專利名稱：：千里香葉總黃酮及其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于天然藥物化學研究領域。
背景技術：
：千里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]為蕓香科九里香屬植物，主要產自我國云南、貴州、湖南、廣東、廣西、福建、臺灣等地。千里香與九里香屬另外一種藥用植物九里香[MurrayaexoticaL.]—起被中華人民共和國藥典2005版一部所收載，是九里香藥材的原植物之一。到目前為止有人從千里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]葉中共分得5個黃酮類化合物，分別是3，5，6，7，8，3'，4'，5'-八甲氧基黃酮(3，5，6，7，8，3'，4'，5'-octamethoxyflavone)即月桔素(Exotiein);3，5，7，8，3'，4'，5'-七甲氧基黃酮(3，5,7，8,3'，4',5'-h印tamethoxyflavone)即木槿黃素七甲醚(hibiscetinh印tamethylether);3，5，6，7，3'，4'，5'--七甲氧基黃酮(3,5，6，7,3'，4'，5'-h印tamethoxyflavone)(江蘇新醫學院，中藥大辭典，上冊，上海人民出版社，1977:44-45);5，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮(5,7，8，3'，4'，5'-hexamethoxyflavone)即版納九里香素(ba腿murpanisin)(植物學報1984，26(2):184-186)以及5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮(5，7，3'，4'，5'-pentamethoxyflavone)(化學學報1984，42，1308-1311)。
發明內容本發明的目的是提供一種從千里香葉中得到的以新發現的黃酮類化合物為主要成分，具有生物活性的黃酮類化合物的混合物即千里香葉總黃酮，它是一種中藥有效部位。其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮中的的兩種或兩種以上；而且其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5:六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%或者5,7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'_四甲氧基黃酮的含量大于50%。本發明還提供了千里香葉總黃酮的制備方法，其特征在于提供如下步驟獲得千里香葉總黃酮(1)千里香葉水煎煮或有機溶劑回流提取，水提取液直接過大孔吸附樹脂吸附，有機溶劑提取液先回收有機溶劑，加水溶解或懸浮后過大孔吸附樹脂吸附(2)堿水或低濃度有機溶劑洗脫后水洗至中性(3)有機溶劑解吸(4)洗脫液濃縮，得千里香葉提取物(5)千里香葉提取物用水溶解或懸浮后過聚酰胺柱吸附，有機溶劑洗脫，洗脫液回收溶劑，獲得千里香葉總黃酮(6)將千里香葉提取物或千里香葉總黃酮進行柱層析純化獲得純度更高的九里香葉總黃酮。其中所述的大孔吸附樹脂選自AB-8、D4020、DlOl、D102、D103、860021、HP20的一種或一種以上混合物；所述的柱層析選自硅膠、氧化鋁、ODS或聚酰胺柱層析的一種或一種以上；堿溶液選自堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物的水溶液。本發明還提供了上述千里香葉總黃酮在制備治療心肌缺血藥物中的用途以及千里香葉總黃酮與醫學上可接受的藥用輔料組成的藥物組合物；其劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或注射劑。本發明是通過如下技術方案完成的。(1)通過對千里香葉化學成分的提取分離及結構鑒定，從千里香葉中首次發現了5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮以及3-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮的存在(2)通過提取方法的研究，發明了以5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5,3'，4'-三甲氧基黃酮為主要成分的千里香葉總黃酮的制備工藝。本制備工藝可以獲得上述黃酮類化合物的含量之和在50%至氧基黃酮、5，7，3'，4'，5:五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的HPLC含量測定方法(4)通過動物實驗發現了千里香葉總黃酮的醫藥用途(5)對以千里香葉總黃酮為活性成分的藥物制劑進行了研究，具體如下。1、千里香葉化學成分的提取分離本發明用千里香葉購自云南，經鑒定為蕓香科九里香屬植物千里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]。將干燥的千里香葉2Kg粉碎后加水煎煮提取3次，加水量分別為30升，24升，20升，煎煮時間分別是2小時，1.5小時，1小時，合并三次提取液。