專利名稱：：通過干細胞營養物進行的器官的形成和復壯以及酒精損傷的器官的再生的制作方法
技術領域：
：本發明總地說來涉及通過干細胞培養物進行的器官的形成和復壯(rejuvenation)以及酒精損傷的器官再生中的突破。已發現營養干細胞進行器官再生和預防酒精相關性疾病例如胎兒酒精綜合征(FAS)和肝硬化的新機制。已發現這些干細胞營養物正面影響皮膚、肝、大腦神經元、胰腺和胃腸道。相關領域的描述孕婦對酒精的消耗可引起胎兒酒精鐠系缺陷(fetalalcoholspectrumdefect,FASD)，是一種先天性疾病，其特征在于一系列發育性缺陷，包括神經的、顱面的、心臟的和四肢的畸形以及全身性(generalized)生長遲緩。FASD仍然是重大的臨床挑戰和重要的社會問題。盡管在描繪促成酒精誘導的出生缺陷的機制中已取得巨大進步，但我們的知識空白仍然存在；例如，為什么酒精優先在特定器官中誘導一系列缺陷以及為什么缺陷譜是可重現的和可預測的。酒精相關性先天缺陷(alcoholrelatedbirthdefect)僅在美國每天就產生大約IOO個智力低于平均IQ的嬰兒和許多具有畸形器官的嬰兒。在美國用于這些兒童的護理的費用維持在撥予衛生保健系統的據估IOO億美元的年度費用。胎兒酒精綜合征是用于描述一系列影響神經和心血管系統的發育性缺陷的術語。該綜合征還可導致生長遲緩、面部異常(facialabnormality)和降低的心理機能(loweredmentalfunctioning)。對于胎兒酒精綜合癥的嚴重度是至關重要的是消耗的酒精的量、消耗的持續時間和妊娠的時機(timingofthepregnancy)。例如，懷有一個月大胎兒的母親消耗的酒精可改變大腦的發育；在4至6周，可改變面部結構、心臟和視力。2至3個月進入胚胎發育，酒精消耗可導致額外指或趾(digit)的生長。消耗的酒精的量同樣重要。在錯誤的時間既使消耗相當于一份12盎司啤酒的量可破壞信號傳導通路并導致缺陷。增加胎兒暴露的酒精量導致的綜合征嚴重度的增加。發明概述胎兒酒精綜合征申請人已發現膽固醇的補充在暴露于酒精的斑馬魚胚胎中預防了胎兒酒精譜系缺陷。通過使用斑馬魚模型，申請人已發現酒精通過破壞稱為sonichedgehog(Shh)的至關重要的信號轉導分子的依賴于膽固醇的激活來干擾胚胎發育。對暴露于酒精的胚胎補充膽固醇恢復了分子通路的功能性和預防了此類缺陷的發生。斑馬魚中的酒精相關性缺陷由最低限度的酒精暴露(相當于120磅的婦女飲用一瓶12盎司的啤灑)引起。所述發現表明即使是少量的酒精對于孕婦也可能是不安全的，并且也顯示膽固醇的補充是預防胎兒酒精缺陷的有效方法。少量的酒精可干擾胎兒的生長，但加入的膽固醇可幫助預防大批由于酒精暴露導致的神經和身體缺陷。膽固醇對胎兒發育(fetaldevelopment)是如此重要以至于不具有足夠高的生理膽固醇水平的孕婦，即使在不消耗酒精的情況下亦處于產生具有發育問題的嬰兒的增加的風險中。酒精(即使以少量)阻止了膽固醇協調胚胎中參與調控細胞命運和器官發育的復雜的一系列事件的能力。鼓舞人心的是，給暴露于酒精的斑馬魚胚胎補充膽固醇可恢復正常發育。酒精干擾指導胎兒發育的精確地協調的生物化學信號傳導通路。膽固醇是控制組織發育的模式的單個通路所必需的，并且其易于受到酒精作用的影響。對胎兒酒精綜合征的分子基礎的該新的深入了解可具有深遠的含意并且提出新的產前保健，所迷產前保健可預防在懷孕期間由酒精消耗引起的發育性缺陷成體器官的復壯給酗酒者補充膽固醇可幫助減緩或預防酒精性肝病，甚至慢性酒精誘導的肝硬化(其特征在于瘢痕組織替換肝組織，從而導致肝功能的累進喪失)的發生。該發現為確保孕婦不應當使她們的膽固醇降得太低的當前實踐提供了進一步的支持。最近的研究發現，服用稱為他汀類藥物的降膽固醇藥的婦女處于生育出具有發育問題的嬰兒的更大風險中。該新概念，干細胞營養物和相關技術，對于即將來臨的數年中引領基于成體干細胞的醫療保健和臨床實踐也是具有重大意義的。用于成人保健的該公開的技術將在抗衰老、器官和組織的再生以及酒精相關性疾病的預防中具有重大影響。干細胞營養物是具有處方和非處方適用性的食品。因而市場通常是維生素補充劑目標為特定器官的補充劑營養食品添加劑具有多種遞送方法的處方藥物用于經歷懷孕的婦女的補充劑結合意在示例性和說明性但非限定范圍的系統、工具和方法描述和舉例說明下列實施方案和其方面。在不同的實施方案中，已減少或消除一個或多個上述問題，然而其他實施方案涉及其他的改進。除了上述示例性方面和實施方案外，通過參考附圖和通過研究下列描述，另外的方面和實施方案將變得明了。附圖的幾個示圖的概述本專利或申請文件包括至少一個彩色制作的附圖。在請求和支付必需的費用后將由官方提供具有彩色附圖的本專利或專利申請出版物的拷貝。圖1圖解例證酒精對胚胎的存活和表型的劑量依賴性作用。圖2顯示誘導與Hh-抑制的和膽固醇不足的胚胎的表型語相似的表型鐠的胎兒酒精暴露的作用的復印。圖3顯示酒精暴露通過減少Shh的翻譯后膽固醇修飾來抑制Hh-信號傳導。圖4圖解證明酒精暴露降低胚胎中的膽固醇水平。圖5顯示膽固醇補充劑拯救酒精誘導的胚胎缺陷圖6顯示窖蛋白-1和Shh在從大鼠肝星狀細胞系HSC8B分離的蛋白質裂解物中分布的Western印跡分析。圖7顯示證明由酒精暴露引起的窖蛋白-l中的Shh減少的免疫沉淀測定法。圖8顯示證明窖蛋白-1和Shh在肝星狀細胞中的共定位的免疫組織化學的復印。圖9顯示酒精擾亂Shh與窖蛋白-1在脂質筏(1ipidraft)中的共定位以及Shh在高爾基基細胞器中的積累的Western印跡分析。圖lO顯示酒精破壞Shh進入ER區室和在高爾基細胞器中積累的免疫組織化學分析。圖11證明酒精暴露破壞Shh分泌入細胞外基質。圖12顯示在轉基因斑馬魚的肝中特異性表達的GFP的融合熒光圖像。圖13顯示thru細胞流式計量術用于從LFABP-GFP肝分離GFP/Ptc+細胞。圖H顯示FGF/HGF肝誘導培養基中的培養的GFP/Ptc+細胞。圖15顯示GFP-P/Ptc+細胞整合入膽小管(bileductular)上皮細胞和肝細胞并且開始在預先損傷的肝中表達GFP。圖16顯示酒精破壞Shh蛋白在脂質筏中的共定位。圖17顯示酒精暴露在胚胎中破壞游離膽固醇/膽固醇平衡和轉運。圖18顯示表征酒精和膽固醇的特征(signature)的拉曼位移光譜分析。圖19顯示肝星狀細胞中的hedgehog活性。圖20是膽固醇衍生物組分預防發育性缺陷的圖解例證。圖21顯示證明膽固醇和膽固醇樣分子預防酒精誘導的胚胎發育性缺陷的復印。參照附圖的圖片舉例說明示例性實施方案。本文中公開的實施方案和圖片在被認為是舉例說明性的而非限定性的。發明詳述胚兒酒精綜合癥的膽固醇治療在本申請中，在原腸胚形成過程中，斑馬魚胚胎對低水平酒精的暴露阻止了通過膽固醇進行的Sonichedgehog的共價修飾。這導致受損的Hh信號轉導和導致與FASD極相似的永久性發育缺陷的劑量依賴性譜。此外，用膽固醇補充暴露于酒精的胚胎拯救了Shh信號轉導的損失，并且預防胚胎發生FASD樣形態缺陷。總的說來，至關重要的形態發生素(morphogen)中的簡單的翻譯后修飾缺陷可促成環境誘導的復雜先天性綜合征。對FASD發病機理的該深入了解可提出用于預防這些常見的先天性缺陷的新策略。翻譯后的蛋白質修飾在促進基因表達的信號轉導調控中起著重要的作用。通過磷酸化、乙?；蚣谆a生的蛋白質修飾在胚胎發生過程中幫助控制事件的適當時機(timing)和順序；因而，這些蛋白質的缺陷修飾可以是許多類型的先天性疾病發生的重要原因就不令人驚奇了。不斷積累的證據表明翻譯后脂質修飾對于調控蛋白質功能的重要性。一個實例是Sonichedgehog(Shh)的膽固醇和palinitoyl修飾，所述修飾指導該蛋白質的生物發生、細胞運輸和功能性1。Shh是通過激活Hedgehog(Hh)信號通路在細胞增殖、分化和胚模式形成(embryonicpatterning)中起著中心作用的高度保守的胚胎形態發生素23。45kDa的Shh前體蛋白通過自動加工(auto-processing)，然后通過將膽固醇共價連接至N末端蛋白水解產物來經歷修飾4。該成熟的經膽固醇修飾的蛋白質(19kDa)可被轉運至細胞膜以進行分泌5。分泌后，經膽固醇修飾的Shh配體可立即通過結合至其受體Patched(Ptc)而起始信號轉導。結合后，Ptc解除對信號轉導蛋白Smoothened(Smo)6的抑制，然后通過將它們與負調節劑Fused的抑制劑解偶聯來激活Gli轉錄因子7。Gli隨后被轉移至細胞核并且調控靶基因包括Ptc8、Glir其本身和A^i7.2的表達,在胚胎發生過程中，Shh在亨森氏結(Hensen'snode)、神經管的底板、心臟間充質(cardiacmesenchyme)、早期消化道內胚層、肢芽的后部以及在整個脊索中特異性表達。因為其為形態發生素，因此Shh也影響其產生位置遠側的組織的發育。Shh顯然是腹神經管1112、前-后肢軸(anterior-posteriorlimbaxis)"和腹體節"的模型形成的至關重要的誘導信號。在人中，一個由Shh或Hh信號傳導的其他組分的突變引起的嚴重表型是前腦無裂畸形(HPE)15,是一種其中胎兒前腦(前腦)不能分開以使形成兩側大腦半球的病癥。