尼龍膜上，用NH14和BC265寡核苷酸作引物進行PCR擴增，然后測序。如此得到一個序列，它與上述9H2A的序列相同，但與已公開的JL-5分離株序列在SH-HN基因間區段中有6個堿基不同。
7)免疫原性用猴測試實施例6所得JL-1株的免疫原性。將一種名為MJ11A42的JL-1病毒凍干制品(MumpsVax的第四代傳代物，是在CEF細胞上于34℃生長6天后獲得的)，以4.2log TCID50的劑量通過皮下注射方式免疫一組4只非洲綠猴。另三組的每組4只猴子注射以下物質(a)濃度為4.3log TCID50的MumpsVax；(b)凍干制品MJ21A42，濃度為每劑4.3log TCID50，是經32℃生長9天后收獲到的，衍生自MumpsVax在CEF細胞中的直接傳三代，(c)凍干制品MJ05A42，濃度為每劑4.3 TCID50，是在CEF細胞中在34℃生長7天后收獲的病毒，衍生自MumpsVax的三次直接傳代，這三代不同于MJ21A42制品的傳代物。
注射前(第0天)，以及預防接種后的第28和42天分別抽取血標本，用Behring的商品化Enzygnost Anti-Parotitis Virus試劑盒(Behringwerke AG，Marburg，Germany)，按照廠家建議測試血標本中抗腮腺炎病毒的IgG抗體的存在。如表1所示，從純JL-1病毒株衍生的制品在所述動物體內誘導出比包括MumpsVax在內的其它制品更高的抗腮腺炎病毒抗體滴度。另外，將這些血清進行兩倍系列稀釋，用MumpsVax作測試病毒，在空斑減少(reduction)試驗中進行測試。那些注射了MJ11A42的動物的血清比其它血清產生的空斑數減少。
8)臨床研究進一步在臨床試驗中，用大約15個月大的血清陰性兒童，測試JL-1病毒株。使用純的JL-1株作為腮腺炎成分，或使用MumpsVax如實施例6所述在CEF細胞上直接傳代而得到的病毒，配制麻疹、腮腺炎和風疹三價疫苗，并冷凍干燥。試驗中還使用了M-M-RII疫苗商品，它由Merck and CoInc生產，可從Merck Frossr Inc Kirkland，Quebec，Canada得到；它含有Jeryl-Lynn(B-水平)株作為腮腺炎成分。
這三種疫苗制品中腮腺炎病毒的滴度經測定為批號為MJR111D42(含純JL-1株)的疫苗為每劑4.5log TCID，批號為MJR121C42(含傳代的MumpsVax病毒)的疫苗為每劑4.7logTCID，批號為80391OU的商品化M-M-RII疫苗為每劑4.5logTCID。
接種前和接種后第42天抽取受試兒童的血標本。
抗腮腺炎病毒的IgG抗體的存在，用實施例6所述商品化試劑盒進行測試。如表3所示，三種制品中，純JL-1株MMR疫苗誘導出最高的血清轉換率和最高的幾何平均滴度。
表1

表2

表3血清抗體反應陰性的受試者對腮腺炎病毒的血清轉換和幾何平均滴度(GMT)