濾液通過大孔吸附樹脂柱吸附，水洗，95%的乙醇解吸，回收乙醇得到千里香葉提取物。將千里香葉提取物上Al203柱，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，TLC檢測，合并相同組分，得到A、B、C三部分。將A、B、C三部分反復進行硅膠柱層析，得到黃酮類單體化合物JA，JB，JC，JD，JE及JF六個單體化合物。2.千里香葉化學成分的結構鑒定2.1化合物JA的結構鑒定JA為白色粉末，熔點195.5-196.5°C，紫外燈下顯示亮色熒光，易溶于氯仿，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于水。HCl—Mg反應陽性，顯示淡紫紅色。FeCl3反應呈陰性，提示可能不含酚羥基，A1C1:,反應陽性，紫外燈下為黃綠色熒光。上述反應提示JA可能為黃酮類化合物。"CNMR譜中共有19個信號，由135°和90°DEPT譜可知，其中Sc55.70、55.98、56.01和56.36為甲氧基碳信號。H麗R中SH3.90、3.94、3.95處的單峰為甲氧基質子信號；7.46為1H、dd峰，J=9.0Hz，1.8Hz，說明在母核的苯環上有相鄰的氫，并且在這個氫的間位還有一個氫；6.58為1H、s峰，是3位質子信號；6.53、6.35各1H，均為d峰，J=2.4Hz，說明這兩個氫在苯環上處于間位。由HMBC譜可知，SH6.35(1H，d，J=2.4Hz)與Cs、C7、C8、d。相關，應歸屬為H-6;S6.53(1H，d，J=2.4Hz)與Ce、C7、C9、d。相關，歸屬為H-8;S6.58(1H，s)與C2、C4、C10、d.相關，歸屬為H-3;SH7.26(1H，d，J=1.8Hz)與C2、Cr、C3、C4、Ce.相關，歸屬為H-2';SH6.92(IH，d，J=9.0Hz)與C,.、C3'、(V相關，歸屬為H-5';SH7.47(1H，dd，J=9.OHz，1.8Hz)與C2、C2'、。相關，歸屬為H-6';5H3.90(3H，s)與G相關，歸屬為7-0CH3;而SH3.95(3H，，s)與〔3相關，歸屬為3'-0CH3;SH3.94(6H，brs)與C5和。相關，是4'位和5位甲氧基共同的吸收信號。ES-MS給出分子離子峰為343(M+H)，證明JA分子量為342。根據以上分析，確定化合物JA為5，7，3'，4'，-四甲氧基黃酮(5，7，3'，4'-tetramethoxyflavone)，此化合物首次從千里香葉中分得。<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>化合物JA的結構式<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.2化合物JB的結構鑒定JB為白色粉末，熔點199-200°C，紫外燈下顯示亮色熒光，易溶于氯仿，難溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于冷水。HC1—Mg反應陽性，顯示淡紫紅色。FeCl3反應陰性，提示可能不含有酚羥基。AlCl3反應陽性，紫外燈下為黃綠色熒光。上述反應提示JB可能為黃酮類化合物。Molish反應陰性，顯示分子中不含糖。"C麗R譜中共有17個信號，其中SG153.43、103.27、56.28比正常碳信號約高2倍，表明分子中有化學環境完全相同的碳，即母核的B環上含有對稱結構，且由135°和90°DEPT可知，SJ53.43為季碳信號，103.27為叔碳信號，56.28為甲氧基碳信號，60.95、56.36、55.76也為甲氧基信號。'H麗R中S3.92(3H)、3.93(3H)、3.95(6H)、3.96(3H)處的單峰均為甲氧基質子信號，7.07(s，2H)應為母核B環上非相鄰對稱位置上的質子信號，6.62(s，1H)為3位質子信號，6.57(1H，d，J=2.4Hz)、6.38(1H，d，J=2.4Hz)，為母核A環上的間位質子信號。通過HMBC譜可知，SH7.07(2H，s，)與C2、d.、C3.、C4.、C6.相關，歸屬為H-2';"6.62(1H，s，)與C2、C4、C)、C,'相關，歸屬為H_3;"6.38(d，J二2.4Hz)與C5、C7、C8、d。相關，歸屬為H_6;SH6.57(1H，d，J=2.4Hz)與"、C7、C9、d。相關，歸屬為H-8;SH3.96(3H，s)與Cs相關，歸屬為5-0CH3;SH3.93(3H，s)與"相關，歸屬為7_0CH3;SH3.95(6H，s)與C:,.、C5相關，歸屬為3'和5'-0CH3;"3.92(3H，s)與(V相關，歸屬為4'-0CH3。ES-MS給出分子離子峰為373(M+H)，證明JB分子量為372。根據以上分析，確定化合物JB為5，7，3V4'，5'-五甲氧基黃酮(5，7，3'，4'，5'-pentamethoxyflavone)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>難溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于水。HCl—Mg反應陽性，顯示淡紫紅色。FeCl3反應陰性，提示可能不含有酚羥基。AlCl3反應陽性，紫外燈下為黃綠色熒光。上述反應提示JC可能為黃酮類化合物。Molish反應陰性，顯示分子中不含糖。"