HPE也是人胚胎中和FASD的動物模型中的數個胎兒酒精謙系缺陷(FASD)15—2°中的一個極端表現。類似地，神經管的底板中Shh的產生調控位于基板上面的神經組分包括運動神經元的祖細胞的發育12'21。FASD患者展示延遲的運動發育和受損的精細運動技巧(fine-motorskill)和大運動技巧22。在具有FASD的人中多至89y。觀察到不同程度的運動遲緩23—25。事實上，FASD的診斷標準包括受損的精細運動技巧26。Shh也在神經嵴形態發生中具有已證明的作用"，并且FASD通常包括神經嵴源性結構中的缺陷。很清楚，受酒精暴露影響的組織和正確發育依賴于Shh信號轉導的那些組織之間存在明顯的交疊。通過膽固醇產生的Shh的翻譯后修飾4是個受到密切調控的過程，該過程是正在發育的胚胎中成熟Shh配體的轉運和濃度梯度的建立所必需的28。固醇和脂肪酸修飾的Shh蛋白形成可溶性的多聚體，其被包裝在微嚢中用于長距離轉運29。最近的工作已證明取決于此類修飾的存在或不存在，Shh蛋白質的活性和功能發生顯著的變化5。經膽固醇修飾的Still配體在胚胎發生的許多方面中所起的作用可解釋被干擾的膽固醇生物合成在動物發育中的一些致畸效應3°。相似的先天性缺陷發生在于懷孕期飲用酒精的婦女的后代中。胎兒對酒精的暴露的畸形形成后果是高度可變的，包括一系列稱為FASD的形態缺陷31。FASD的表型異常包括神經、顱面、心臟和肢體畸形，以及全身性生長缺陷和精神發育遲緩(mentalretardation)32。提出的由胎兒酒精暴露引起的出生缺陷譜系背后的機制包括細胞凋亡"、細胞粘附缺陷34、自由基的積累35、生長因子的失調38以及改變的視黃酸(retinoicacid)的生物合成"。一些簡單和基本問題已通過這些假說很好地解釋，例如，一次或至多數次社交性飲酒怎樣引起胎兒缺陷，酒精優先性地誘導靶向一些器官和組織而不是其他器官和組織的缺陷的原因，或FASD中看到的缺陷模式是可預測的和可重現的原因。酒精還可削弱脊索前板遷移"和破壞Spernann'sOrganizer39(在形成原腸胚中控制胚層的模式形成的信號傳導中心)的形成和功能；調控軸模式形成(axispatternformation)的特定機制需要高度進化保守的遺傳通路，所述遺傳通路牽涉轉錄調控線路和信號轉導通路,組織原(organizer)中包含的含有Shh的小嚢泡起始在發育過程中在胚胎模式形成中起著關鍵作用的信號轉導通路"。因此，在原腸胚形成過程中抑制Shh信號轉導的遺傳或環境因子可破壞胚胎的正確模式形成。有趣的是，在原腸胚形成"過程中暴露于酒精的胚胎具有與在Hh信號轉導42中具有缺陷的胚胎中發現的缺陷相似的缺陷。相似的表型在胚胎中發生，所述胚胎在固醇的動態平衡中具有遺傳缺陷例如Smith-Lemli-Opitz綜合征"(SLOS),或暴露于降膽固醇劑44'45。這些觀察表明FASD可由Shh的膽固醇修飾的依賴于酒精的抑制引起。許多遺傳病癥可導致膽固醇的生物合成、貯存以及運輸的異常調控。然而，乙醇的攝入可能遠非是破壞膽固醇動態平衡的一般機制。乙醇引起HMG-CoA還原酶活性的抑制，這導致細胞中游離膽固醇減少，以及循環膽固醇水平降低"—8。被灌注的大鼠肝的急性乙醇暴露導致肝勻漿和微粒體中膽固醇耗盡49。乙醇特異性抑制肝ACAT活性，這可導致用于LDLS中的轉運的膽固醇酯減少5°。因此，來自胚胎學、毒理學和分子生物學的證據表明FASD背后的畸形形成機制將酒精、膽固醇動態平衡、Shh信號傳到和功能性Shh的膽固醇修飾聯系在一起。幾個動物模型已用于研究FASD。對于酒精和發育研究，與昆蟲和嚙齒目動物模型相比，斑馬魚模型提供了許多有利方面斑馬魚尺寸很小，它們具有大量的后代，并且它們具有快速的胚胎發生。該模型已廣泛用于發育生物學、遺傳學、基因功能、信號轉導和高通量藥物篩選的研究中。所有這些特征使其成為描述酒精誘導的出生缺陷的分子基礎的理想模型。經顯示，在斑馬魚胚胎的早期發育過程中短暫的酒精暴露引起Hh信號轉導的劑量相關性抑制并且產生一系列永久性FASD樣缺陷。酒精誘導的對Hh通路活性的抑制伴隨著膽固醇動態平衡的酒精破壞和Shh配體的膽固醇-修飾減少。用膽固醇補充暴露于酒精的胚胎拯救了Shh信號轉導的喪失，并且預防胚胎發生FASD樣形態缺陷。材料和方法酒精、環杷明(cyclopamine)和AY-9944處理根據之前的報導改變胚胎酒精暴露38。將具有絨毛膜的胚胎暴露于胚胎培養中的6個不同濃度的酒精(例如，0、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0%(vv—1))。將密封在皮氏培養皿中的胚胎在dome期(即，受精后(hpf)4.25小時或30%的外包期(epibolystage))開始時暴露于酒精6小時，并且在28，5。C下進行溫育。接著立即進行酒精暴露，收獲胚胎以進行Hh通路活性、膽固醇含量或組織酒精濃度的分析。將剩余的胚胎進行洗滌，并在無酒精的配眼鏡中溫育。然后在受精后l、2或4天收獲胚胎以進行存活和表型分析。環杷明(ll-去氧介芬胺(deoxojervine))是通過作為smoothened蛋白的拮抗劑來抑制Hh信號轉導通路的天然化學物質。AY9944,反式-1，4雙-(2-二氯芐基氨甲基)二氫氯化環己烷通過抑制7-脫氫膽固醇還原酶阻止膽固醇合成。以與酒精相同的方式施用AY-9944(7.5jaM,Sigma-Aldrich)和環杷明(IO.0jaM，Calbiochenn)。處理后，洗滌胚胎，然后將其在正常培養基中溫育多至受精后第4天。阿辛藍(alcianblue)染色和免疫組織化學如之前所述進行骨骼結構的染色51。使用下列一抗(HybridomaBank,1:10):MF20進行免疫組織化學用來染色心肌和面肌，S46用于鑒定心室肌以及F59用于鑒定體節中的慢肌祖細胞(slowmuscleprogenitor)。二抗是綴合Alexa568的山羊抗小鼠IgG^和綴合Alexa488的山羊抗小鼠IgG2g(1:400，MolecularProbes)。固定胚胎并且對成像。膽固醇含量的測量在酒精暴露后，以一式兩份重復用氯仿-甲醇(2:1)從胚胎(n^14)提取月旨質。然后通過ArnplexRedCholesterolAssay試劑盒(Invitrogen)測量膽固醇含量。組織酒精濃度的測量在酒精暴露后，以一式三份重復將各處理組的胚胎(n-38)集中在一起。<吏用AlcoholTest試齊寸盒(DiagnosticChemicalsLimited)測定經處理的胚胎中的組織酒精濃度。RT-PCR和實時定量分析使用RNeasy試劑盒(Qiagen)從胚胎(n-10)提取總RNA。使用之前描述的引物(信息列于下表)進行RT-PCR52。引物信息表正向5'ACTCCACTCATGGCCGTTACG3pdhAY818346262反向5'TGGTTGACTCCCATCACAAAShhNM131063397正向5'TCTCGCATTAAGTGGCTGTG反向5'GC丁丁G丁AGGCGAGAGGTGTCPtcNM130988282正向5'CATCCCATTCAAGGAGAGGA反向5'TGAATGACCCGAGATGAACAGli1NM178296350正向反向5'GGGAGCGCCAATAATAATGA5'CATTGGCCTGAAGTGTTGAANkx2.2NM131422正向5'CGTATAGCGCCCAGTCTCTC219反向5'AGAAAGGGTCMGCTGCAAA免疫印跡法如之前所述51分離總細胞蛋白質并且使用Mem-PER(r)EukaryoUcMembraneProteinExtractionReagent試劑盒(PierceBiotechnology)分離細胞膜蛋白。然后通過12%Tris-HCISDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離Laemmli緩沖液中的蛋白質(40|ag)并且將其轉移至PVDF膜。封閉、洗滌膜，然后將其暴露于抗Shh(N-19,Catalognumber:sc-1194;稀釋1:2.500)和P-肌動蛋白(1:1.000)的一抗(SantaCruzBiotechnology)。使用抗山羊HRP抗體(1:10.000，Amersham)檢測信號。GLI-熒光素酶報告分子測定法在集中胚胎(n-15)的重復實驗中進行Gli-熒光素酶報告分子測定法。簡而言之，使用0.5nl的67/-^^-#乂^熒光素酶質粒(60ngnl—"和海腎(Renilla)熒光素酶質粒(60ngnl—\pRL-TK，Promega)顯孩i注射處于1-2細胞期的斑馬魚胚胎。通過使用Dual-LuciferaseReporterAssay系統(Promega)測定報告分子的活性。就轉染率將熒準化,膽固醇的顯微注射在使用或不使用兩種質粒的情況下用0.2nl的5jagyl—1(10pg)膽固醇(BioVisionInc.)顯微注射處于1-2細胞期的胚胎以進行Gli-熒光素酶報告分子測定。讓胚胎發育，然后如之前所述用酒精處理胚胎。在48hpf時，分析胚胎。結果酒精以劑量和時期特異性的方式產生致畸作用選擇斑馬魚模型來評估假說，因為其允許在良好界定的發育時幀developmentaltimeframe)中暴露于精確濃度的酒精。