生物材料保藏的說明以下生物材料保藏于歐洲細胞培養物保藏中心。

序列表(1)一般資料(i)申請人Smithkline Beecham Biologicals sa(ii)發明題目疫苗(iii)序列數目13(iv)通訊地址(A)收信人 Smithkline BeechamCorporate Intellectual Property(B)街道SB House L/5 Great West Road(C)城市Brentford(D)州Middlesex(E)國家United Kingdom(F)郵編TW8 9BD(v)計算機的可讀形式(A)介質類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類號(viii)代理/代理人資料(A)姓名Dalton，Marcus JW(ix)電訊資料(A)電話44 181 975 4093(B)傳真44 181 975 3688(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度393bp
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否(iv)反義否(vi)來源(A)生物體腮腺炎病毒(B)株系Jeryl lynn-1(xi)序列說明SEQ ID NO1TGAATCTCCT AGGGTCGTAA CGTCTCGTGA CCCTGCCGTC GCACTATGCC GGCAATCCAA 60CCTCCCTTAT ACCTAACATT TCTAGTGCTA ATCCTTCTCT ATCTCATCAT AACCCTGTAT120GTCTGGACTA TATTGACTAT TAACTATAAG ACGGCGGTGC GATATGCAGC ACTGTACCAG180CGATCCTTCT CTCGCTGGGG TTTTGATCAC TCACTCTAGA AAGATCCCCA ATTAGGACAA240GTCCCGATCC GTCACGCTAG AACAAGCTGC ATTCAAATGA AGCTGTGCTA CCATGAGACA300TAAAGAAAAA AGCAAGCCAG AACAAACCTA GGATCATAAC ACAATACAGA ATATTAGCTG360CTATCACAAC TGTGTTCCGG CCACTAAGAA AAT 393(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度15bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否
(iv)反義否(vi)來源(A)生物體nh2(xi)序列說明SEQ ID NO2GTAGCACTGG ATGGA 15(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH8(xi)序列說明SEQ ID NO3TCTGTGTTGT ATTGTGATCC 20(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vi)來源(A)生物體NH14(xi)序列說明SEQ ID NO4
GTCGATGATC TCATCAGGTAC21(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度33bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vi)來源(A)生物體NH22(xi)序列說明SEQ ID NO5CGGTAGAAGC TTGTCGATGA TCTCATCAGG TAC33(2) SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度32bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH23(xi)序列說明SEQ ID NO6CGCTGAGGAT CCTCTGTGTT GTATTGTGAT CC 32(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度18bp
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH30(xi)序列說明SEQ ID NO7ATCTCCTAGG GTCGTAAC 18(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH31(xi)序列說明SEQ ID NO8TTTGGATGCA GCTTGTTC 18(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度28bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源
(A)生物體NH 30 BIS(xi)序列描述SEQ ID NO9AATCTCCTAG GGTCGTAACG TCTCGTGA 28(2)SEQID NO10的資料(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH 31 BIS(xi)序列說明SEQ ID NO10TTTGAATGCA GCTTGTTCTA GCGT24(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度29bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體BC265(xi)序列說明SEQ ID NO11CCGACATTAT GAATAGTTTC GAGGGCTCC 29
(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體bc252(xi)序列說明SEQ ID NO12ATATCGCACC GCCGTCTTAT AGTTAATAGT C 31(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體BC253(xi)序列說明SEQ ID NO13ATACCGAACC GCCGTATTAT GGTTAATGGT C 32

關于微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
權利要求
1.一種減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，其特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含圖1所示的核酸序列。
2.減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株在制備疫苗中的用途，其中所述減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株的特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含圖1所示的核酸序列。
3.權利要求2的用途，其中所述的減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株是免疫原性基本上均一的Jeryl-Lynn分離株。
4.權利要求2或3的用途，其中所述的疫苗是腮腺炎疫苗。
5.權利要求2或3的用途，其中所述的疫苗是聯合疫苗，該聯合疫苗還含有一種或多種減毒麻疹病毒、或減毒風疹病毒或滅活的麻疹或風疹病毒，或是這些病毒的亞單位。
6.如權利要求2-5之一所述的疫苗，另外還含有一種藥劑以提供抗水痘或帶狀痘疹感染的保護。
全文摘要
本發明提出了一種新的流行性腮腺炎疫苗，它包括從腮腺炎病毒的Jeryl－Lynn株衍生來的一種均一純化分離株。本發明優選實施方案中這種疫苗產生的血清轉化率和抗體滴度都比已知的商品化疫苗要高。
文檔編號A61P31/00GK101092609SQ20071010326
公開日2007年12月26日 申請日期1994年11月15日 優先權日1993年11月19日
發明者奈杰爾·M·哈福德, 布里格特·D·A·科勞, 讓·迪德萊茲 申請人:葛蘭素史密斯克萊生物公司