專利名稱：抵抗A組β溶血性鏈球菌的疫苗及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本申請人已進行一專利申請P10501290-2，其申請日為2006年3月24日，名稱為"抵 抗A組e溶血性鏈球菌的疫苗及其制備工藝"。本發明涉及一種新疫苗，其目的相同， 以及一獲得此新疫苗的新工藝。
背景技術：
在之前的專利申請P10501290-2中已經準確地描述抵抗e溶血性A組型鏈球菌 的疫苗。在此再次描述工藝狀態，既然本發明涉及相同的主題。如現有工藝所知， 風濕熱(RF)是一種疾病，其由A組e溶血性鏈球菌或釀膿鏈球菌所導致，此疾病 呈現于3至18歲的兒童中，那些兒童存在基因易感性因素和未治療兒童。疾病最初 顯現為多關節炎的臨床形式(大關節中的疼痛)，而后為包括兩種主要表面的臨床 條件西登哈姆氏舞蹈病和風濕性心肌炎。
舞蹈病呈現于約有20-30%的帶有風濕熱(RF)的患者中，受感染器官為中樞神 經系統(CNS)，癥狀轉化為無意識地運動、精神紊亂，這些癥狀經過充分地治療 癥狀會消失。
風濕性心臟病呈現于約30-45%有風濕熱(RF)的病人中，其特征在于最初在心 肌的嚴重心臟炎癥，在瓣膜組織中中產生嚴重的、累積的、固定的損害，主要影響 冠狀膜和大動脈膜，并觸發風濕性心臟疾病(RHD)。在更發展的階段的RHD治療 為外科手術上的。考慮到疾病的呈現年齡范圍，7至12歲的兒童，他們不得不頻繁 地接受瓣膜損害糾正手術，或者以生物假體代替瓣膜(Snitcowski,1996)。在巴西，卯％ 的兒童心臟手術是由風濕性瓣膜損害所引起的。
心臟手術在成人風濕個體中對應于此總數的30%(衛生部的數據，DATA-SUS)。 傳染病學風濕熱(RF)和慢性風濕心臟病(RHD)仍被認為是發展中國家和不發 達國家中的公眾健康問題。據估計，在世界上有超過5千萬的風濕熱的病例，根據 世界衛生組織(WHO)的最近數據，世界上有1.4千萬的慢性風濕心臟病(RHD) 的病例的記錄。在伊朗、泰國、中國、玻利維亞、巴基斯坦、印度、澳大利亞、阿
4根廷、埃及和摩洛哥等各個國家中，每IOOO個RF的兒童中，RHD患病率就高于多 于IO個兒童。
巴西每1000RF攜帶者中就有平均6.5個兒童RHD患者。更一步進地，在WHO (2004)的記錄中，每年有多于1.8千萬個鏈球菌病例，每年多于50萬人死于鏈球 菌。疾病的發病機理風濕熱(RF)被認為是自身免疫疾病，其來自于由抵抗A組
e溶血性鏈球菌或釀膿鏈球菌而觸發的防衛免疫反應，在一些個體中(易受疾病感
染的人)中，產生抵抗穿過生物免疫機構的生物體自身蛋白的攻擊性反應。
據當前所知，由T細胞淋巴球調節的抗體和免疫反應負責抵抗人類組織(心臟、 關節、腎、大腦)蛋白質的交叉反應(revisedby Cunningham, 2000; Guilherme et al,1995)。這此交叉反應的發生是由于氨基酸，特別是鏈球菌的M蛋白質，結構或殘 基的相似性。
19世紀80年代所分析和發表的M蛋白質序列(Manjula e Philipis, 1984, and Miller etal, 1998)，通過多個研究小組所發表的多個科學工作，在能夠觸發疾病區 域的知識方面取得了極大的進步。
M蛋白包括氨基酸殘基的重復區域，并再細分為一氨基末端部和一羧基末端部。 限定鏈球菌血清型的氨基酸的殘基位于在氨基末端部。羧基末端部完全地保存在不 同血清型中，且具有多次重復自己的氨基酸組。