將斑馬魚胚胎在發育過程中的兩個不同的時間窗(timewindow)暴露于一系列酒精濃度(O、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0%v/v于胚胎培養基中)。第一暴露窗發生在1至2細胞期至受精后(hpf)3小時，第二暴露窗發生在嚢胚晚期(latebiastulastage)和原腸胚期期間的4.25和10.25hpf之間。在第一暴露窗期間對酒精的暴露幾乎是一致致命的。用最低酒精濃度(O.25%)處理的897個來自該時幀的胚胎中少于40%存活至48hpf。在第二暴露窗期間暴露于酒精的胚胎比在合子期(zygotestage)中暴露相同水平的酒精的胚胎具有好得多的存活率。在嚢胚晚期，暴露的胚胎的存活也是劑量依賴性的。例如，與在相同發育時幀中暴露于0.25%酒精6小時的897個胚胎中超過90%的存活率相比，在該時幀中暴露于3%的酒精的202個胚胎中有10%在48hpf存活。通過以三個分類(a)死亡、(b)具有異常表型的存活或(c)不具有異常表型的存活對酒精作用評分來在48hpf進行更詳細的分析。如圖1A中所示，在嚢胚晚期過程中，在48hpf時的表型取決于胚胎暴露的酒精的劑量。例如，在第二時間窗期間暴露于2%酒精的胚胎中84%存活通過48hpf并且展示異常形態學，雖然只有2.6%的活胚胎是表型正常的。(關于代表性缺陷的說明參見圖2)。該水平的暴露對于剩余的13%的胚胎是致命的。相反地，在第二暴露窗期間暴露于0.25%酒精的胚胎中18%是存活的并且在48hpf時具有最低的異常；大部分(72.3%)是活的并且具有正常表型，<10%不能存活至48hpf時間點。這些酒精誘導的表型的頻率已表征于表1中。表l酒精處理的胚胎中表型的頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>hpf)處理胚胎6小時，就HPE、獨眼和心臟水腫在48hpf時分析表型。通過阿辛藍染色在受精后第4天分析有缺陷的弓骨(archbone)和縮短的尾巴。b.獨眼表型包括完全和部分獨眼(其具有分離的但間距更靠近的眼睛)。如圖2中所示的，胎兒酒精暴露誘導與Hh-抑制的和膽固醇不足的胚胎的表型鐠相似的表型語。(a)不斷增加的酒精暴露引起顱至尾(cranial-to-caudal)的缺陷，包括2天的胚胎中的全身性生長遲緩，(b)酒精誘導HPE、獨眼、心包水肺(箭頭)和U-形體節，(c)4天大小的未處理的(野生型，Wt)、暴露于酒精的(2%)、經環杷明處理的(Cyc，Ioi，M)和AY-9944-處理(7.5uM)的胚胎的并列(SUe-by-side)比較顯示共有發育畸形，包括HPE和獨眼、顱面骨(craniofacialbone)(阿辛藍)/肌肉(箭頭，MF20,紅色)的發育不良以及心臟管不能成環(loop)(空心箭頭，nryocardium，MF20(紅色)，心室肌S46(綠色/黃色))。為了確保在我們的模型中看到的酒精誘導的形態學缺陷不僅僅反映對超生理濃度(supraphysiologicconcentration)的酒精的暴露，申請人在酒精暴露后測量了胎兒組織中的酒精濃度。，斑馬魚胚胎的組織酒精濃度相應于暴露的胚胎培養基中的酒精濃度0.25-2.0%，范圍是0.71-7,4mM或0.003-0.034gd1—1(圖1B)。可通過消耗一次或至多數社交飲酒在人類的血液中達到這些酒精濃度。如圖1中所示，將胚胎(n〉64)暴露于濃度不斷增加的酒精中，然后在48hpf時對其進行評估。將胚胎評分為活的/正常、活的/異常或死亡。這三個分類表示為各股(cohort)中胚胎總數的百分數。斑馬魚的組織酒精濃度與酒精暴露的水平相關。通常，酒精濃度在0.71-7.4raM或0.003-0.034gdl)的范圍內。誤差才奉(Errorbar)表示三個實驗(n-38條魚/組)的l標準誤差(s.e.m.)。由胎兒酒精暴露誘導的形態缺陷概括了因HH信號轉導缺陷導致的發育異常斑馬魚胚胎中的酒精誘導的缺陷概括了在胎兒酒精暴露后在其他物種中發生的酒精誘導的缺陷。在原腸胚形成過程中以劑量依賴性的方式進行6小時的短暫酒精暴露導致隨后的永久性表形異常，然而只觀察到胚胎的死亡率的適度增加(圖1A)。在48hpf時，累積的顱至尾(cranial-to-caudal)表型在原腸胚形成過程中短暫地暴露于酒精的胚中非常明顯(圖2)。這些胚胎生長遲緩(圖2A)，并且展示劑量依賴性的表型語，包括神經、顱面、心臟和體軸的缺陷。暴露于高酒精濃度的胚胎具有明顯的HPE、獨眼(完全或部分的)、心包水腫、U形體節和嚴重地按透視法縮短的(foreshortened)尾巴(圖2A和2B)。在原腸(胚)形成過程中經酒精處理的胚胎和用環杷明、Hh信號傳導的特異性抑制劑或AY-9944(膽固醇生物合成和轉運的抑制劑)短暫處理的胚胎之間進行的比較顯示來自所有3組的胚胎都具有HPE和部分獨眼，以及顱面和肌肉發育不良并且心臟管不能成環(圖2C)。這些觀察支持有缺陷的Shh信號傳導在FASD的發病機理中的作用并且與酒精通過干擾已切割的19kDa蛋白質的膽固醇修飾來抑制Shh活性的可能性相符。酒精破壞SHH通路活性而不顯著改變SHH蛋白的表達，但確實減少經膽固醇修飾的SHH的水平為了對此進行進一步研究，直接通過檢查發育中的胚胎來測量Shh信號轉導活性，所述胚胎在l-2細胞期用Shh應答的、Gli-BS熒光素酶報告分子構建體進行顯微注射"。在酒精暴露后，熒光素酶的活性(圖3A)和Shh調控的基因例如Ptc、Glil和A^;r么2(圖3B)的表達都以劑量相關的方式減少。實時定量PCR分析確認了存在關于^力靶基因表達的酒精誘導的抑制的閣值。雖然對非常低的酒精濃度(0.25。/。)的暴露沒有引起Ptc或Glil的表達的顯著變化，但在這些條件下y^r義2的表達減少大約50%。響應0.5°/。酒精處理，這三個Shh耙基因的表達下降1.3至1.9倍，1.0至2.0%范圍的酒精濃度引起這些基因的表達下降5至17倍(圖3C)。與通過RT-PCR獲得的結果相反，實時定量PCR顯示，當將胚胎暴露于高于1.0%的酒精濃度時Shh的轉錄減少。值得注意的是，盡管來自完整細胞裂解物(細胞溶質的和膜的)的Shh蛋白的水平相對穩定，但發生Shh信號傳導的抑制。然而，Shh信號傳導的抑制與來自從FASD胚胎分離的細胞膜蛋白級分的Shh的進行性丟失相關(圖3D)。鑒于Shh必須由膽固醇共價修飾而錨定在質膜中，這些結果表明在酒精處理的胚胎中可使Shh的膽固醇修飾削減。'酒精暴露通過減少Shh的翻譯后膽固醇修飾來抑制Hh信號傳導。(a)如圖3中所看到的，Hh應答性Gli-熒光素酶活性(通過海腎焚光素酶進行標準化的)在暴露于酒精中的胚胎中以劑量相關性的方式減少。誤差棒標示4個重復實驗的1s.e.m，(b)酒精暴露后，Shh和其靶基因Ptc、Glil和^i^么2以及W/^7管家基因的基因表達水平的RT-PCR分析，(c)通過實時RT-PCR進行的Shh和其乾基因的半定量表達分析，將數據對W戶/W的內部對照進行標準化。(d)來自暴露于酒精的胚胎的Shh蛋白的總級分(細胞溶質的和膜的)和膜級分的Western印跡分析。p-肌動蛋白用作上樣對照。酒精處理改變膽固醇的動態平衡和減少的膽固醇酯含量如圖3中所示，在嚢胚晚期中進行的酒精暴露引起膜結合的Shh的劑量依賴性減少。鑒于膽固醇對Shh的脂化作用驅動其膜定位，這些結果也表明酒精暴露減少了膽固醇脂的形成。申請人通過測量完整胚胎提取物中的膽固醇水平測試了酒精暴露在原腸胚形成過程中是否削減總的固醇動態平衡。酒精暴露以與劑量相關性的方式導致胚胎的總膽固醇含量減少(圖4)。如圖4中所看到的，酒精暴露減少了胚胎中的膽固醇水平。暴露于酒精的胚胎中的總膽固醇和膽固醇酯水平以劑量相關性方式減少。誤差棒表示1s.d。這主要歸因于總膽固醇酯的減少，該總膽固醇酯的減少與經膽固醇修飾的Shh蛋白和Shh信號傳導活性的劑量依賴性減少(圖2A和2B)相伴并且與酒精誘導的形態缺陷的劑量依賴性獲得相關(圖2C)劑量越高，則缺陷越嚴重和范圍越大。與AY-9944降低膽固醇和產生相似的缺陷的證據一起，我們的發現表明酒精干擾膽固醇動態平衡以及膽固醇貯存的耗盡導致削減的Shh的膽固醇修飾，從而導致減少的Shh信號傳導，這引起了FASD樣表型。酒精暴露減少胚胎中的膽固醇水平。暴露于酒精的胚胎中總膽固醇和膽固醇酯水平以劑量相關性方式減少。膽固醇的補充拯救由酒精引起的HH信號傳導缺陷并且預防胎兒酒精誘導的發育性缺陷為了確認FASD的該潛在的分子機制的重要性，申請人在暴露于酒精的胚胎中進行拯救實驗。將補充的膽固醇、Gli-BS-熒火蟲熒光素酶質粒和海腎熒光素酶質粒共同顯微注射入處于1-2細胞期的胚胎，然后在原腸胚形成過程中用不同的酒精濃度處理所述胚胎。隨后的研究顯示Gli-BS報告分子活性在補充了膽固醇的胚胎中所有劑量的酒精暴露上得到保持(圖5A)。為了確定Shh活性的恢復是否導致依賴于Hh的細胞分化的拯救，申請人使用特異性鑒定此類祖細胞的F59抗體研究體節42中的慢肌祖(slowmusclepioneer,MP)細胞54。在未處理的胚胎中，在48hpf時，申請人觀察到MP纖維的經組織的V形模式，每體節對大約20根纖維。5。/。