專利名稱：：瘤果黑種草籽油的藥物用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種維吾爾醫常用藥材一瘤果黑種草籽油作為蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑的藥物及抗脂質過氧化藥物及保健品的用途。通過體外實驗證實的它所具有的蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTP1B)抑制劑的效果以及抗脂質過氧化的功效。它形成的抗糖尿病藥物及抗氧化藥物及保健品的用途。
背景技術：
：黑種草屬植物屬毛茛科植物金蓮花亞科，其中有三種藥用植物，分別是瘤果黑種草GW《e7h^a/7oWi/era)，又名腺毛黑種草，還有果黑種草GV^WhM^'ra)，又名家黑種草以及黑種草(7W'^JhA/^s"朋L)，它們的種子是常用的藥用部分。目前國外的研究主要集中在果黑種草上。瘤果黑種草(Mge//"g/"m^/^rai^》M)，原產地為地中海沿岸及中亞地區，在我國僅新疆有栽培。它干燥成熟種子，呈三棱狀卵形，長2.5-3mm，寬約l.5mm。表面黑色，粗糙，頂端較狹而尖，下端稍鈍，有不規則的突起。質堅硬，斷面灰魄，有油性。氣微香，味辛?？梢源碳は岋L止痛、補腎健腦、利尿、發汗、健胃、抗蠕蟲、治療哮喘等，是維吾爾醫學中一種習慣用藥。近年來，經研究發現它的同屬植物果黑種草籽(M^^在降脂、降糖方面具有一定功效，經過對大鼠口服黑種果草籽固態油(Mge^^riw/)12周，未發現對肝臟中主要的酶產生影響，同時，血液中的膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、淋巴細胞和血小板數目分別比對照降低了15.5，22，16.5，35和32%血細胞比容和血紅蛋白水平上升了6.4和17.4%。用胃內管飼法給正常大鼠詞喂黑種草籽石油醚提取物4周，石油醚提取物由于減少了25%的食物，因而體重短期減輕。在體內和體外試驗中均未觀察到植物的毒性且空腹血糖保持穩定。治療4周后與對照組相比治療組的大鼠空腹胰島素和甘油三酯水平較低而HDL-膽固醇水平較高。通過Western雜交分析表明發現從各組動物中分離出來的肝細胞對胰島素水平反應上升了。在體內石油醚部分通過增加激素受體的兩種細胞內信號傳導途徑起到了胰島素增敏劑的作用。按400mg/kg給鏈尿菌素(STZ)誘導的糖尿病倉鼠胃內管詞法詞喂黑種草籽油(M'ge//aM/v")6周，在誘導糖尿病之后，用膠原酶消化并收集分離的肝細胞已確定肝糖的產生。通過在一段時間內注射熒光素乳液，24小時后收集腹膜巨噬細胞以評價吞噬能力。治療組血糖從治療前的391+/-3.Omg/dl在第一、二、三、四周后減少到325+/-4.7，246+/-5.9,208+/-2.5和179+/-3.1mg/dl。在治療組倉鼠中從糖異生作用前體來的肝糖產物明顯減少提示著它的降糖效果部分源于減少了肝糖元的合成。另外，經黑種草籽油治療后腹膜巨噬細胞的吞噬活性和吞噬指數明顯上升，外周血中淋巴細胞數量增加。這表明其免疫保護作用是通過直接刺激巨噬細胞的吞噬活力或通過刺激淋巴細胞的活力來完成的。給雄性易于中風的自發性高血脂大鼠和Wistar大鼠按800mg/kg劑量口服果黑種草籽油(Mge//aw/va)4周，可明顯降低血清中總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯的含量，同時，升高高密度脂蛋白含用STZ和煙酰胺誘導形成了糖尿病的大鼠為模型。給大鼠口服黑種草籽油(Mge//fl^"vfl)4周，血糖明顯減少，經酶連免疫和抗胰島素單抗證明，胰島素水平明顯上升。經免疫組化染色可在胰島中觀察到大量的胰島素陽性反應區，結果顯示在2型糖尿病模型中，黑中草籽油有類似胰島素的功能。由于2型糖尿病的發生發展可由遺傳和環境因素的相互作用等引起，其中，胰島素信號轉導障礙在發病機制中所起的重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteintyrosinephosphatasePTP1B)是胰島素信號轉導關鍵的負調控子。PTP1B是細胞內PTP的代表，是第一個被鑒定并純化出的哺乳動物蛋白酪氨酸磷酸酶，由435個氨基酸殘基組成，分子量約50KD，蛋白酪氨酸磷酸酶1B在人體各組織細胞中普遍存在并表達，并通過使激活的胰島素受體及胰島素受體底物(IRs-l)等去磷酸化失活而發揮生理功能。