一種干細胞與玻尿酸的組合物與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及美容醫學【技術領域】，尤其涉及一種醫用組合物與應用。本發明提供醫用組合物中包括間充質干細胞和玻尿酸。該組合物不但能夠在注射后立即生效，且持續時間長。實驗證明：30天后，注射了本發明提供的組合物的裸鼠體內制劑體積和濕重顯著(P<0.05)高于玻尿酸組和干細胞組。表明本發明提供的組合物，在注射初期即能達到立即生效的作用，而在注射一段時間后，仍能保持良好的效果。能夠同時兼具起效快、持續時間長的特點。
【專利說明】一種干細胞與玻尿酸的組合物與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及美容醫學【技術領域】，尤其涉及一種醫用組合物與應用。

【背景技術】
[0002] 玻尿酸是由雙糖單位（葡萄醛酸-N-乙硫氨基葡糖）組成的直鏈高分子多醣，是 一種組織中自然存在的物質。自然界中廣泛地存在于脊椎動物的結締組織、粘液組織、目艮 球之晶狀體及某些細菌的夾膜中，在組織結構上整體的保養或是細胞之間的運送都具有很 重要的功能。特別是在人類皮膚的真皮層中扮演了基質的重要角色，負責保留皮膚的水分。 但是，隨著年齡的增加，玻尿酸在體內的存量減少，皮膚就會出現皺紋、松弛、缺乏彈性的問 題。利用玻尿酸填補受損的膠原纖維，可將肌膚填滿撐起，皮膚進而有往上拉提的作用，從 而使皮膚滋潤光滑、柔軟而富有彈性，讓肌齡年輕，延緩衰老。天然玻尿酸與人體內玻尿酸 的結構一致，可被人體完全分解不會殘留體內對人體造成毒副作用，安全性高，因此，玻尿 酸作為整形、除皺材料目前被廣泛的應用于美容行業中。但是，玻尿酸很容易被機體吸收， 注射玻尿酸所維持的效果約在6?9個月之間，為了能夠長期維持塑形的效果需要多次注 射，增大了感染或排異反應出現的風險，且造成了更多的痛苦。
[0003] 間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSC)來源于發育早期的中胚層和外胚 層，具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受 到人們的關注。充質干細胞能夠產生膠原蛋白，膠原蛋白的主要功能是提供具有高抗張強 度的纖維，增強肌膚鎖水的作用，改善肌膚的內質結構，提高肌膚彈性與緊致性，并可以達 到局部生長塑形。因此，利用間充質干細胞分化成為自身的組織，永久的存在，可起到長期 塑形作用。但是，間充質干細胞作為美容整形材料，需要一段在體內分化的時間，不能如玻 尿酸般起到立竿見影的效果。
[0004] 因此，進一步研究能夠快速起效且長期塑性的美容整形材料十分必要。