DMS0(溶解膽固醇的媒介物)的顯微注射對斑馬魚的發育沒有不良作用。相反，暴露于酒精的胚胎在此時具有紊亂的的、彌散的MP纖維模式。補充有膽固醇的、暴露于酒精的胚胎具有與未處理的野生型胚胎相似數目和模式的MP纖維(圖5B)。此外，大部分(94.8%)補充有膽固醇的、暴露于酒精的胚胎(11=58)總體上表現正常，與83.3%的具有FASD樣表型(圖5C)的暴露于酒精的、未進行補充的胚胎(n-96)不同。因此，膽固醇的補充拯救了酒精抑制的Shh信號傳導，并且在分子、細胞和發育水平上預防了酒精誘導的缺陷。膽固醇的補充拯救了酒精誘導的缺陷。(a)在使用膽固醇補充的暴露于酒精的胚中，拯救Hh應答性Gli-BS-熒光素酶報告分子活性(通過海腎熒光素酶進行標準化的)。誤差棒表示11個重復實驗的1s.e.m。(b)顯示未處理的胚胎On)、暴露于酒精的胚胎(2%)以及補充有膽固醇(IOpg)的、暴露于酒精(2%)的胚胎。慢肌纖維(綠色)的F"染色。(c)在48hpf時的斑馬魚胚的側面圖顯示補充有膽固醇的、暴露于酒精的胚胎的形態拯救。討論在許多之前的研究中，研究者已使用斑馬魚來測定對發育的酒精相關性作用55—59。申請人通過使用該模型來擴展這些研究，從而鑒定了新的分子機制，所述分子機制可能促成酒精的致畸效應，即酒精誘導的對Sbh的膽固醇修飾的抑制，其隨后抑制Shh信號轉導；該通路的抑制似乎在FASD發病機理的發生中起著關鍵作用。由于斑馬魚缺乏胎盤和在子宮外發育，并且在胚胎中的乙醇脫氫酶6°'"在暴露于酒精時(即從4至10hpf)未表達，因而，通過乙醇的氧化產生的代謝產物不可能是誘導的表型的主要原因。即使在非常低的組織濃度，酒精(而非來自母體來源或胚胎的酒精代謝產物)可直接引起發育性缺陷。直接測量測定了在我們的實驗條件下胎兒組織中的從0.n至7.4mM或0.003至0.034gdf的酒精濃度范圍。這些酒精濃度比在小鼠中誘導FASD的血液酒精水平"低大約5.9至123倍；這些濃度也比誘導細胞凋亡"和視黃酸不足"或對生長因子具有拮抗效應36的酒精濃度低4.2至153倍。因此，相對低的胎兒組織酒精濃度也可誘導FASD樣缺陷。在消耗一次12盎司的嘩酒后，在55-kg女性中獲得該范圍內的血液酒精濃度。這可解釋酒精是造成人先天性缺陷的最普遍的致畸因子的原因，并且表明在懷孕期間不存在安全的酒精消耗水平。胎兒酒精暴露削減了hedgehog膽固醇修飾和信號傳導。斑馬魚中由酒精誘導的形態學表型概括了在其他物種中看到的FASD的缺陷。例如，也在具有FASD的人胚胎中報導了相似的缺陷"'"，84%的小頭畸形(microcephaly)、25%的眼問題、29%的心臟發育性缺陷、關于軀干肌肉和骨錄的不同問題包括58%的木>弛肌肉(slackmuscle)、20%的吞咽/喂養問題、9%的臀部畸形、30%的雞胸(pidgeonchest)、7%的漏斗胸(concavechest)以及44%的spinaldimple。FASD患者還具有顱面異常例如面部異常(95%)、過小牙(16%)、裂腭(7%)和總體生長遲緩(98%)。因此，申請人已在斑馬魚胚胎中觀察到的與乙醇相關的發育性缺陷似乎恰好與在具有FAS的人中觀察到的發育性缺陷相吻合。在此處和其他地方呈現的證據3M5—致證明胎兒酒精暴露抑制Shh應答基因的轉錄。值得注意的是，申請人發現斑馬魚胚胎組織中的總Shh蛋白水平未受到任何受試酒精暴露的顯著改變。然而，經處理的胚胎展示FASD樣表型和不成對的Hh信號轉導，這表明有缺陷的Shh信號傳導在由酒精誘導的形態缺陷中是至關重要的因素。此外，申請人:現已顯示Shh信號轉導中的缺陷是由于Shh的翻譯后膽固醇修飾的破壞引起的。這些發現有助于解釋單獨的W力mRNA過度表達與拯救酒精誘導的形態缺陷或Shh應答基因的表達的減少不一致的原因38，65在本文中，申請人觀察到補充簡單的化學物質膽固醇拯救了酒精抑制的Hh信號轉導和預防胚胎產生FASD樣形態缺陷。最近，顯示固醇通過Smo直接激活Shh信號傳導通路。膽固醇或某些氧代固醇(oxyterol)用作Smo拮抗劑"。該證據表明膽固醇還可直接刺激Smo以起始Shh信號轉導，繞開所述通路并且拯救酒精誘導的依賴于Shh的發育。有趣地，確定拯救暴露于酒精的胚胎的相同膽固醇補充策略是否可以保護胚胎免受由其他環境因子(所述因子在Shh信號轉導中誘導與膽固醇相關的缺陷)引起的畸形形成性。成熟的Shh肽是雙重脂質修飾的，其在其C端具有膽固醇部分4并且在N端的Cys-24上具有棕櫚酸酯附著"。N末端脂質是誘導腹前腦神經元(ventralforebrainneuron)的分化所必需的6S。相反地，在N-脂質不存在的情況下，包含C末端脂質的Shh足以誘導小鼠指(趾)加倍69。已產生其中Shh缺乏膽固醇修飾、缺乏棕櫚?；蛉狈煞N類型的脂質修飾的小鼠突變體。這些突變體的功能分析清楚地表明兩種類型的脂質修飾是在早期發育過程中調節Shh形態發生素梯度的范圍和形狀所必需的7°'71。關于未來的方向，仍然要確定膽固醇修飾中的酒精誘導的缺陷是否影響N末端棕櫚?；蛑|我中Shh的細胞運輸，或是否影響Shh對Ptc的結合親和力或甚至Shh的梯度形狀和含量?？偟恼f來，申請人已顯示關鍵的形態發生素的簡單的翻譯后修飾缺陷導致復雜的先天性疾病。對FASD的分子基礎的該新的了解具有深遠的含意，并且提出可預防FASD發育性缺陷的新型產前干預。窖蛋白-1與SHH結合從而形成蛋白質復合物申請人:已觀察到酒精暴露導致有缺陷的Shh-膽固醇修飾和消減與質膜結合的Shh的增加，這表明酒精引起該配體的細胞內轉運中的缺陷(Li，2007)。為了獲得關于Shh在細胞內分布的詳細信息，和作為針對確定Shh細胞內運輸背后的機制的第一步驟，申請人使用非離子型去污劑蛋白質提取法和密度梯度超速離心來分級(fractionalize)和分離細胞蛋白質。在超速離心后，申請人從最低密度(在離心管的頂部)至最高密度(在管的底部)收集了17個單獨的梯度級分(各級分包含500pl)。脂質筏蛋白質的分布主要局限在級分4至11，如通過與脂質我結合的蛋白質窖蛋白-1的存在所顯示的(圖6A，最下部的圖框)。申請人還發現Shh的分布局限在級分6至1*7;Shh與窖蛋白-1共定位在通過密度梯度超速離心產生的級分6至11中(圖6A，最上方的圖框)。圖6顯示窖蛋白-1和Shh在從大鼠肝星狀細胞系HSC8B(A)分離的蛋白質裂解物的密度梯度超速離心級分中的分布的代表性western印跡分析。免疫沉淀測定法顯示Shh和窖蛋白-l在物理上相互作用，從而形成蛋白質復合物(B，C)。將等量的細胞裂解物用于免疫沉淀測定，然后使用抗窖蛋白-1抗體(B，最上方的圖框，泳道2)或抗Shh抗體(C最上方的圖框，泳道2)通過Western印跡分析來確認靶蛋白質的表達水平。在抗窖蛋白-1抗體和抗Shh抗體的免疫沉淀中但未在IgG陰性對照沉淀(泳道1，中間和最下方的B和C)中檢測到窖蛋白-1(B，中間的圖框和B最下的圖框)和Shh(B最下方的圖框和C中間的圖框)。Shh和窖蛋白-l在密度梯度中的物理共定位可暗示著這兩種蛋白質具有相似的物理特征或它們在功能上相互作用，然而，這不一定表示它們之間的直接的物理相互作用。因為窖蛋白-1在蛋白質和膽固醇轉運和運輸中起著重要作用，因而窖蛋白-1和Shh之間的直接相互作用具有誘人的可能性。為了確立這些蛋白質是否物理上相互作用以形成蛋白質復合物，申請人對從大鼠肝星狀細胞系HSC8B(其表達高水平的Shh)分離的總蛋白質進行了一系列免疫沉淀測定。為了確定這兩種蛋白質之間是否存在直接的物理相互作用，申請人在HSC8B細胞裂解物的免疫沉淀測定中使用抗窖蛋白-1抗體，然后使用抗窖蛋白-1和抗Shh抗體進行Western印跡分析。申請人使用抗窖蛋白-1抗體驗證沉淀的蛋白質的等量上樣(圖6A，最上方的圖框)。如所預期的，抗窖蛋白-1抗體沉淀22kDa的窖蛋白-1蛋白(圖6B，中間的圖框，泳道2)。此外，其沉淀成熟的20kDa的Shh配體(圖6B，最下方的圖框，泳道2)，從而表明窖蛋白-1在物理上與Shh結合。在陰性對照中，IgG抗體不能沉淀窖蛋白-1或Shh(圖6，泳道1，中間或最下方的圖框)。此外，申請人通過在HSC8B細胞裂解物的免疫沉淀測定中使用抗Shh抗體來驗證這兩種蛋白質之間的相互作用。用于本實驗的條件平行于用于之前的免疫沉淀測定的條件；在該情況下，使用抗Shh抗體驗證相等的蛋白質上樣(圖6C，最上方的圖框)。申請人發現Shh(圖6C，中間的圖框)和窖蛋白-l(圖6C，最下方的圖框)兩者都被抗Shh抗體從HSC8B細胞裂解物免疫沉淀出來?？筍hh和抗窖蛋白-1抗體各自從HSC8B細胞裂解物中共沉淀窖蛋白-1和Shh的事實強有力地表明窖蛋白-1與Shh相互作用，從而在該產生Shh的細胞系中形成蛋白質復合物。酒精特異性減少窖蛋白-1/SHH復合物在脂質筏中的形成觀察到Shh直接與脂質筏蛋白窖蛋白-1的相互作用，從而產生了關于之前的工作的有趣問題，在所述之前的工作中，申請人顯示酒精的暴露不影響總的Shh水平，但相反地通過引起細胞質膜上經膽固醇修飾的、成熟的Shh配體的濃度的劑量依賴性減少來導致有缺陷的Hh信號轉導(Li，2007)。