CNMR譜中共有18個信號，與化合物JB相比較，大部分信號的化學位移值未發生顯著變化，但"由Sc96.13變為130.52，且在S^6.49處多了1個甲氧基信號，'H麗R中較化合物JB少了間位偶合質子信號，SH3.97(3H，s)為甲氧基質子信號，這表明化合物JC為六甲氧基黃酮，其多出的甲氧基應連接在6位碳上。通過匿BC譜可知，SH6.45(1H，s，)與C6、C7、C9、d。相關，歸屬為H-8;SH6.65(1H，s，)與C2、C4、C10、d相關，歸屬為H-3;SH7.19(2H，s)與G、、d'、C3.、C4.、Cr相關，歸屬為H-2'和H-6';"3.92(3H，s)與".相關，歸屬為4'-0CH3;"3.96(6H，s)與C:r、C5.相關，歸屬為3'和5'-0CH3;SH3.97(3H，s)與Cs相關，歸屬為5-0CH3;"4.00(3H，s)與Ce相關，歸屬為6-0CH3;SH4.02(3H，s)與(]7相關，歸屬為7-0CH3。ES-MS給出分子離子峰為403(M+H)，證明JC分子量為402。根據以上分析，確定化合物JC為5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮(5，6，7，3'，4'，5'-hexamethoxyflavone)。此化合物亦為首次從千里香中分得。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>化合物JC的結構式Table3The'C畫RandH麗RdataforcompoundJCinCDC1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.4化合物JD的結構鑒定JD為白色粉末，熔點207-208°C，紫外燈下顯示亮色熒光，易溶于氯仿，難溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于水。HCl—Mg反應陽性，顯示淡紫紅色。FeCls反應陽性，產生墨綠色沉淀，提示可能含有酚羥基。AlCl3反應陽性，紫外燈下為黃綠色熒光。上述反應提示JD可能為黃酮類化合物。Molish反應陰性，顯示分子中不含糖。"C麗R譜中共冇18個信號，由135°DEPT譜可知，其中Sc55.87、56.07、56.19為甲氧基碳信號，其它各碳信號符合黃酮母核的結構。因135°DEPT譜顯示有9個季碳，而只有三個甲氧基，說明在某一位置應帶有一羥基。'H麗R中SH3.805、3.837、3.876處的單峰為甲氧基質子信號；7.46為1H、dd峰，J=9.0Hz，1.8Hz，說明在母核的苯環上有相鄰的氫，并且在這個氫的間位還有一個氫；6.67為1H單峰為3位質子信號；6.37、6.57各1H，均為d峰，J=2.4Hz，說明這兩個氫在苯環上處于間位。由HMBC譜可知，S6.47(1H，d，J=2.4Hz)與Cs、C7、C8、d。相關，應歸屬為H-6;S6.77(1H，d，J=2.4Hz)與Ce、C7、C9、d。相關，歸屬為H-8;"6.58(1H，s)與C2、C4、C10、d相關，歸屬為H-3;SH7.37(1H，d，J二1.8Hz)與C2、C3.、C4.、Qr相關，歸屬為H-2';SH7.05(IH，d，J二9.0Hz)與d.、C3.、Cr相關，歸屬為H-5';5H7.47(IH，dd，J=9.OHz，1.8Hz)與G、C,、。相關，歸屬為H-6';S3.80(3H，s)歸屬為5-0CH3，SH3.84(3H，s)歸屬為4'-0CH3,5H3.87(3H，s)歸屬為7-0CH3。ES-MS給出分子離子峰為329(M+H)，證明JD分子量為328。根據以上分析，確定化合物JD為3'-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮..<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>此化合物亦為首次從千里香中分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>Table4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.5化合物JE的結構分析JE為白色粉末，熔點235-236°C，紫外燈下顯示亮色熒光，易溶于氯仿，難溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，幾乎不溶于冷水。HC1—Mg反應陽性，顯示淡紫紅色。FeCh反應陽性，產生墨綠色沉淀，提示可能含有酚羥基。AlCl3反應陽性，紫外燈下為黃綠色熒光。上述反應提示JE可能為黃酮類化合物。Molish反應陰性，顯示分子中不含糖。"CNMR譜中共有18個信號，由135°DEPT譜可知，其中"55.99、55.93、55.82為甲氧基碳信號，其它各碳信號符合黃酮母核的結構。^麗R中S3.786、3.823、3.855處的單峰為甲氧基質子信號；7.58為1H、dd峰，J=9.0Hz，1.8Hz，說明在母核的苯環上有相鄰的氫，并且在這個氫的間位還有一個氫；6.528、1H單峰為3位質子信號；6.47、6.77各1H，均為d峰，J二2.4Hz，說明這兩個氫在苯環上處于間位。由HMBC譜可知，SH6.37(1H，d，J=2.4Hz)與Cs、C7、C8、C。