描述氨基末端區域的多個片斷，因為其涉及在疾病的觸發(風濕熱和/或慢性風 濕心臟病)，尤其是通過心臟組織蛋白的交叉反應(revised by Cunningham, 2000 and Guilherme et al, 2005)。
值得注意的是，直到80年代，人們相信鏈球菌和人類組織蛋白質的交叉反應僅 來自于抗體調節免疫反應。從以CD4+T淋巴細胞(Raizadaetal， 1983, and Kemeny et al, 1989)主導的心臟組織的炎癥性滲入癥狀的描述，申請人證實心臟損害是由這些細 胞(CD4+T淋巴細胞)所調節的。通過探測由人類心臟組織碎片所分離蛋白質間的 交叉作用的免疫反應所限定的跡象，通過滲入由外科手術得到的攜帶RHD患者中心 臟損害的T淋巴細胞，糾正瓣膜損害(Guilherme etal, 1995)。而后，申請人描述大多 數單核細胞的癥狀，其在遭受風濕性心臟疾病的患者的心臟組織(心肌、冠狀和/或 主動脈瓣膜)中產生顯者的炎癥細胞因子(Y干擾素、IFNg、 a腫瘤壞死因子、TNFa)。 此工作的相關發現為觀察大量的細胞因子產生細胞的癥狀，其調節心肌的炎癥(白 細胞10和4、 IL-10和IL-4)，在瓣膜組織中稀有細胞產生IL-4調節細胞因子。此發現顯示為何后鏈狀球菌在約4個星期治愈，冠狀和/或主動脈瓣膜的損害低、漸進 的并固定的(Guilherme et al, 2004)。
考慮到風濕熱是自身免疫疾病，理解風濕熱的發病機理是其預防的基礎，因為
考慮產生抵抗致病因子的疫苗，a組e溶血鏈球茵(釀膿鏈球菌)，在不觸發自身
免疫疾病的意義上。已經具有多個抵抗A組e溶血鏈球茵的疫苗。
JamesB.Dale教授(田納西州大學研究基金會)進行研究以產生基于賦予鏈球菌特
殊性的M蛋白質殘基的氨基末端的序列。
他具有多個已發表工作(Beachey et al, 1987; Dale et al, 1993; Dale et Chang,
1995;Dale et al, 1999, a， b and c)，并且他已經分析在26種不同血清型動物模型中的
反應能力。
具有多個以他名義申請的專利，其中包括在1998年9月10申請、2004年4月 6日授權、專利號為6.716.433的美國專利(GROUP A STREPTOCOCCAL VACCINES)。
最近，研究小組發表第一階段工作，使用以包括06血清型的N基末端片斷的重 組體蛋白質形式的包括06不同血清型的疫苗構想。在人類組織切片上引導交叉反 應控制，僅評估人類響應(抗體調節)(Kotloff, 2004)。
產生多種疫苗以防止鏈球菌傳染釀膿鏈球菌的26血清型，進行第二階段的臨床 測試(McNeil et al， 2005)。
Vincent Fischetti教授(洛克菲勒大學)研究基于M蛋白質的羧基末端殘基的序 列的疫苗的產生。通過克隆將M6蛋白編成法典的基因，研究小組發現，56不同鏈 球菌血清型呈現羧基末端區域氨基酸序列的同族(Scottetal, 1985 e 1986)。
通過鼻內接種M6蛋白的羧基末端區域的縮氨酸于白兔，Fischetti教授的研究小 組展示改變A組鏈球菌的細菌定居的可能性(BessenetFischetti， 1988， a and b)。用與 合成縮氨酸共享序列共價相連且與亞單位的城巴霍亂毒素共軛的疫苗，其導致M蛋 白質的IgA型抗體特性的形成，并保持在小鼠血清和唾液中的活性。