為了確定與質膜結合的Shh配體的這種減少是否與脂質我微域(lipidraftmicrodomain)中窖蛋白-1和Shh之間的相互作用特異性地相關，申請人研究了酒精暴露對窖蛋白-1和Shh在密度梯度級分中的共定位的影響。首先，如圖6中所示，通過密度梯度超速離心分級通過抗非離子型去垢劑的細胞提取術分離的細胞蛋白質。如通過窖蛋白-1的存在所指示的，與脂質筏結合的蛋白質存在于級分4至11中(圖6A，中間的圖框和圖9A，第二圖框)；申請人特別地將包含脂質筏結合的蛋白質的級分(級分7-9)用于使用抗窖蛋白-l抗體的免疫沉淀測定。在蛋白質提取和密度梯度超速離心之前，將HSC8B細胞暴露于不同濃度的酒精(O、0.3、0.5、0.6和0.8%w/v，相應于0、55、81、109和136mM)以2小時。將來自密度梯度的級分7至9集中并用于免疫沉淀測定法。通過使用抗窖蛋白-1抗體的Western印跡分析驗證用于這些測定法的蛋白質的等量上樣(圖7A)。在這些免疫沉淀測定法中，申請人測定了在包含窖蛋白-1的脂質徙級分(級分7-9)中發現的Shh的量以酒精的劑量依賴性的方式減少(圖7C);酒精處理不影響脂質筏級分中窖蛋白-1的量(圖7B)。用于陰性對照免疫測定法的IgG抗體不沉淀窖蛋白-l或Shh。在圖7中，免疫沉淀測定法證明酒精暴露減少位于脂質莪級分中的窖蛋白-1/Shh復合物中的Shh的量。通過使用抗非離子型去垢劑的蛋白質提取術，然后進行蔗糖梯度離心，從用不同酒精濃度(酒精濃度w/v:0.3%、0.5%、0.6%和0.8%，進行2小時)處理的HSC8B細胞和從未處理的細胞中分離脂質我和它們的結合的蛋白質。抗窖蛋白-1抗體用于從脂質筏制劑免疫沉淀蛋白質；通過使用抗窖蛋白-1抗體(A)的Western印跡分析確保蛋白質的量相等，并使用抗窖蛋白-1(B)或抗Shh抗體(C)探測免疫沉淀。脂質筏中窖蛋白-1蛋白的量不受酒精暴露的影響(B);然而，酒精暴露以劑量依賴性方式減少與窖蛋白-1結合的Shh的量(C)。我們還使用免疫組織化學評估酒精對窖蛋白-l/Shh復合物形成的作用。在圖8中，免疫組織化學揭示了窖蛋白-1和Shh的共定位。在未處理的肝星狀細胞中，窖蛋白-l(A，綠色)和Shh(B,紅色)在細胞質，特別地在細胞質膜(C，黃色，由箭頭標示)中共定位。當將細胞暴露于0.6%(w/v)酒精以30分鐘時，Shh水平不受影響；然而，與窖蛋白-l在質膜上共定位的Shh的量顯著減少。使用抗窖蛋白-l抗體(圖8A，綠色)和抗Shh抗體(圖8B,紅色)雙標記的HSC8B細胞揭示Shh和窖蛋白-1在細胞質，特別地在質膜(圖8C，由箭頭標示的黃色)中的點狀的、黑白混合式的(salt-and-pepper)共定位分布。HSC8B細胞對0.4%(w/v)(圖8D-F)和0.8%(w/v)(圖8G-I)酒精暴露30分鐘在窖蛋白-1(圖8D和8G，綠色)或Shh(圖8E和8H，紅色)水平上不產生顯著的變化；然而，點狀共定位的顆粒的量以酒精劑量依賴性方式顯著減少，在高酒精濃度(圖8F和8I，黃色)下幾乎從細胞質膜消失。生物化學和免疫組織化學分析都指示窖蛋白-1和Shh形成了蛋白質復合物，以及顯示該復合物在質膜中的脂質筏區域累積。酒精暴露破壞窖蛋白-l/Shh復合物的形成，從而導致Shh在質膜，特別地在脂質筏結構中的水平減少。這些觀察表明酒精暴露引起Shh配體的分泌和轉運的缺陷。酒精暴露引起SHH至ER內的有缺陷的轉運并且導致在高爾基體區室中的積累為了開始描繪酒精對產生配體的細胞中的Shh轉運的有害作用背后的詳細分子機制，申請人首先將Shh在通過密度梯度超速離心分級的細胞蛋白質之間的分布與脂質筏(窖蛋白-l)以及高爾基體和ER區室的標記物的分布相比較。在圖9中，酒精破壞Shh與窖蛋白-l在脂質筏中的共定位，并且引起Shh在高爾基細胞器中積累。為了幫助分析Shh的分布，通過密度梯度超速離心分級分離細胞蛋白質；將其分布與脂質筏蛋白質(窖蛋白-l)、ER和高爾基體區室的標記物的分布相比較。在未處理的細胞中，Western印跡分析表明Shh蛋白位于密度梯度級分7至17中(圖4A，最上方的圖框)；如通過窖蛋白-1的存在所指示的，級分7至11包含脂質筏級分(圖4A，中間的圖框)；如通過高爾基體的標記物的存在所指示的，級分l2至17相應于高爾基體/ER區室(圖4A，第三圖框)。在暴露于0.8%w/v酒精以30分鐘的HSC8B細胞中，Shh的分布移出窖蛋白-l/脂質筏和光滑ER級分，并且被限制至密度梯度級分12至17，所述級分相應于與高爾基體結合的蛋白質和粗面ER級分(圖4B,最上方的圖框)。在從未暴露于酒精的細胞分離的蛋白質提取物中，Western印跡分析顯示Shh廣泛地分布在從級分7至17的密度梯度中(圖9A，最上方的圖框)；在這些提取物中，與脂質筏結合的蛋白質分布在級分7至11中，如通過窖蛋白-1(圖9A，第二圖框)的存在所指示的。與高爾基體結合的蛋白質存在于級分12至17(圖9A,第三圖框)中；并且與內質網結合的蛋白質位于6至9和16以及17(圖9A,最下方的圖框)的級分中，如通過特定的高爾基體/ER標記物的存在所證明的。在從暴露于0.6。/。酒精(w/v，109mM)以30分鐘的HSC8B細胞分離的蛋白質提取物中，Shh的密度梯度分布限制在級分12至17中(圖9B，最上方的圖框)；這些級分包含與高爾基體和粗面ER(圖9B，第三圖框)結合的蛋白質，從而表明酒精暴露使Shh的分布移出包含脂質筏的級分(圖9B，中間的圖框)和光滑ER區室級分(圖9B，最下方的圖框)。在圖10中，顯示酒精破壞Shh進入ER區室并且引起Shh在高爾基細胞器中積累。制備細胞以用于通過使用抗Shh抗體和抗ER或抗高爾基體的標記物的抗體或兩者共染色進行的免疫組織化學分析。在未處理的細胞中，ER的標記物(PID)(A，綠色)和Shh(B,紅色)以點狀顆粒(C，黃色)的形式共定位在細胞質中。然而，在暴露于0.6%(w/v)酒精以1小時的細胞中，雖然ER標記物(D，綠色)和Shh(E,紅色)的表達水平未改變，但未檢測到Shh的點狀、極性的分布模式；取而代之，申請人觀察到Shh(E和F)的擴散的均勻分布。G-I:無酒精暴露；J-L:0.6%(W/V)的酒精暴露以1小時。H和K:抗Shh抗體染色(紅色)；G和J:抗高爾基體的標記物抗體染色(綠色)和I，L:融合的相應圖像(黃色)。酒精處理不影響Shh的表達水平或其在高爾基體區室中的分布。為了進一步闡明酒精暴露引起的Shh分泌中的缺陷，申請人使用共聚焦顯微鏡檢查用抗Shh抗體和抗高爾基體或ER區室的標記物的抗體染色的細胞。在未處理的細胞中，ER標記物(使用抗PID抗體鑒定的)(圖IOA，綠色)和Shh(圖IOB，紅色)以點狀顆粒(圖IOC，黃色)的形式共定位在細胞質中；然而，當將HSC8B細胞暴露于0.6%(w/v)酒精以1小時時，雖然ER標記物(圖IOD，綠色)和Shh(圖IOE，紅色)水平未受到顯著影響，但不是點狀的極性分布模式，申請人觀察到Shh的擴散的均勻分布模式(圖IOF)。在相同實驗條件下，申請人通過重疊相應的圖像(圖101和IOJ，綠色)來確定Shh(圖10E和10K,紅色)和高爾基體的標記物(圖IOG和IOL，黃色)是否共定位，并且發現酒精處理不顯著改變Shh在高爾基體區室中的分布。因而，Shh在高爾體中積累而不特定地進入光滑ER區室的觀察表明由酒精暴露引起的Shh轉運中的主要缺陷發生在高爾體與光滑ER區室之間的運輸中。之前，申請人證明酒精暴露抑制通過膽固醇進行的對Shh的翻譯后修飾，減少了與細胞膜結合的成熟Shh配體的量，從而在我們的斑馬魚模型中導致一系列缺陷，其表型模擬在患有胎兒酒精綜合征的患者中觀察到的缺陷(Li，2007)。在本研究中，申請人已更詳細地研究了對Hedgehog信號轉導的酒精抑制背后的機制。申請人已確定酒精暴露通過抑制Shh與窖蛋白-l形成復合物的能力而導致Shh配體的有缺陷的細胞內轉運，從而阻止了其至脂質筏區域中的質膜的轉移。酒精暴露破壞SHH的分泌酒精暴露抑制高爾基體中的Shh進入光滑ER，從而，預防在脂質徙區域形成Shh/窖蛋白-l蛋白質復合物，這導致Shh配體至質膜的有缺陷的轉運，并且導致Shh在高爾基體區室中積累。申請人推論Shh的有缺陷的細胞內轉運可導致Shh配體至細胞外基質的分泌減少。為了驗證該假說，申請人專注于酒精暴露對Shh在培養的產生Shh的細胞系HSC8B的培養基中的積累的作用。申請人使用兩個獨立的方法Western印跡分析和Elisa測定法就Shh配體的含量分析從HSC8B培養基收集的蛋白質。當HSC8B細胞在培養皿中的密度達到75%的匯合時，申請人用含有血清替代物和不同濃度的酒精(O、0.15、0.3、0.6和O.8%w/v,相應于O、25、55、109和136mM)的新鮮培養基更換培養基。將培養物再溫育另外3個小時，然后收獲培養基并且對其進行濃縮以進行蛋白質分離。如圖11A中所顯示的，培養基中積累的蛋白質的Western印跡分析表明酒精以劑量依賴性的方式抑制Shh的分泌；Elisa測定法顯示相似的結果。詳細地，HSC8B細^包對0.3%、0.6%和0.8°/。(55、109和136mM)酒精濃度的暴露相應于Shh分泌的1.2、4.2和5.5倍的減少(圖11B)。我們的結果描繪了對hedgehog信號轉導通路的酒精抑制的分子機制，其中酒精抑制對Shh的膽固醇修飾，這阻礙了Shh對窖蛋白-1的結合，阻止了其進入光滑ER，并破壞其隨后至脂質我區域的質膜的轉運，從而導致減少的Shh至細胞外基質內的分泌。