相關，應歸屬為H-6;S6.57(1H，d，J=2.4Hz)與Cs、C7、C9、Cu)相關，歸屬為H-8;SH6.67(1H，s)與C2、C4、Clfl、d相關，歸屬為H-3;SH7.47(1H，d，J二1.8Hz)與C2、C3、C4.、Ce相關，歸屬為H-2';SH7.09(1H，d，J=9.0Hz)與d'、C3、C,'相關，歸屬為H-5';SH7.58(IH，dd，J=9.OHz，1.8Hz)與C2、C2、。相關，歸屬為H-6';SH3.79(3H，s)歸屬為5-0CH3，S3.82(3H，s)歸屬為4'-OCH3,SH3.86(3H，s)歸屬為3'-OCH3。ES-MS亦給出分子離子峰為329(M+H)，證明JE分子量為328。根據以上分析，確定化合物JE為7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮。此化合物亦為首次從千里香葉中分得?；衔颙E的結構式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>"3C化學位移口J互換2.6化合物JF的結構鑒定JF為白色粉末，紫外燈下顯示亮色熒光，易溶于氯仿，難溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于冷水。HCl—Mg反應陽性，顯示淡紫紅色。FeCl3反應陰性.，提示可能不含有酚羥基。A1CL反應陽性，紫外燈下為黃綠色熒光。上述反應提示JB可能為黃酮類化合物。Molish反應陰性，顯示分子中不含糖。13CNMR譜中共有17個信號，由135。和90°DEPT可知，61.47，56.53，56.25，56.03，55.90為甲氧基信號。窗R中SH3.964(6H)、3.977(3H)、3.996(3H)、4.015(3H)處的單峰均為甲氧基質子信號。通過HMBC譜可知，6.444(s，1H)與Cfi、C7、U相關，歸屬為8位質子信號；6.621(s，1H)與C2、d。、C2相關，歸屬為3位質子信號，7.424(1H，d，J=1.8Hz)與C2、Gr、C4、Cr相關，歸屬為2'位質子信號，7.597(1H，dd，J=8.4，J二1.8Hz)與"、C2、<:4相關歸屬為6'位質子信號，7.002(1H，dd，J=8.4)與d.、C3.、C4-相關，歸屬為5'位質子信號。SH4.015(3H，s)與Cs相關，歸屬為5-0CH3;SH3.996(3H，s)與。7相關，歸屬為7-0CH3;SH3.964(6H，s)與Cfi、CV相關，歸屬6和4'-0CH3;5H3.977(3H，s)與C3.相關，歸屬為3'-OCH3。根據以上分析，確定化合物JF為5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮(5，6，7，3'，4'-pentamethoxyflavone)。此化合物亦為首次從千里香葉中分得?；衔颙F的結構式<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>化合物JA、JB、JC、JD、JE、JF的'H-麗R、"C-NMR、DEPT、'H」HC0SY、HMQC以及HMBC等光譜圖如圖l一36所示。3、千里香葉總黃酮制備工藝研究為了從千里香葉得到黃酮含量高雜質含量低的總黃酮，本發明經反復研究最終完成了如下制備工藝。千里香葉中的黃酮類化合物可以通過水煎煮或有機溶劑回流等方法進行提取。由于千里香葉中的黃酮類化合物均是低極性化合物，水煎煮提取效果不好，提取次數多達7-8次才能提取完全，因此最好是采用有機溶劑回流提取方法進行提取，具體可用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等回流提取。因為乙醇毒性小，價格便宜，因此最好用乙醇回流提取。研究發現千里香葉中的黃酮類化合物可以被大孔吸附樹脂吸附，因此采用大孔吸附樹脂吸附法進行初步純化，將提取液中的黃酮類成分與蛋白、多糖、葉綠素等雜質分離。水提取液可以直接過大孔吸附樹脂吸附，而有機溶劑提取液則回收溶劑至一定體積后加水稀釋，然后過大孔吸附樹脂吸附。吸附完畢后先用低濃度有機溶劑或堿溶液洗脫，目的是把被大孔吸附樹脂吸附的部分雜質洗脫下來。堿水洗脫完畢后用水洗至中性，然后用有機溶劑解吸，把黃酮類成分洗脫下來，洗脫液經減壓或常壓濃縮，得千里香葉提取物。其中除了黃S類成分外還含有香豆素及生物堿類成分，黃酮類成分的含量低于50%，不能直接用來研制開發中藥新藥。上述制備工藝中所述的大孔吸附樹脂可選用AB-8、D4020、DlOl、D102、D103、860021、HP20的一種或一種以上混合物或具有相同或相似功能的其他廠商牌號的吸附樹脂；所述的柱層析可選用硅膠、氧化鋁、ODS或聚酰胺柱層析的一種或一種以上。除雜質或洗脫用有機溶劑可以使用甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、異丙醇、正丁醇等極性較大的有機溶劑或它們與水的混合溶液，最好是使用乙醇的水溶液。利用低濃度有機溶劑的水溶液洗脫除雜質時所謂的低濃度是以不把黃酮類化合物洗脫下來為上限，一般不高于20%。堿溶液洗脫除雜質時可以使用的堿溶液有堿金屬氫氧化物、堿土金屬氫氧化物的溶液或其他無機或有機堿的溶液，最好是氫氧化鈉水溶液，濃度以千分之一為宜。將千里香葉提取物用水溶解或懸浮后過聚酰胺柱吸附，有機溶劑洗脫，洗脫液回收溶劑，即可以獲得千里香葉總黃酮，其中除了黃酮類成分外還含有香豆素類成分但黃酮類成分的含量大于50%。