它可協調酪氨酸殘基磷酸化和去磷酸化之間的平衡，阻止胰島素信號轉導。2型糖尿病和胰島素抵抗患者體內特異的蛋白酪氨酸磷酸酶含量及活性均有所增加，當蛋白酪氨酸磷酸酶被剔除后，不僅胰島素敏感性增高，而且糖尿病癥狀也有所改善。蛋白酪氨酸磷酸酶1B缺乏的小鼠與其野生型對照小鼠相比對胰島素更敏感，血糖控制更好，而且對飲食誘導的肥胖有更好的抵抗作用。因此，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的作用已成為一種新的治療胰島素抵抗(IR)、II型糖尿病和肥胖的方法。同時，蛋白酪氨酸磷酸酶1B的高表達可引起胰島素抵抗和痩素抵抗，它的過度表達可促使載脂蛋白B100(ApoB100)分泌增加，使血漿極低密度脂蛋白(VLDL)生成增多，從而導致脂代謝紊亂、2型糖尿病及肥胖。研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因敲除鼠不僅胰島素敏感性增強，而且由于去除了蛋白酪氨酸磷酸酶1B對胰島素和瘦素信號轉導的抑制，使小鼠在高脂飲食條件下也不發生肥胖。為明確蛋白酪氨酸磷酸酶1B與脂代謝紊亂之間的關系，Klaman等對蛋白酪氨酸磷酸酶Nl基因敲除小鼠進行了研究，結果顯示長期果糖喂養普通小鼠會導致了血漿極低密度脂蛋白升高，而果糖喂養PTPN1基因敲除小鼠中未見極低密度脂蛋白升高，提示蛋白酪氨酸磷酸酶1B有促進極低密度脂蛋白分泌的作用。Taghi-biglou等在對攜帶人載脂蛋白B(ApoBux))但缺乏褐色脂肪組織的載脂蛋白B(ApoB)/褐色脂肪組織(BAT)缺陷小鼠和經果糖飼養的倉鼠模型的研究中發現，肝極低密度脂蛋白一載脂蛋白B增多將導致胰島素抵抗。有報道表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B可調控果糖誘導的糖尿病模型動物的脂蛋白譜，下調蛋白酪氨酸磷酸酶1B表達可抑制高碳水化合物誘導的胰島素抵抗及與之相關的脂代謝紊亂。因此蛋白酪氨酸磷酸酶1B不僅胰島素增敏劑的靶點之一，同時也可能是脂代謝紊亂的治療靶點之一。鑒于果黑種草籽與瘤果黑種草籽是同屬植物，且在傳統醫學中具有類似的功效以及果黑種草籽具有的降脂、降糖作用，本發明研究了瘤果黑種草籽油的降糖功能，利用常規方法獲得了瘤果黑種草籽油，并在體外證實了其蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制劑的作用和抗脂質過氧化作用。
發明內容本發明目的在于，提供一種維吾爾醫學中的常用藥材-瘤果黑種草籽油作為制備治療抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑的藥物或保健品的用途以及作為制備抗氧化藥物或保健品的用途。該瘤果黑種草籽油是從維藥瘤果黑種草籽中采用常規壓搾或溶劑萃取后減壓除去溶劑得到的，并在體外證實了其蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制劑的作用、抗脂質過氧化的能力，以及它形成的抗糖尿病及抗氧化的藥物及保健品的用途。本發明所述的瘤果黑種草籽油作為制備治療抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑的藥物或保健品的用途。本發明所述的瘤果黑種草籽油作為制備抗氧化藥物或保健品的用途。本發明所述的瘤果黑種草籽油的藥物用途，其中瘤果黑種草籽油是從維吾爾醫常用藥材一瘤果黑種草籽中，采取常規壓搾或常規溶劑提取法、微波輔助溶劑提取、超聲波輔助溶劑提取獲得的瘤果黑種草籽油，具體操作步驟按下列進行用小極性溶劑包括石油醚，己烷，庚垸，二氯甲烷，氯仿，乙醚以及它們的各種混合溶劑直接浸泡瘤果黑種草籽，然后減壓蒸餾除去溶劑即得瘤果黑種草籽油；或使用大極性的溶劑如甲醇，乙醇或0%—30%濃度的甲醇、乙醇的水溶液，于20-98'C溫度條件下提取瘤果黑種草籽，該提取物濃縮后以濃度0%_30%甲醇或乙醇溶解分散，再以有機溶劑如石油醚，己垸，庚垸，二氯甲烷，氯仿萃取，將萃取物濃縮干即得瘤果黑種草籽油。在傳統維吾爾醫學中，瘤果黑種草籽在維吾爾醫藥中，黑種草具有利尿、補腦、補腎、活血、解毒、下乳、通經、止咳、烏發、抗衰老等功效，是維吾爾醫學中一種習慣用藥，瘤果黑種草籽油目前被制成復方斯亞旦生發油、復方斯亞旦生發酊主要用于烏發和生發。到目前為止，關于瘤果黑種草的研究僅限于郝海峰、劉玉明、倪君君等先后從瘤果黑種草籽中分離得到了16個化合物，以及田澤等考察從其中分離得到的兩種常春藤皂苷的抗腫瘤活性，但對其降糖活性和抗氧化性的研究尚未見報道。