用作干細胞營養物的膽固醇膽固醇和其衍生物是用于在胚胎和成體組織中維持依賴于Hedgehog(Hh)的干細胞的生理功能的營養物。Hedgehog配體和受體在肝中表達。Hh-應答細胞存在于胚胎早期，但極少存在于成體的正常肝中。具有經標記的成熟肝細胞的轉基因斑馬魚轉基因斑馬魚(LFABP-GFP)在成熟的肝細胞和膽管細胞(cholangiocyte)中表達GFP。轉基因斑馬魚LFABP-GFP是用于尋找肝干細胞的模型。在該轉基因品系中，所有成熟肝細胞和膽管細胞都通過用肝脂肪酸結合蛋白(LFABP)啟動子驅動表達來用GFP蛋白標記。在圖11中，酒精暴露破壞Shh至細胞外基質內的分泌。收集來自培養的HSC8B細胞系的培養基，然后對其進行濃縮以用于Western印跡分析(A)和Elisa測定法(B)。對不同酒精濃度(O.15%、0.3%、0.6%和0.8%V/V，相應于25、81、109和136mM)暴露以3小時可以以劑量依賴性方式抑制Shh的分泌。*表示p<0.05。在圖12中，融合的熒光圖像顯示GFP在肝中特異性表達。a).2.5天的胚胎，b，c)8個月大的成年魚。對成體肝切片的免疫染色驗證了GFP與位于成體肝細胞和膽管細胞中的內源LFABP表達相似。d)使用GFP抗體進行染色的野生型肝。e、f)使用GFP(e)和LFABP(f)抗體染色的轉基因肝。這些細胞中的GFP表達在胚胎第2天被起始(圖12)并且在整個完整的生命期(lifespan)中得到維持。如圖12B和12C中所顯示的，可在熒光顯微鏡下在活的成體斑馬魚(6,5個月)中清楚地觀察到GFP標記的肝臟。可在通過手術從魚取出的完整肝臟(血管除外)中看到高水平的GFP表達。通過使用抗GFP抗體，肝切片的免疫組織學分析揭示這些魚中的成熟肝細胞和膽管細胞表達GFP;此外，該GFP表達模式概括了在肝細胞和膽管細胞中但不在非實質細胞(nonparenchyma)中表達的LFABP的內源表達模式(圖和UF)。熒光激活細胞分選術(FACS)用于將肝細胞分成2個群體。GFP陽性群體包含成熟的肝干細胞和膽管細胞。假定的肝千細胞位于GFP陰性級分中。因為GFP受特定的基因(LFABP)啟動子控制，因而GFP表達限制在已分化的肝細胞和膽管細胞中。該獨特的特征提供了用于監測GFP陰性細胞是否在離體移植模型中分化成GFP陽性細胞的理想方式。當將GFP陰性/Ptc陽性細胞移植入野生型魚中時，GFP陽性細胞在受體肝中的出現表明一些供體細胞已分化，成為成熟的肝細胞或膽管細胞或兩者。因此，其還允許動態監測移植的細胞在受體魚中的分化過程。轉基因斑馬魚在轉基因斑馬魚中，包含0.05%的成體肝細胞群體的非實質細胞Ptc陽性細胞(GFP-/Ptc+)在形態學上與成熟的肝細胞不同。Ptc陽性(Ptc+)細胞分離自轉基因肝細胞群體的GFP陰性(GFP-)級分。首先，灌流LFABP-GFP肝臟，然后將FACS用于從GFP+細胞分選GFP-細胞兩次。其次，用抗Ptc抗體對GFP-級分進行免疫染色，然后用綴合有羅丹明熒光染料的二抗(圖13A)進行溫育。因此，通過另一輪FACS分離0-/"+細胞(其不具有綠色熒光/高紅色熒光)。在圖13中，流式細胞分選術(cellcytometry)用于從LFABP-GFP肝中分離GFP-/Ptc+細胞(A)。通過實時定量RT-PCR進行的基因表達分析顯示Ptc-抗體分選的GFP-細胞富含Ptc和Aldh2但非Shh的轉錄物(B)。概括地說，GFP"7Ptc+細胞包含大約0.05%的完整肝細胞群體。與直徑大約12-18iam的成熟肝細胞相比，GFP-ZPtc+細胞較小，具有大約4-6jLim的直徑。實時定量RT-PCR分析(圖13B)確i^了這些細胞表達高水產的PtcmRNA，比成熟肝細胞高27倍。另一個干細胞標記基因Aldh2富含于GFP-/Ptc+細胞(比GFP+成熟的肝細胞和膽管細胞中的表達水平高20倍)。GFP-/PTC+細胞在體外分化成GPF+細胞在FGF/HGF肝誘導培養基中，培養的&-/^+細胞表達GFP并且分化成肝細胞樣形態。不同的培養時間已示于a)l小時；b)5天；和c，d)14天。GFP-/Ptc+細胞(圖14A)在通常的培養基中難以培養；在培養的前兩周中無細胞分裂發生，并且細胞逐漸死亡。在嘗試幾種不同的培養條件后，發現這些細胞在于28.S'C下溫育的涂鋪膠原蛋白IV和層粘連蛋白的培養皿中生長旺盛。配制包含100ng/mlFGF1、20ng/mlFGF4和50ng/mlHGF的肝細胞誘導培養基。在該培養基中，GFP-ZPtc+細胞開始表達GFP,表明細胞已分化成肝細胞或膽管細胞或兩者。在培養這些細胞進行5天后，細胞開始表達GFP并且轉化如同肝細胞(圖14B)。在培養14天后，形成集落，其中集落中心的細胞表達GFP(圖14C);GFP陰性細胞的區帶，7-9個細胞寬，圍繞GFP陽性細胞。處于集落邊緣的這些GFP陰性細胞在經歷另外2-3天后變成GFP陽性，而新的GFP陰性細胞出現(或遷移)，從而在集落的邊緣形成新的GFP陰性細胞區帶(圖14C和14D)。GFP-ZPTC+細胞在預先損傷的肝中增殖并且分化成膽小管上皮細胞和肝細胞在圖15中，GFP-/Ptc+細胞整合入膽小管上皮細胞和肝細胞中并且在移植入野生型受體魚后開始在預先損傷的肝中表達GFP。移植后1個月受體魚(A-B)和肝(C，D)的熒光圖像。E-H)。移植后一周(E，H)和一個月受體肝切片上的GFP抗體免疫染色。I-L)使用GFP抗體在一個月的受體肝切片上進行GFP蛋白的免疫熒光。1.DAPI核染色，J.內源GFP，K.GFP抗體染色；L.I-K的融合。為了確定這些尺寸較小的GFP"7Ptc+細胞是否是多能肝干細胞，通過將它們移才直入野生型斑馬魚和青鏘(medaka)來研究這些細月包的命運。在移植細胞的前一天，用衣霉素(蛋白質翻譯抑制劑)注射受體斑馬魚以誘導大范圍的肝損傷和肝細胞死亡。將100個供體細胞(GFP-/Ptc+)腹膜內注射入受體野生型魚。在移植后一周，當在熒光顯微鏡下檢查時，在受體魚中觀察到GFP表達。所述受體肝的冷凍切片顯示GFP陽性細胞已經重新注入(repopulate)肝。此外，GFP單克隆抗體染色揭示供體細胞正在經歷非?？焖俚脑鲋澈头只赡懝苌掀ぜ毎约耙恍┓只筛渭毎?圖15E和15F)。在移植后一個月，恢復的肝包含許多GFP陽性(圖15L)肝細胞(10。/。)，其為移植的GFP-/Ptc+供體細胞的后代(圖15G和15H)。這清楚地說明，如在細胞培養中看到的，當移植入具有之前損傷的肝的成年斑馬魚時，Ptc陽性非實質細胞可分化成肝細胞樣和膽管細胞樣細胞。這些結果提供了測試本方案的總體假說即Hh信號傳導可在成體肝中調控干細胞的自我更新、擴展和分化的堅實基礎。30酒精破壞SHH配體與脂質我的結合，抑制SHH蛋白的分泌和轉運。酒精破壞Shh蛋白(紅色)和脂質我(綠色)的共定位(黃色)并且導致如圖16中看到的Shh的轉運和分泌缺陷。A-C是無酒精處理的對照；D-E用0.25%(V/V)酒精處理5分鐘；G-I用1.0%酒精處理1小時。脂質筏在A、D和G的共聚焦圖像中通過綠色焚光標記；Shh蛋白在B、E和H中通過紅色焚光顯示。融合的圖像是C、F和I，其中黃色信號表示Shh和脂質我的共定位。為了仔細分析酒精誘導的hedgehog信號傳導缺陷的詳細機制，監測Shh蛋白在細胞中的轉運(圖16)。選擇來自成體大鼠肝的肝星狀細胞系HSC8B作為研究Shh運輸和脂質幾的共定位的動力學變化的模型。用VybrantLipidRaftLabeling試齊'J盒(MolecularProbe，CatalognumberV34403)標記脂質我。該標記系統在肝細胞中提供了方便的、可靠的和極其明亮的脂質我的熒光標記。脂質筏是不溶于去垢劑的、富含鞘脂類和膽固醇的膜微區，該微區在質膜中形成側面組裝結構(lateralassembly)。其使用從霍亂弧菌(Vibriocholerae)分泌的并且可特異性結合脂質筏的組成脂質的細菌毒蛋白-霍亂毒素亞基B(CT-B)的天然親和力。VybrantLipidRaftLabeling試劑盒提供了用于在體內使用明亮的和極其耐光的ALEXAFLUOR染料熒光標記脂質我的至關重要的試劑。活細胞首先用霍亂毒素亞基B(CT-B)的綠色熒光AlexaFluor488(或其他顏色染料)綴合物標記。該CT-B綴合物結合質膜神經節苷脂GM1的五糖鏈，其選擇性地分配入脂質我。然后將特異性識別CT-B的抗體用于將CT-B標記的脂質筏交聯入質膜上的不同斑片(patch)，這可通過熒光顯微鏡容易地顯現。當用濃度為0.25%v/v的酒精處理肝星狀細胞恰好5分鐘時，Shh(紅色)和脂質我(綠色)的共定位被破壞(與無酒精處理的相比，存在較少的黃色)，當酒精濃度增加至1%進行1小時時，Shh蛋白表達水平不受影響，但幾乎所有的Shh蛋白積累在肝星狀細胞的內部，不與脂質茯或細胞膜結合。因而已發現酒精病理學機制的底線酒精抑制Hedgehog蛋白的膽固醇化，在脂錨定蛋白(lipidanchor)不存在的情況下，Shh蛋白不能與脂質我結合并且不能分泌；因而這些轉運缺陷導致該形態發生素梯度異常，該異常導致發育問題例如胎兒酒精綜合征以及肝硬化。