將上述方法所得千里香葉提取物，加水溶解或懸浮后用有機溶劑萃取，萃取液減壓濃縮，干燥，也可以獲得千里香葉總黃酮，這樣得到的千里香葉總黃酮，其中黃酮類成分的含量有所提高，雜質含量有所降低。用來萃取的有機溶劑可以是氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等與水不相混溶的溶劑，最好是氯仿或乙酸乙酯。最后將上述方法獲得的千里香葉提取物或千里香葉總黃酮進一步進行柱層析純化可以獲得純度更高的精制千里香葉總黃酮，經薄層色譜及高效液相色譜檢測，其中主要成分是化合物JA、JB、JC、JD、JF，它們的含量之和在50%至100%之間，而且可以得到除了黃酮類成分外不含其他成分的總黃酮，其中包括只含有化合物JA、JB、JC、JD、JE、JF的千里香葉總黃酮。所述柱層析可選用硅膠、氧化鋁、0DS、聚酰胺柱層析的一種或一種以上。4、千里香葉總黃酮中黃酮類化合物的含量測定方法研究利用分光光度法可以測定黃酮類化合物的總含量，但其結果沒有HPLC法準確，故建立了HPLC含量測定方法。(1)儀器、試劑、對照品Agilent1100Series高效液相色譜儀ZORBAXExtend—C184.6X250,0DS，5um色譜柱VWD可變波長自外檢測器色譜甲醇、二次蒸餾水將前述分離得到的JA、JB、JC、JD、JF單體通過重結晶或ODS純化獲得含量測定用對照品。按本方法色譜條件，歸一化測得純度均超過98%，符合相關要求。(2)色譜條件色譜柱用ZorbaxExtend,4.6X250mm，5um，0DS;柱溫為25。C;流動相為甲醇水=58:42;流速為1.2mL/min;檢測波長為337nm;進樣量為20y1。(3)樣品溶液的制備取干燥的九里香莖葉粉末(過60目篩)lg,加甲醇78'C水浴回流提取3次，每次加甲醇15ml，回流時間分別是2h、1.5h、lh，合并提取液，蒸干溶劑后甲醇定容至50.00ml，過濾，取濾液2.0ml至10ml容量瓶中，定容，即得。(4)測定方法分別精密吸對照品液與供試品溶液各20y1，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，利用外標一點法進行含量計算。具體實施例方式實施例1取千里香葉2公斤，加水煎煮提取7次，每次加水量為24升，煎煮時間為l小時，濾過，合并提取液，過AB-8大孔吸附樹脂吸附，用水沖凈后用50升千分之一氫氧化鈉的水溶液沖洗，用水洗至中性后用85%乙醇溶液洗脫至薄層層析檢測不到JA為止。洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉提取物153克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為23。/。。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后過聚酰胺柱吸附，用水沖凈后用85%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉總黃酮74克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為51%，TLC表明其中還含有香豆素類成分。取此千里香葉總黃酮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液為流動相進行梯度洗脫，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑，得精制千里香葉總黃酮35克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為75%，其中JA、JB、JC的含量之和為53%，不含香豆素等其他別的成分。實施例2取千里香葉2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分別為10、8、6倍，回流時間為45分鐘，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味，加水稀釋，過860021大孔吸附樹脂吸附，用40升10%乙醇水溶液沖洗后用甲醇洗脫至薄層層析檢測不到JA為止，洗脫液減壓回收甲醇，得千里香葉提取物132克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為28%。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后過聚酰胺柱吸附，用水沖凈后用80%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉總黃酮83克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為55%，TLC檢測表明含有香豆素。最后取此千里香葉總黃酮進行氧化鋁柱層析，用乙酸乙酯和甲醇的混合溶液為流動相進行梯度洗脫，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑，得精制千里香葉總黃酮38克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為84%，其中JA、JB的含量之和為59%,不含香豆素類成分。