在后來的工作中，創始人利用牛痘病毒做為帶菌者，包括M6蛋白質的C基端 部的總體序列，以產生W-M6疫苗的重組體，這表明一個單一的鼻腔劑量能防止異 源鏈球菌細菌定植。皮內免疫無效(Fischetti etal, 1985)。在上述模型中共軛和鼻腔使 用的牛痘病毒的高成本，限制這些模型作為一種安全、有效和可經濟有效獲得疫苗 的使用。以共生細菌作為載體的測試也被使用(Fischetti et al, 1993; Medaglini et al, 1995)。分析這種共生向量作為一種疫苗工具使用。
初步結果表明當在150個健康志愿者口服或鼻腔使用時，載體是安全的、耐受 性好的(Kotloff etal, 2005)。
具有多個以他名義申請的專利，其中包括在1995年1月6申請、2003年8月5 日授權、專利號為6.602.507的美國專利(SYNTHETIC PEPTIDES FROM STREPTOCOCCAL M PROTEIN AND VACCINES PREPARED THEREFROM) 。 C 基末端部疫苗構想表現在如何融合鏈球菌表面的蛋白質，目前正在進行第一階段的 臨床試驗(WHO, 2006)。
M.Good教授接近于使用C端部的縮氨酸作為在澳大利亞可用的疫苗模型，在澳 大利亞的土著人口中鏈球菌感染的和風濕熱的發病幾率高。澳大利亞研究人員認定 由C基端部的09氨基酸殘基構成的縮氨酸，能夠在免疫鼠中產生調節抗體。抗體還 存在于正常個體和風濕疾病的患者的血清中(Pruksakom et al, 1994, and Brandt et al, 1997)。
最近，研究小組一直致力于來自澳大利亞人中占多數的血清型的氨基末端部片 斷和羧基末端部片斷的結合，稱為J14 (Dunn etal, 2002; Olive etal, 2002)。
研究小組的最新成果顯示，J14 (29氨基酸殘余)片斷有利于保護抗體的發展， 能夠導致老鼠實驗模型的，抵抗來自澳大利亞的地方區域的分離地點的釀膿鏈球菌 的各種品種。這些動物的體內挑戰鞏固多個構想中J14縮氨酸的保護能力(Vohraet al, 2005; Batzloff et al, 2005; Olive et al, 2005)。

發明內容
本發明的目的是提供一種抵抗A組P溶血性鏈球菌的新疫苗，以及獲得此新疫 苗的新工藝，此后提供兩種模型，所提供的工藝為申請人在其前先專利申請PI 0501290-2所預計的獲得工藝的改進。


參考對以下附圖的詳細描述，有助于理解本發明的完整的價值和許多伴隨優點。 圖l所示為第一模型中所選殘基序列(第一構想)；以及 圖2所示為第二模型中所選殘基序列(第二構想)。
具體實施方式
本發明的目的為"抵抗A組e溶血性鏈球菌的新疫苗"，以及獲得所述新疫苗 的工藝，此后提供兩種模型，所提供的工藝為申請人在其前先專利申請P1 0501290-2 所預計的獲得工藝的改進。簡而言之，抗原B的序列的鑒定是通過分析在01氨基酸殘基中不同79合成縮 氨酸，每個血清620個體(健康人類和風濕熱的攜帶者)，抗原T次序地鑒定使用 258個體的外周血的單核細胞(健康人類和風濕熱的攜帶者)，測試抵抗M蛋白質 羧基末端部的38合成縮氨酸，選自由抗原B定義所測試79縮氨酸(Guilherme et al， 2006; Patent Application PI 0501290-2)。基于此專利，涉及兩個疫苗模型的構建，以合成縮氨酸形式和/或重組蛋白質形式，其包括1. 由156pb (相應于氨基酸的52殘基)合成的M蛋白質的羧基末端區域的T和 B表位，其考慮氨基酸的以下序列相應于T表位的22殘基，其后為B表位的8中 間殘基和22殘基，以及2. 