此外，在許多器官的成體千細胞中，已證明Hedgehog通路在參與組織再生和修復中起著主要作用。這些千細胞發現于腦、皮膚和消化系統中。酒精中毒加速衰老過程并且誘導肝損傷，甚至肝硬化。假設膽固醇和膽固醇衍生物可在維持干細胞功能和預防酒精性衰老疾病例如肝硬化中起著關鍵作用。研究總結1.基于申請人之前對Ptc-lacZ轉基因小鼠所做的工作，申請人注意到在肝細胞分化過程中，Ptc陽性細胞的數目在胚胎第11天后在小鼠中顯著減少。在成年小鼠中，所有成熟肝細胞缺乏Ptc表達，但非常少的表達陽性Ptc的細胞位于膽管基板(Mleductularplate)附近。通過使用蔗糖梯度離心，申請人在肝細胞群體的非實質細胞級分中發現Ptc陽性細胞。更重要地，可在病理刺激下誘導Ptc陽性細胞增殖和分化。膽管連接導致Ptc陽性細胞的增殖的顯著增加；此外，這些細胞中的一些是橢圓形細胞(ovalcell)謙系的祖先細胞。這些結果強有力地表明細胞膜蛋白Hh受體Ptc可用于從成體肝中鑒定和分離靜止的成體肝千細胞。2.鑒于病理刺激誘導Ptc陽性細胞增殖和分化，從成體肝中分離Ptc陽性細胞。通過使用獨特的轉基因斑馬魚模型，從成體肝細胞群體的非實質細胞級分中純化Ptc陽性細胞。當移植入具有之前損傷的肝的成體斑馬魚時，這些相對小的Ptc陽性非實質細胞可被誘導分化成肝細胞和膽管細胞。3.肝再生是修復損傷的肝(包括長期消耗酒精損傷的肝)所必需的。不斷積累的證據表明酒精誘導的缺陷的病理學機制可牽涉削減的Hh信號傳導。胎兒酒精施用導致與在具有Hh信號傳導缺陷或膽固醇代謝缺陷的動物中看到相似的異常。Hh信號傳導控制器官或組織的發育，其也為胎兒酒精綜合征中最易受傷害的靶。在斑馬魚中，申請人發現酒精可通過破壞膽固醇的動態平衡、在斑馬魚胚胎和大鼠成體肝細胞中削減膽固醇-Shh修飾和Shh轉運來抑制Hh信號傳導。補充的膽固醇拯救了Shh的膽固醇修飾，恢復Hh信號傳導并預防酒精誘導的發育性缺陷。用于通過脂質化學分析和拉曼光語診斷酒精相關性疾病的生物標記物的鑒定酒精的消耗在上升，特別地在女性中?？偟貋碚f，其對胎兒發育的影響比歸因于可卡因、海洛因或大麻的影響更有害。在美國，FAS是神經發育遲緩和先天性缺陷的首要原因，甚至超過脊柱裂和唐氏綜合征。在美國每年出生大約50，000個具有酒精相關性缺陷的孩子。雖然有胎教和普通公眾的意識，5個懷孕婦女中有一個據認為在懷孕期間消耗酒精。此外，也報告消耗酒精的婦女中45%直至懷孕的第四周后才知道她們懷孕了。因此，與酒精相關的出生缺陷的花費據估計每年97億美元。雖然關于FAS的大量的研究工作仍在繼續，但除了已證明的事實酒精對發育中的胎兒是有害的外，幾乎未獲得結論性的證據。檢測孕婦當中酒精的使用是針對預防酒精相關性出生缺陷的重要步驟。由于對母親使用酒精的報告不足以及在嚴重的FAS缺陷不存在的情況下鑒定暴露于酒精的新生兒通常是非常困難的，因此可檢測懷孕期間使用酒精的生物標記物可有助于對懷孕母親和受影響的嬰兒進行早期鑒定和干預。更重要地，在6歲前對受影響的兒童進行的早期千預可減少在以后的人生中反社會行為的發生。我們的觀察表明了酒精通過改變膽固醇新陳代謝而產生的致畸作用的新機制。即使在極低的酒精暴露濃度，申請人觀察到斑馬魚胚胎中膽固醇酯水平和膽固醇酯對總膽固醇的比率的一致并顯著的減小。此外，申請人還發現Hedgehog通路中削減的信號傳導，所述通路在易于受到產前酒精暴露傷害的許多器官和結構的胚胎發育中起著至關重要的作用。這種改變的信號傳導似乎歸因于Hedgehog配體的膽固醇修飾的缺陷。為了在哺乳動物中驗證我們的發現，申請人已長期詞養小鼠酒精飲食并且在膽固醇動態平衡中發現相似的異常。這些機制研究(mechanisticstudy)提供了堅實的指征集中于游離脂肪酸和膽固醇的代謝特征分析將產生關于酒精暴露的新的成套生物標記物。基于我們之前的數據，我們的目的是鑒定生物標記物標志，其通過通過臨床試驗化學地或通過拉曼光語法物理地指紋識別代謝中間產物(例如膽固醇)來檢測母體和產前酒精暴露。拉曼光鐠當光通過物質時，大部分光子繼續沿著它們最初的方向前進，但少部分分散在其他方向上。由于振動而散射的光稱為拉曼散射或拉曼效應。入射光子和拉曼散射光子之間的能量差等于散射分子的振動的能量。散射光的強度對能量差的曲線是拉曼光譜。拉曼光i瞽的本體和強度的測量可特異性地鑒定復雜系統中的分子和它們的濃度。這是拉曼分光鏡的物理化學基礎。酒精處理減少膽固醇酯含量和膽固醇轉運我們的研究數據(圖3)表明嚢胚晚期中的酒精暴露引起與膜結合的Shh的劑量依賴性減少。鑒于膽固醇對Shh的酯化驅動其膜定位，這些結果暗示著酒精暴露減少膽固醇酯的形成。為了篩選該可能性，申請人:測量了完整胚胎提取物中的膽固醇酯含量，所述胚胎提取物在嚢胚晚期中暴露于不同劑量的酒精以3小時。申請人然后通過測量完整胚胎提取物中的膽固醇水平來測試酒精暴露是否在原腸胚形成過程中損壞總的固醇動態平衡。酒精暴露以劑量相關性的方式導致胚胎的總膽固醇含量的減少(圖4)。這主要歸因于膽固醇酯的減少，與游離膽固醇的減少幾乎無關。這些傾向也在從長期施用酒精的小鼠模型收集的數據中看到。通過比較兩個對照組，血漿中膽固醇酯對總膽固醇的比率在酒精處理的組中顯著減少(p<0.001)(圖17A)。在圖17中，酒精暴露破壞胚胎中的游離膽固醇/膽固醇酯的平衡和轉運。A.長期酒精飼養減少了膽固醇酯對總膽固醇的比率。B.菲律賓毒素染色顯示胚胎體(embryobody)中游離膽固醇的顯著減少；油紅O染色鑒定了膽固醇酯在胚卵黃中顯著減少。所有母體游離膽固醇儲存在胚卵黃中。當進行酯化反應后，則膽固醇酯可從胚卵黃轉運至胚體。為了研究在酒精處理的胚胎中是否存在膽固醇的酯化和轉運缺陷，申請人還使用兩種能夠區分游離膽固醇和膽固醇酯的化學物質測定胚胎體和胚卵黃之間的游離膽固醇和膽固醇酯的分布。熒光分子菲律賓毒素可以選擇性結合游離膽固醇，但不結合膽固醇酯；另一方面，油紅0的染色鑒定中性脂質分子例如膽固醇酯，但不鑒定極性的游離膽固醇。首先，申請人通過整體固定原位菲律賓毒素染色定量分析游離膽固醇。菲律賓毒素-游離膽固醇染色的原位定量密度分析顯示游離膽固醇在暴露于酒精的胚胎中差異性地減少，在胚胎體中顯示膽固醇濃度的大量減少，但在胚卵黃中未顯示大量減少。第二，油紅0染色揭示胚卵黃中膽固醇脂的顯著減少，而在胚體中其濃度變化很小或無變化(圖17B)。不同形式膽固醇的濃度的差異空間變化表明酒精對膽固醇酯化的抑制可導致從胚卵黃至胚胎體(組織)的有缺陷的膽固醇轉運，從而在胚胎組織中導致血膽固醇過少(hypocholesteromia),和從而有缺陷的Shh膽固醇修飾。通過拉曼光傳進行的酒精相關性生物標記的非侵入性檢測申請人:已開發了"多才莫多路多波長(Multimodalmultiplexmulti-wavelength)，，拉曼光謙法。該系統獲得了獨特的高光學通量和熒光排斥(fluorescencerejection)以檢測組織中的酒精以及跟蹤酒精暴露誘導的膽固醇標志(signature)的變化。傳感器是荻得組織中酒精的拉曼光譜的空間編碼的檢測光學器件和頻譜編碼的激發源的組合(圖18A)。圖18就拉曼光i普體內表征了暴露于酒精的胚胎中的酒精和膽固醇標志編碼孔多波長拉曼光語法(Coded-aperturemulti—wavelengthRamanspectroscopy)(A)，其體夕卜檢觀'J酒精的靈敏度可達到低至O.01%(B)。用酒精(3%)、Tomaxifin(5uM)或AY9944(7.5uM)處理的胚胎中的膽固醇的拉曼標志的變化(C)。繪圖顯示酒精的觀'J量基本i瞽纟且成幅值(measurementprinciplespectralcomponentamplitude)和濃度之間的關系。對于大約10%至0.01%的組織酒精濃度，所測量的結果在精確性上是優良的(圖18B)。申請人已將拉曼系統用于測試斑馬魚胚胎中的膽固醇。已發現膽固醇拉曼光鐠的標志變化，在拉曼光鐠區域1600-1000cii^中其與胚胎對酒精的暴露相關(圖18C)。該酒精拉曼光鐠的顯著變化是圍繞1470和圍繞1300cn^的峰強度的增加，其中膽固醇峰在酒精的影響下明顯降低。另一個重要的差異是1000至1200cn^的精細拉曼特征，其中可在經酒精處理的胚胎中檢測到清楚的峰。通過與其他兩個已知的膽固醇動態平衡抑制劑Tomxafin(抑制膽固醇酯化)和AY9944(抑制膽固醇生物合成)相比較，膽固醇拉曼光譜的該變化也是獨特的。這兩種藥物相關性拉曼光譜的標志也對診斷和監控由這些藥物引起的膽固醇缺陷具有深遠的臨床影響。膽固醇衍生物組分拯救大鼠星狀細胞中的酒精抑制的HEDGEHOG信號轉導活性膽固醇衍生物組分拯救大鼠肝星狀細胞中的酒精抑制的Hedgehog信號傳導活性。肝星狀細胞，也稱為Ito細胞，發現于肝的竇周間隙(竇狀隙(sinusoid)和肝細胞之間的小區域)中。星狀細胞是參與肝纖維化的主要細胞類型，所述肝纖維化是響應肝損傷的瘢痕組織形成。在正常肝中，星狀細胞被描述為以靜止狀態存在。靜止的星狀細胞代表了5-8%的肝細胞的總數。不同的環境因素和疾病引起的肝損傷(例如酒精暴露)可被激活。激活的星狀細胞負責分泌膠原瘢痕組織(纖維化)，這可導致肝硬化。以一式兩份的大鼠肝星狀細胞系8H的實驗進行Gli-熒光素酶報告分子測定法。