實施例3取千里香葉2公斤，甲醇回流提取3次，甲醇量分別為IO、8、6倍，回流時間為1小時，濾過，合并提取液，減壓濃縮至干，加水加熱溶解，過D4020大孔吸附樹脂吸附，用水沖凈后用50升千分之一氫氧化鉀水溶液沖洗，用水洗至中性后用丙酮洗脫至薄層層析檢測不到JA為止，洗脫液減壓回收丙酮，得千里香葉提取物149克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為21%。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后過聚酰胺柱吸附，用水沖凈后用80%甲醇洗脫，洗脫液減壓回收甲醇，得千里香葉總黃酮89克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為58%，TLC檢測含有香豆素類成分。最后取此千里香葉總黃酮進行聚酰胺柱層析，用氯仿和甲醇的混合溶液為流動相進行梯度洗脫，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑，得精制千里香葉總黃酮41克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量為65。/。，另含有少量香豆素類成分。實施例4取千里香葉2公斤，丙酮回流提取3次，丙酮量分別為IO、8、6倍，回流時間為1小時，濾過，合并提取液，減壓濃縮至干，加水加熱溶解，過D101大孔吸附樹脂吸附，用水沖凈后75%異丙醇洗脫至薄層層析檢測不到JA為止，洗脫液減壓回收異丙醇，得千里香葉提取物146克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為19%。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后過聚酰胺柱吸附，用水沖凈后用80%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉總黃酮68克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為54%，TLC檢測含有香豆素。最后取此千里香葉總黃酮7克乙醇和水的混合溶液為流動相進行ODS柱層析，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑，得精制千里香葉總黃酮2.9克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為83。/。，不含香豆素。實施例5取千里香葉2公斤，乙醇回流提取3次，乙醇量分別為IO、8、6倍，回流時間為1小時，濾過，合并提取液，減壓濃縮至干，加水加熱溶解，過HP20大孔吸附樹脂吸附，用水沖凈后用50升千分之一氫氧化鈣水溶液沖洗，用水洗至中性后用正丁醇洗脫至薄層層析檢測不到JA為止，洗脫液減壓回收正丁醇，得千里香葉提取物172克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量為18%。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后用氯仿萃取，氯仿層回收溶劑，得千里香葉總黃酮93克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為50.5%，TLC檢測含有香豆素。最后取此千里香葉總黃酮用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液為流動相進行硅膠柱層析，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑，得精制千里香葉總黃酮39克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為85%，不含香豆素。實施例6取千里香葉2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分別為10、8、6倍，回流時間為45分鐘，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味，加水稀釋，過860021大孔吸附樹脂吸附，用60升10%乙醇水溶液沖洗后用甲醇洗脫至薄層層析檢測不到JA為止，洗脫液減壓回收甲醇，得千里香葉提取物132克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為3P/。。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后過聚酰胺柱吸附，用水沖凈后用80%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉總黃酮83克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為58%，TLC檢測表明含有香豆素。最后取此千里香葉總黃酮進行氧化鋁柱層析，用乙酸乙酯和甲醇的混合溶液為流動相進行梯度洗脫，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑后在進行硅膠柱層析純化，得精制千里香葉總黃酮30克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、，的含量之和為94%，其中JA的含量之和為51%，不含香豆素類成分。