參見附1為本發明免疫印跡方法分析過度表達PTP1B的CH0細胞中磷酸化AKT的電泳圖，其中l空白對照，2胰島素刺激后對照，3陽性對照，4測試樣品。具體實施方式實施例1取干燥瘤果黑種草籽(^z^e"a^朋^ii/kra)10Kg，利用常規的壓榨機壓榨的方法，得到瘤果黑種草油。實施例2取干燥的瘤果黑種草籽GVi《e7Ja^/a"^/h'/era尸rej7.)10Kg，粉碎后，利用石油醚常溫浸泡7天，過濾除去草籽，濾液利用旋轉蒸發儀，除去石油醚得到瘤果黑種草籽油。實施例3:取瘤果黑種草(WgeWa^a/^h'/kra/^re，.)的干燥種子200g，粉碎，置于2L具塞燒瓶，將燒瓶置超聲波提取儀，以石油醚室溫超聲提取3次，每次1.5L，每次浸提時間為0.5小時，合并提取液，過濾，于旋轉蒸發儀內減壓濃縮至干，得到油狀物75g。實施例4取瘤果黑種草(M>eWa^7朋oWj'/era尸re".)的干燥種子10Kg，粉碎，置于50L提取罐，以70%乙醇室溫冷浸提取4次，每次乙醇用量為30L，每次浸提時間為7天，合并提取液，于旋轉蒸發儀內減壓濃縮至干，加入10%的甲醇水溶液2L溶解，并以石油醚(60-90°C)萃取5次，每次2L，合并萃取液，于旋轉蒸發儀內減壓濃縮至干，得到油狀樣品3560g。實施例5取瘤果黑種草0V_z>eW<3^朋甴力'/era/^rejT7.)的干燥種子100g，粉碎，置于1L具塞燒瓶，將燒瓶置微波爐中，以95%乙醇微波輔助萃取3次，每次600mL，每次浸提時間為5min;合并提取液，過濾，于旋轉蒸發儀內減壓濃縮至干，得到油狀物18g。實施例6瘤果黑種草籽油作為制備治療抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑的藥物或保健品的用途的生物活性篩選篩選方法用對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)作為底物，以在陽性藥物釩酸鈉為對照，利用酶標儀進行PTP1B酶抑制劑的高通量篩選，根據PTPlB水解pNPP的磷酸基團而產生顏色反應來測定PTP1B的活性。酶反應體系組成如下緩沖液(50mMHEPES，pH7.3，100mM氯化鈉，0.1%牛血清白蛋白，and1mM二硫代蘇糖醇)，PTP1B融合蛋白，pNPP，PTPIB特異抑制劑釩酸鈉(100ug/mL)。反應體系混勻后在37t:放置30rnin，加入1M氫氧化鈉終止反應，置比色儀上測定405波長條件下的吸收值(A)，測定結果減去本底值后計算酶活性。篩選結果-.<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結論:從實驗結果表明，瘤果黑種草籽油具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制劑功效。免疫印跡實驗1)脂質體轉染倉鼠卵巢癌細胞(CHO)在傳代后在F12+10呢胎牛血清(FBS)培養基中培養30h后，按照Lipofectamine2000TM使用說明書上的方法將攜帶全長-PTP1B基因的pJ3H質粒DNA與脂質體混合后轉染進CHO細胞中，6小時后，除去含有脂質體的培養基換上F12+10%FBS培養基繼續培養過夜；2)給第一步中處理好的細胞更換含有測試樣品的F12+10%FBS培養基，3小時后加入適量的胰島素刺激5min，收獲細胞。在冰浴中，用細胞刮刮下細胞，收集細胞裂解液。3)電泳結束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數秒。取凝膠方法用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準全部棄去，下部以分子量標準最小分子帶下一點全部劃去，取一10ml注射器注滿轉印緩沖液，插入玻璃板與凝膠之間注水，使水的壓力將兩者自然分開,邊推邊進,反復多次注水,直至凝膠從玻璃板上滑落下來。打開電轉印夾，每側墊上一塊專用的用轉印液浸泡透的海面墊，再各放一塊轉印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與PVDF膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側濾紙上，最后將膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉印夾。