由261pb (相應于氨基酸的87殘基)構成的M蛋白質的氨基末端區域的T和 B表位，其考慮氨基酸的以下序列相應于T表位的22殘基，其后為雜合T-B表位 的8中間殘基和B表位的22殘基。在第一模型中，疫苗作為合成縮氨酸和/或重組蛋白質包括M蛋白(Tl表位的 08中間殘基和B表位)的羧基末端區域的52氨基酸殘基的片斷。 所附圖1所示為此模型中所選殘基序列。在第二模型中，疫苗作為合成縮氨酸和/或重組蛋白質包括M蛋白質(T表位， 08中間殘基，雜合T-B， 08中間殘基和B表位)的羧基末端區域的87氨基酸殘基 的片斷。附圖2所示為此模型中所選殘基序列。來自M蛋白質的羧基末端區域的氨基酸的這些殘基能夠由抗體和TCD4+淋巴細 胞的調理產生響應，保護且不觸發自身免疫疾病。這些序列不同于先前用于疫苗的 制備序列，揭露如下James B. Dale使用各種血清型的氨基末端區域(美國第6.716.433號專利)。 Vincent A. Fischetti使用M6蛋白的羧基末端區域(美國第6.602.507號專利)。組成06組多肽。04組呈現與19氨基酸殘基的一致性，構成片斷包括申請人所選的 T禾口 B表位(Guilhe腸et al， 2006)。M. Good使用在澳大利亞土著中占優勢品種的氨基末端相連的羧基末端區域。 他展出與氨基酸的18殘基一致性，構成片斷包括申請人所選的T和B表位(Guilherme etal,2006),其中14殘基與V. A. Fischetti確認的M6蛋白的04組的構成一致。以下描述獲得新創疫苗的新工藝的步驟步驟l:克隆52和87氨基酸殘余的區域，以產生S因子的重組蛋白質； 步驟2:測試實驗室動物，優選的為老鼠；步驟3:安全測試測試動物和連續性的體外測試以防止自身免疫(細胞激增測 試和細胞因子測定)的連續性，通過使用T-細胞淋巴細胞系的疫苗表位，來自心肌 組織風濕性疾病攜帶者的手術片斷。現在所創的疫苗不同與現有的疫苗，其帶來與模型構造與關的優點，解釋如下保護表位的選擇的進行基于改變M5蛋白質的公開序列(Robinson etal, 1991)，用 于制備合成縮氨酸以評估病原性潛能(N基末端區域)(Guilherme et al 1995 and 2001) 表位和來自C基末端區域表位，能夠保護抵抗疾病，通過大量例子的體外測試評估 (620個體血清和258個體的T細胞淋巴細胞)(Guilherme etal, 2006)。使用帶有不同于01氨基酸殘基的20氨基酸殘基的79合成縮氨酸，進行掃描羧 基末端區域(240至350殘基)。此方法是帶有保護能力的區域的獨有的和允許的分 子定義(Guilherme etal， 2006，專利申請PI 0501290-2)。進行交叉作用測試，分析來自帶有RHD患者的心臟組織的20滲入淋巴細胞的 整體，其在進行糾正瓣膜損害的外科過程中獲得的，并如前所述地在體外展開 (Guilherme et al， 1995)。重組蛋白質的產生基于M5品種，由于合成縮氨酸所引導的研究是基于公開的 蛋白質序歹ll(Robinson et al, 1991)。參考文獻美國專利文獻US 6.602.507， 1995年1月6日申請并2003年8月5日授權； US 6.716.433， 1998年9月10日申請并2004年4月6日授權;US 6.358.704， 1999年1月28日申請并2002年3月19日授權。其它參考文獻1. 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權利要求