實施例7取千里香葉2公斤，加水煎煮提取7次，每次加水量為30升，煎煮時間為l小時，濾過，合并提取液，過AB-8大孔吸附樹脂吸附，用水沖凈后用70升千分之一氫氧化鈉的水溶液沖洗，用水洗至中性后用85%乙醇溶液洗脫至薄層層析檢測不到JA為止。洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉提取物143克。經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為27。/。。將此千里香葉提取物用水加熱溶解后過聚酰胺柱吸附，用水沖凈后用85%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，得千里香葉總黃酮74克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為61%，TLC表明其中還含有香豆素類成分。取此千里香葉總黃酮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液為流動相進行梯度洗脫，TLC檢測，收集黃酮部分，回收溶劑，得精制千里香葉總黃酮35克，將此精制千里香葉總黃酮用甲醇重結晶，得千里香葉總黃酮26克，經HPLC檢測，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和為95%，其中JA的含量之和為53%，不含香豆素等其他別的成分。實施例8取精制千里香葉總黃酮10克，加淀粉適量，制粒，裝入膠囊，制成1000粒，得千里香葉總黃酮膠囊。實施例9取千里香葉總黃酮10克，加預膠化淀粉、羧甲基淀粉鈉適量，制粒，壓片，制成1000粒，得千里香葉總黃酮片。實施例10取精制千里香葉總黃酮10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，攪拌溶解，過濾，滅菌，罐裝，每支2ml，得千里香葉總黃酮注射液。實施例11取千里香葉總黃酮5克，加吐溫80適量，加10升加熱溶解，高溫滅菌，分裝成100瓶，得千里香葉總黃酮口服液。實驗實施例1千里香葉總黃酮對實驗性心肌缺血的保護作用研究1材料和方法1.1.實驗動物Wistar大鼠，雌雄各半，體重240260g，合格證號為醫動字第10-5112，由長春高新醫學動物研究中心供給。1.2.藥品與試劑1.千里香葉總黃酮(QLXYZHT)2.肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)試劑為進口試劑。1.3.實驗方法1.實驗分組將100只Wistar大鼠隨機分為5組，每組20只，分組如下(1)假手術組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉5ml/kg.dX3d(2)梗死模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉5ml/kg.dX3d(3)小劑量組灌胃千里香葉總黃酮25mg/kg.dX3d(4)中劑量組灌胃千里香葉總黃酮50mg/kg.dX3d(5)大劑量組灌胃千里香葉總黃酮100mg/kg.dX3d2.實驗方法及觀測指標于末次給藥后30min將Wistar大鼠乙醚麻醉，仰位固定于手術臺上，測定大鼠II導聯正常心電圖后，正中剃毛，以10號線做荷包縫合，以手術刀正中切開，用止血鉗剝離肋間肌肉，自左側34肋間開胸，暴露心臟，在肺動脈圓錐及左心耳間找出左冠狀動脈前降支，于左心耳下23皿處用0號線立即結扎之，將心臟送回胸腔，迅速擠出胸腔內氣體，拉緊荷包縫合線結扎以關閉胸腔，整個開胸時間不超過30秒，假手術組不結扎而只置手術線。結扎冠脈24h后，以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔靜脈麻醉，每組一半動物腹主動脈插管取血，用COBAS-FARA自動生化分析儀測血清CK、AST及LDH活性。取血后剖取大鼠心臟，用生理鹽水洗凈心腔內積血，去掉心房組織及脂肪，稱重，將左心室心肌橫切45片，然后浸入N-BT磷酸緩沖液中，置37。C恒溫水浴，待染色完全后取出，正常組織染色，缺血組織不染色。切下缺血心肌稱重，用缺血心肌與左心室濕重的百分比計算心肌梗死面積(MIS)。3.統計方法實驗數據用SPSS10.0統計軟件處理，以均數土標準差0^^)表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。2結果2.1.千里香葉總黃酮對急性心肌梗死大鼠MIS，血清CK、AST及LDH活性的影響與假手術組相比，梗死模型組MIS，血清CK、AST及LDH活性均明顯增加(P〈0.05P〈0.001)，表明急性心肌梗死模型建成。與梗死模型組相比，千里香葉總黃酮25、50、100mg/kg組均能明顯縮小MIS，降低血清CK、AST及LDH活性(P〈0.05或P〈0.01)，100mg/kg組對上述指標無明顯影響(P〉0.05)，見表1。Tab.1EffectsofQLXYZHTonMTSandserumCK，ASTandLDHactivitiesinacutemyocardialinfarctrats(x±s，n=10)GroupMIS(%)AST(u/L)CK(u/L)LDH(u/L)Sham3.31±0.68wModel31.24±5.66QLXYZHT25mg/kg28.74±5.5750mg/kg24.37±5.24"lOOmg/kg21.14±4.38"738.5±87.5**633.4±164.