電泳槽加滿電轉印液，插入電轉印夾，將電泳槽放入冰箱內(電轉印液之前要放入冰箱內預冷)，連接好電極，接通電流，轉印夾的膜應對電泳槽的正極。利用電轉儀將SDS-PAGE上的蛋白質轉移到膜上。條件400mAlh或280mA，1.5-2h;4)封閉在進行抗體雜交之前，需要先對轉印膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。①洗轉印膜室溫漂洗3次xl0min，以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。取漂洗的轉印膜，放入含5%脫脂奶粉的封閉液內，搖床震動，室溫封閉2h，也可在4。C過夜。③用緩沖液，PH7.6室溫漂洗3次xlOmin.5)抗體雜交抗體表面主要采用間接法。①封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液，封口，4"C孵育過夜或室溫(22-25°C)搖動孵育2h.②液洗膜3次xlOmin③加入二抗稀釋液，室溫lh，洗膜3xlOmin)6)檢測采用增強化學發光(ECL)檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學發光物質，生成一種不穩定的中間物質，其衰變時在暗室內形成明顯的肉眼可見的化學發光帶，利用X線膠片感光原理，將結果記錄下來:ECM顯色劑配制按lmlH20加顯色劑A、B各1滴，混勻。在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中，加上混合好的顯色液，約1-5分鐘用，紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液，將一透明的玻璃紙蓋住撫平，并確定干的表面與膠片接觸.將印跡膜在暗室中使膠片以確定所測抗原的正確暴光時間，暴光時間可短至幾秒也可以長到數小時.沖洗膠片步驟先在顯影液中沖洗至膠片上出現條帶或者膠片透明為止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。結果表明可以增加中細胞磷酸化AKT的含量，這使得瘤果黑種草籽油能通過PI3K/AKT途徑刺激GLUT4轉運，從而達到降低血糖的目的。實施例7:作為制備抗氧化藥物或保健品的用途功能以卵黃脂蛋白為底物的脂質過氧化模型反應包括1:25稀釋的卵黃懸液(卵黃用等體積的PH7.45，0.1M磷酸緩沖液(PBS)配成，用前磁力攪拌起攪拌10min)0.15mL，25mm硫酸亞鐵溶液0.15mL，最后，用PBS補足1.2mL，對照管中不加樣品，樣品體積用PBS補齊并提前加入2(mTCA溶液0.675mL，試驗開始后將上述兩種試管同時置于37。C的水浴中放置15min。取出后，藥品關加入20%TCA溶液0.675mL靜止10min后，轉移至1.5mL離心管中，7000rmp/min離心7-8min，取上清分別加入硫代巴比妥酸溶液(0.8%)0.5mL，混勻后，分為兩份，在沸水浴中放置15min，取出冷卻。以PBS溶液調零，721型分光光度計測定As32值，樣品的抗氧化程度用對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率表示A(W。二(對照管A碟值-樣品管As32值)/對照管A532值X100%濃^抑制率\樣品123456、100HgM86.787.986.286.286.787.9結果表明瘤果黑種草籽油具有抗脂質過氧化的能力。權利要求1、一種瘤果黑種草籽油作為制備治療抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑的藥物或保健品的用途。全文摘要本發明涉及瘤果黑種草籽油的藥物用途，該瘤果黑種草籽油是從維吾爾醫常用藥材--瘤果黑種草籽中采用常規壓榨或溶劑萃取后減壓除去溶劑得到的，通過體外實驗證實的它所具有的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制劑的效果以及抗脂質過氧化和清除氧自由基的功效。它形成的抗糖尿病藥物及抗氧化藥物及保健品的用途。文檔編號A61P3/00GK101129497SQ20071014749公開日2008年2月27日申請日期2007年9月17日優先權日2007年9月17日發明者信學雷,吳漢夔,阿吉艾克拜爾·艾薩,阿布力米提·伊力申請人:中國科學院新疆理化技術研究所