簡而言之，將5H細胞培養在補充有10%胎牛血清和青霉素以及鏈霉素(IOOU/ml)的DMEM培養基中。在40-50%的匯合時，通過使用FuGENE6轉染劑(RocheAppliedScience)用Gli-BS-熒火蟲熒光素酶質粒(60ngn廣)和海腎熒光素酶質粒(60ngn「1，pRL-TK，Promega)(濃度比10:1)轉染細胞。24小時后，用含有不同濃度的酒精的培養基更換培養基。2小時后，向不同的藥物(20a-0HC、22(S)-OHC、25-0HC和膽固醇)中加入培養基。16小時后，在冰冷的PBS中洗滌細胞3次，然后通過Dual/UiciferaseReporterAssaySystem(Promega)進行測定。就轉染效率將熒火蟲熒光素酶報告分子的活性對海腎熒光素酶內部對照的活性進行標準化。當與無酒精處理組(AO)比較時，酒精處理(0.25、0.5、0.75和1.(T"/v)減少Hedgehog信號傳導的活性，如通過肝星狀細胞中Gli結合位點來源的焚光素酶的活性所測量的。在酒精暴露2至3小時后，加入膽固醇以及其他固醇樣組分可將Hedgehog通路功能拯救回與無酒精暴露組相似的正常水平(表II)。這些受試化學物質和它們的濃度范圍描述于下列表中。表II膽固醇和其他膽固醇相似組分恢復酒精處理的肝星狀細胞中的組分膽固醇25-輕基膽固醇22(S)-羥基膽固醇20ot-羥基膽固醇角豊烯HEDGEHOG信號轉導活性濃度范圍1-50jjM0.1-100iuM0.1-1000.1-1000.1-100uM優選的濃度1-20pM5-15l-5)iMl-5|jM1-10iaM膽固醇衍生物組分在斑馬魚胚胎中預防酒精誘導的發育性缺陷膽固醇和膽固醇樣組分拯救組織培養系統中的經酒精處理的大鼠肝星狀細胞中的hedgehog活性。為了測試也在動物模型中起作用的拯救能力，在1-2細胞期用0.2nl的膽固醇和膽固醇衍生物向斑馬魚胚胎中顯微注射膽固醇和膽固醇樣組分(濃度范圍列于上面的表II中)。讓胚胎發育4.3個小時，然后如前面所述用酒精處理6小時。在72hpf時，分析胚胎。結論如圖21中所看到的，膽固醇和膽固醇樣分子預防酒精誘導的胚胎發育性缺陷。AO:無酒精暴露；A2:2%V/V酒精暴露。Chol:膽固醇；20aOHC:22oc-羥基膽固醇;22-OHC:22-羥基膽固醇;25-OHC:25-羥基膽固醇和角鯊烯。當從受精后4.3小時開始用2.0%酒精處理斑馬魚胚胎時，其引起發育性缺陷，例如前腦平截(forebraintruncation)、獨眼和生長遲緩。這些酒精(2%)處理的胚胎中只有15%在總體形態上發育相對正常。另一方面，用膽固醇和膽固醇樣組分補充這些2%酒精暴露的胚胎，大體正常發育的胚胎的百分數顯著增加，達到大約80%(參見圖20和21)。在圖20和21中，顯示膽固醇和膽固醇樣分子預防酒精誘導的胚胎發育性缺陷。A0:無酒精暴露；A2:2%V/V酒精暴露。Chol:膽固醇；20a0HC:22oc-幾基膽固醇；22-OHC:22-羥基膽固醇；25-OHC:25-羥基膽固醇和角鱉烯。成體組織的膽固醇處理使用的膽固醇的類型膽固醇是在所有身體組織的細胞膜中和在所有動物的血漿中轉運中發現的固醇(類固醇和醇的組合)和脂質。1.膽固醇的化學名稱是10，13-二甲基-17-(6-甲基庚基-2-基)-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氫-IH-環戊烷[a]菲(phernanthren)-3-醇?；瘜W式是C27H"0。如下說明膽固醇的化學結構。分子量是386.65g/mol。III.名稱5-膽石烯-3b，22-二醇(22-羥基膽固醇)通用名符號化學式C27H"02分子量(平均)402.653IV.名稱5-膽石烯-3b，25-二醇(25-羥基膽固醇)通用名符號化學式C27H"02分子量(平均)402.653V.角鯊烯名稱2，6，10,15，19，23-六曱基-2，6，20，24，28，22-二十四碳己烯通用名角鯊烯/菠菜烯/篁烯符號化學式C3。H5。分子量(平均)410.718Sigma公司生產這些膽固醇類，它們中的大部分用于研究目的。迄今已測試了這些分子中的4種分子，它們具有膽固醇結構的相似性。干細胞營養物常規膽固醇和其他4種(上面)中的一種的組合對用于支持良好的t-細胞營養的非處方補充劑是安全的。迄今為止，膽固醇和其他4種受試形式具有維持千細胞的功能的能力，所述功能依賴于魚胚胎和培養的肝細胞系中的hedgehog信號傳導。這些功能拯救了由環境因素(例如酒精和他汀類藥物)誘導的發育性缺陷，并且通過提高細胞存活能力、增殖和再生能力來發揮作用干細胞營養。營養補充劑(NUTRIENTSUPPLEMENT)和藥物總的來說，膽固醇是我們身體中的天然分子，我們以每天基礎量從食物中攝入膽固醇。膽固醇(甚至膽固醇樣物質)可作為營養物在市場上銷售。所有這些組分也具有巨大的潛力被開發為新藥。這些膽固醇化合物可以與降膽固醇產品例如LIPIT0R(其顯示許多副作用)發生沖突。LIPIT0R的主要用途是當其超過220rag/dl時降低膽固醇。將膽固醇降至非常低的水平將損害千細胞和相關的組織再生和衰老。增加的膽固醇食物療法的可能副作用可以是血液和組織中的高膽固醇水平。其他膽固醇樣分子可具有在體內產生過多干細胞的機會，從而其可具有產生胂瘤的高概率。肝的處理肝損傷的膽固醇處理為肝星狀細胞提供了更高的hedgehog活性?？诜鑴┠懝檀夹问綉斒亲畛Ｒ姾头奖愕姆绞健＜∪饣蜢o脈注射可用于特殊的情況。其他醫學病癥的處理本文中列出了一些可用OTC或處方膽固醇處理的醫學病癥化學治療和放射治療后的癌癥患者；他汀類藥物將膽固醇降得太低；骨髓移植；干細胞移植治療衰老患者具有營養問題，喪失記憶抑郁和壓力懷孕懷孕時飲用酒精骨髓的處理本文中顯示膽固醇治療阻止了總體上整個胚胎的發育性缺陷，但對于骨髓缺陷的益處沒有直接的證據。外源性補充膽固醇是常用的方法，口服、皮膚遞送以及通過肌肉或靜脈注射遞送。如本文中所報導的通過注射遞送膽固醇。關于骨髓功效的數據仍然缺乏。已證明Hedgehog信號傳導如何通過維持或拯救hedgehog信號傳導活性來作用于骨髓千細胞的過程。0TC或處方膽固醇處理可幫助的一些醫療狀況如下進行骨髓移植的白血病患者；化學治療或放射治療后的其他癌癥患者；具有血液干細胞問題的兒童。腦中的神經元在斑馬魚中，實驗室研究顯示膽固醇是如何在總本上預防整個胚胎的發育性缺陷的，特別是對于前腦和神經管以及神經管缺陷。外源性補充膽固醇是常用方法，口服、皮膚遞送以及肌肉或靜脈注射。我們關于前腦和眼缺陷的數據以及它們的拯救方法呈現在公開的論文中。我們顯示對于魚和大鼠肝細胞系上的hedgehog信號傳導的個體膽固醇功能的劑量范圍。這些觀察顯示功效順序為25-OHC、22(S)-OHC、膽固醇、20a-0HC和然后角鯊烯(使用常規的膽固醇)。OTC或處方膽固醇處理可幫助的一些醫療狀況是大腦損傷，大部分慢性腦衰老和疾病。其他器官可使用本發明的膽固醇和膽固醇樣治療處理幫助的其他身體器官是皮膚雖然上面論述了許多示例性方面和實施方案，但本領域技術人員將認識到某些^務飾、擴展(permeation)和添加以及其亞組合。因此在下文中引入的下列所附的權利要求意欲包括所有此類修飾、擴展、添加和亞組合(其都在它們真正的精神和范圍之內)。消化道權利要求1.在胚胎的以及成體的組織和器官中檢測酒精或降膽固醇組分和與其相關的損傷存在的方法，其包括測定在組織和器官中由于酒精和降膽固醇組分而引起的對Shh蛋白發生的缺陷的水平。2.檢測酒精損傷的胚胎和/或成體的Shh蛋白以及hedgehog通路的活性的方法，其包括膽固醇-hedgehog蛋白修飾的缺陷、Shh/窖蛋白-l結合能力、Shh細胞內運輸、質膜和脂質我結合、分泌、細胞內轉運、梯度的建立以及hedgehog通路信號轉導、膽固醇特征標志和其拉曼光傳的檢測和分析。3.用于在子宮內暴露于酒精的受試者中減少與胎兒酒精綜合征相關的病癥的方法，該方法包括以足以減少與胎兒酒精綜合征相關的病癥的量對受試者施用膽固醇或膽固醇衍生物。4.用于篩選和鑒定一種或多種試劑的方法，所述試劑是胎兒酒精綜合征和成體干細胞衰老相關性缺陷的保護劑或治療劑，所述方法包括在對胚胎進行短暫的酒精暴露之前、之后或同時對斑馬魚胚胎模型或大鼠肝星狀細胞系施用所述試劑；和檢測與對照相比經酒精處理的胚胎中的一系列分子和細胞缺陷。全文摘要營養干細胞以進行器官再生和預防酒精相關性疾病例如胎兒酒精綜合征(FAS)和肝硬化的機制。已發現這些干細胞營養物正面影響皮膚、肝臟、大腦神經元、胰腺和胃腸道。膽固醇補充在暴露于酒精的斑馬魚胚胎中預防胎兒酒精譜系缺陷(FASD)。通過使用斑馬魚模型，發現酒精通過破壞至關重要的信號轉導分子sonichedgehog(Shh)的依賴于膽固醇的激活來干擾胚胎發育。對暴露于酒精的胚胎補充膽固醇恢復了所述分子通路的功能性并且預防了FASD樣缺陷的發生。通過脂質化學分析和拉曼光譜法鑒定了用于診斷酒精相關性疾病的新型生物標記物。文檔編號A61K49/00GK101600461SQ200780051025公開日2009年12月9日申請日期2007年12月10日優先權日2006年12月8日發明者李尹雄申請人:李尹雄