廣1506.5±542.7"987.8±287.51097.5±368.72356.3±574.4873.4±134.8906.5±177.52192.3±407.8821.2±171.2*785.4±134.9"1869.7±504.5*743.1±127.1"717.6±125.7"1774.6±414.3**補〈0.05，林FKO.01,嫩P〈0.001comparedwithmodel.實驗結果表明，千里香葉總黃酮具有治療急性心肌梗死的作用。附圖l化合物JA的'H-NMR附圖2化合物JA的^C-麗R附圖3化合物JA的DEPT譜附圖4化合物JA的'H」HCOSY附圖5化合物JA的醒QC附圖6化合物JA的HMBC附圖7化合物JB的'H-NMR附圖8化合物JB的"C-NMR附圖9化合物JB的DEPT譜附圖10化合物JB的力」HCOSY附圖ll化合物JB的匿QC附圖12化合物JB的HMBC附圖13化合物JC的力-NMR附圖14化合物JC的"ONMR附圖15化合物JC的DEPT譜附圖16化合物JC的力」HCOSY附圖17化合物JC的HMQC附圖18化合物JC的HMBC附圖19化合物JD的^-NMR附圖20化合物JD的130NMR附圖21化合物JD的DEPT譜附圖22化合物JD的力」HCOSY附圖23化合物JD的HMQC附圖24化合物JD的訓BC附圖25化合物JE的'H-NMR附圖26化合物JE的"C-麗R附圖27化合物JE的DEPT譜附圖28化合物JE的^」HCOSY附圖29化合物JE的HMQC附圖30化合物JE的HMBC附圖31化合物JF的力-NMR附圖32化合物JF的"C-麗R附圖33化合物JF的DEPT譜附圖34化合物JF的力」HCOSY附圖35化合物JF的HMQC附圖36化合物JF的HMBC。權利要求1、一種千里香葉總黃酮，其特征在于其中至少含有5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3′，4′-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。2、權利要求1所述的千里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%。3、權利要求1所述的千里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3、4'，5'-六甲氧基黃酮的含量之和大于50%。4、權利要求1所述的千里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7，3'，4'，5'_五甲氧基黃酮的含量之和大于50%。5、權利要求1所述的千里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮的含量大于50%。6、權利要求1所述的千里香葉總黃酮，其特征在于其中不含有香豆素類成分。7、權利要求1所述的千里香葉總黃酮的制備方法，其特征在于通過如下步驟得到相應的千里香葉總黃酮(1)千里香葉水煎煮或有機溶劑回流提取，水提取液直接過大孔吸附樹脂吸附，有機溶劑提取液先回收有機溶劑，加水溶解或懸浮后過大孔吸附樹脂吸附(2)堿水或低濃度有機溶劑洗脫，水洗至中性(3)有機溶劑解吸(4)洗脫液濃縮，得千里香葉提取物(5)千里香葉提取物用水溶解或懸浮后過聚酰胺柱吸附，有機溶劑洗脫，洗脫液回收溶劑，獲得千里香葉總黃酮(6)將千里香葉提取物或千里香葉總黃酮進行柱層析純化獲得純度更高的九里香葉總黃酮。8、權利要求7所述的千里香葉總黃酮的制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂選自AB-8、D4020、DlOl、D102、D103、860021、HP20的一種或使用它們的混合物。9、權利要求7所述的千里香葉總黃酮的制備方法，其特征在于所述的柱層析選自硅膠、氧化鋁、ODS或聚酰胺柱層析的一種或一種以上。10、權利要求7所述的千里香葉總黃酮的制備方法，其特征在于所述的堿溶液選自堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物的水溶液。11、權利要求1所述的千里香葉總黃酮在制備預防和治療心肌缺血藥物中的用途。12、權利要求1所述的千里香葉總黃酮與醫學上可接受的藥用輔料組成的藥物組合物。13、權利要求12所述的藥物組合物，其特征在于其劑型選自片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或注射劑。全文摘要本發明提供千里香葉總黃酮及其制備方法及用途。千里香葉總黃酮是從中藥千里香的葉中提取分離的以黃酮類化合物為主要成分的有效部位，其中主要含有5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮以及7-羥基-5，3′，4′-三甲氧基黃酮。本發明的千里香葉總黃酮對急性心肌梗死具有治療作用。文檔編號A61K9/10GK101380379SQ20071014735公開日2009年3月11日申請日期2007年9月5日優先權日2007年9月5日發明者李緒文,楊瑞杰,桂明玉,王曉中,金永日,馬彥冬申請人:金永日