1、一種疫苗對A組的β溶血性鏈球菌，其特征在于，在第一模型中，片斷來自M蛋白質的羧基末端區域(表位T，08中間殘基和表位B)的氨基酸的52殘基，在第二模型中，片斷來自M蛋白質的羧基末端區域(表位T，08中間殘基，雜合T-B，08中間殘基和表位B)的氨基酸的87殘基，所述來自M蛋白質的羧基末端區域的氨基酸的殘基，能夠產生由抗體和TCD4+淋巴細胞調節和保護的免疫反應，此免疫反應不觸發自身免疫疾病。
2、 如權利要求1所述的疫苗對A組的e溶血性鏈球菌，其特征在于，預測M 蛋白質的羧基末端區域(52和87殘基)表位的連續分子識別，在01氨基酸殘基差 異，識別健康人類和風濕熱攜帶者的抗體和T淋巴細胞，能夠產生基于淋巴細胞的 抗體的保護反應。
3、 如權利要求l所述的疫苗對A組的e溶血性鏈球菌，其特征在于，在第一模 型中，M蛋白質的羧基末端區域(T和B表位)的選定殘基的序列為Lys-Gly-Leu-Arg-Arg-Asp-Leu-Asp-Ala-Ser-Glu-Arg-Ala-Lys網Lys-GIn-Leu-Glu-Al a-Glu-GIn-GIn-Lys-Leu-Glu-Glu-GIn-Asn-Lys-lle陽Ser-Glu-Ala-Ser-Arg-Lys陽Gly-Leu-Ar g-Arg-Asp-Leu-Asp-Ala-Ser陽Arg-Glu-Ala-Lys-Lys-GIn-Val.
4、 如權利要求l所述的疫苗對A組的e溶血性鏈球菌，其特征在于，在第二模 型中，M蛋白質的羧基末端區域(T和B表位)的選定殘基的序列為Lys-Gly-Leu-Arg-Arg-Asp-Leu-Asp-Ala-Ser-Glu-Arg-Ala-Lys陽Lys-GIn-Leu-Glu-Al a-Glu-His-GIn-Lys-Leu-Glu-Glu-GIn-Asn-Lys-lle-Ser-Glu-Ala-Ser陽Arg-Lys-Gly-Leu-Ar g-Arg-Asp-Leu-Asp-Ala-Ser陽Glu-Arg-Ala-Lys-Lys-GIn-Leu-Glu-Ala-Glu-GIn-Gln-Lys-L eu-Glu-Glu-Gln-Asn-Lys-lle-Ser陽Glu-Ala-Ser-Arg-Lys-Gly-Leu-Arg-Arg-Asp-Leu-Asp-Ala-Ser-Arg-Glu-Ala-Lys- Lys-GIn-Val.
5、 一種疫苗對A組的e溶血性鏈球菌的制備工藝，其特征在于，預測下述發展步驟步驟1:克隆包括表位T和B的156pb(52氨基酸殘基)和261pb (87氨基酸殘基)， 以生產重組蛋白質；步驟2:步驟2:測試實驗室動物，優選的為老鼠；步驟3:安全測試測試動物和體外測試以防止自身免疫(細胞激增測試和細胞因子測定)的連續性，通過使用T-細胞淋巴細胞系的疫苗表位，來自心肌組織風濕 性疾病攜帶者的手術片斷。
全文摘要
本發明提供一種抵抗A組β溶血性鏈球菌的疫苗及其制備工藝，其預測由克隆5δ基因產生重組蛋白質，其包括相應于52和/或87氨基酸殘基的寡核苷酸序列，表位連續分子識別后與M蛋白質羧基末端區域分離，在01氨基酸殘基不同，通過健康人類和風濕熱攜帶者的抗體和T淋巴細胞識別，能夠由基于T淋巴細胞的抗體產生保護反應，由所選表位的疾病的自身免疫發展的保護在體外評估，采用來自風濕熱的損害的患者的心臟組織的T淋巴細胞。
文檔編號A61K39/09GK101557822SQ200780043872
公開日2009年10月14日 申請日期2007年7月19日 優先權日2006年11月30日
發明者古林明·魯查·吉荷美, 芬荷·喬治·艾莉雅·卡麗 申請人:古林明·魯查·吉荷美;芬荷·喬治·艾莉雅·卡麗