【發明內容】

[0005] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種醫用組合物與應用，本發明提 供的組合物作為美容、整形或除皺的制劑能夠快速起效且能夠達到長期塑性的效果。
[0006] 本發明提供給的醫用組合物包括：間充質干細胞和玻尿酸。
[0007] 在一些實施例中，玻尿酸的體積分數為80 %?90%。
[0008] 在另一些實施例中，玻尿酸的體積分數為85%。
[0009] 在一些實施例中，間充質干細胞的濃度為I. OX IO4個/mL?I. OX 10 7個/mL。
[0010] 在另一些實施例中，間充質干細胞的濃度為I. OX IO5個/mL。
[0011] 在另一些實施例中，間充質干細胞的濃度為1.0 X IO6個/mL。
[0012] 脂肪干細胞具有很好的自我復制能力，并且可以分化成脂肪細胞，成為皮膚組織 的一部分，另外脂肪干細胞分泌出很多細胞因子，有利于皮膚保持良好的彈性，但是，脂肪 干細胞在體內的分化需要時間，因此，注射后需一段時間才能起效。玻尿酸作為注射用的組 織填充物，用于改善面部皺紋，面部微整形，以及矯正外傷或青春痘留下真皮層的疤痕，注 射后立刻起效，但在人體內可以被降解、吸收，持續時間短，一般只能維持3個月?4個月。 而本發明提供的組合物注射后可以同時具備玻尿酸的快速起效和干細胞持續時間長的優 點。
[0013] 在一些實施例中，間充質干細胞為脂肪干細胞。
[0014] 本發明提供的組合物中的間充質干細胞可為自制也可為市場購得，本發明對此不 作限定，但其實施皆在本發明的保護范圍之內。
[0015] 在一些實施例中，脂肪干細胞的制備方法為：將脂肪組織經I型膠原酶消化后，培 養至80%融合，經胰酶消化后繼代培養，獲得脂肪干細胞。
[0016] 在另一些實施例中，I型膠原酶占所述脂肪組織的質量分數為0. 25%。
[0017] 在另一些實施例中，培養的培養基為含有15% FBS的DMEM-F12培養基；培養的接 種濃度為1.0\105個/1^;培養的條件為371：、5%〇) 2、飽和濕度。
[0018] 在另一些實施例中，胰酶的量為5mg。
[0019] 在另一些實施例中，繼代培養的培養基為含有15% FBS的DMEM-F12培養基；培養 的接種濃度為5. OX IO4個/mL ;培養的條件為37°C、5% CO2、飽和濕度。
[0020] 具體的，脂肪干細胞的制備方法包括以下步驟：
[0021] 步驟1 :將脂肪組織與質量分數為0. 5%的I型膠原酶混合，混合的體積比為1:1， 37°C、IOOrpm消化Ih后，加入FBS終止消化；
[0022] 步驟2 :1500rpm離心5min，棄除脂肪組織和含有I型膠原酶的FBS，以PBS清洗 后，以培養基重懸后培養至80%融合；重懸的濃度為I. OX IO5個/mL，培養的條件為37°C、 5% CO2、飽和濕度，24h后更新培養基后，每3天更新培養基；
[0023] 步驟3 :棄除培養基，加入質量分數為0. 25%的胰酶，37°C、5%C(y'f|K2min，以培 養基終止消化后，棄除培養基；
[0024] 步驟4 :以密度為5 X IO4個/mL接種于培養基，繼代培養；
[0025] 培養基為含有FBS的DMEM-F12培養基，FBS的體積分數為15 %。
[0026] 本發明提供的干細胞與玻尿酸的組合物在制備美容、除皺、整形制劑中的應用。
[0027] 本發明提供的醫用組合物中包括間充質干細胞和玻尿酸。本發明提供的組合物 兼具干細胞和玻尿酸在美容、除皺、整形中的優點，不但能夠在注射后立即生效，且持續時 間長。經實驗證實，3天時，注射了本發明提供的組合物的裸鼠和注射了玻尿酸的裸鼠體內 制劑體積和重量相差不大，但注射了脂肪干細胞的裸鼠未見新組織產生；10天時，注射玻 尿酸的裸鼠體內制劑體積和濕重皆出現降低現象，注射了本發明提供的組合物的裸鼠體內 制劑的體積和濕重略有增加，而注射了脂肪干細胞的裸鼠仍未見新組織產生；30天后，注 射了本發明提供的組合物的裸鼠體內制劑體積和濕重顯著（P〈〇. 05)高于玻尿酸組和干細 胞組。表明本發明提供的組合物，在注射初期即能達到立即生效的作用，而在注射一段時間 后，仍能保持良好的效果。能夠同時兼具起效快、持續時間長的特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1示實施例1制備的脂肪干細胞表面抗原檢測結果；其中，圖l_a示抗原CD44 的檢測結果；圖Ι-a示抗原CD44的檢測結果；圖Ι-b示抗原CD73的檢測結果；圖1-c示抗 原CD90的檢測結果；圖1-d示抗原CD105的檢測結果；圖1-e示抗原CD34的檢測結果；圖 Ι-f示抗原⑶45的檢測結果；圖Ι-g示抗原HLA-DR的檢測結果；
[0029] 圖2示脂肪干細胞成脂誘導21天后分化結果；其中，圖2-a示成脂誘導前脂肪干 細胞油紅〇染色結果（IOX);圖2-b示成脂誘導后脂肪干細胞油紅0染色結果（IOX);
[0030] 圖3示脂肪干細胞成骨誘導28天后分化結果；其中，圖3-a示成脂誘導前脂肪干 細胞茜素紅染色結果（IOX);圖3-b示成脂誘導后脂肪干細胞茜素紅染色結果（IOX)。

【具體實施方式】
[0031] 本發明提供了一種醫用組合物與應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當 改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是 顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行 了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改 動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0032] 本發明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0033] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0034] 實施例1脂肪干細胞的制備
[0035] 將人體脂肪組織分裝至50mL離心管中，每管20mL。
[0036] 每管中加入等體積的0. 5% I型膠原酶（終濃度為0. 25%)，充分混勻，封口，轉移 至恒溫空氣搖床中，37°C、100R消化lh。
[0037] 每管加入4mL的FBS，終止消化，混勻。
[0038] 離心，1500rpm/min 離心 5min。
[0039] 離心后，取2mL的上層血液（中間層），分裝至兩個EP管中，分別留樣送檢。
[0040] 棄去上兩層液體，每管加入40mL PBS重懸，重懸細胞。
[0041] 離心，1500rpm/min離心5min，棄去上清，獲得脂肪干細胞。加入含15 % FBS的 DMEM-F12培養基重懸細胞，以I X IO5個/mL接種。
[0042] 輕輕前后搖動培養皿，使細胞懸液均勻分布于瓶底；將培養瓶做好標記并轉移到 37°C、5% CO2、飽和濕度為95%的培養箱中培養。
[0043] 24h后首次換液，棄去懸浮細胞.隨后每3天換一次液。
[0044] 在倒置顯微鏡下觀察脂肪干細胞，若細胞融合達80 %，則對脂肪干細胞進行傳代 處理，具體為：
[0045] 棄去培養基，加入PBS溶液5mL，輕輕前后搖動培養瓶，棄去PBS溶液（該步驟重復 2次）。
[0046] 每平皿加入2mL 0. 25%胰酶，把平皿移入C02培養箱內消化2min，消化后取出平 皿放置于顯微鏡下觀察細胞形態。
[0047] 80%脂肪干細胞皺縮變圓、漂浮脫落，往平皿中加入51^15%?85的01^1^12，終 止消化。吸取IOuL細胞懸液進行細胞計數,計算出細胞總數。
[0048] 1500rpm離心5min，取2mT,上清分裝至兩EP管中，每管ImL。
[0049] 以細胞密度為5X IO4個/mL，計算出所需的15% FBS的DMEM-F12培養基的體積 重懸細胞，并接種至IOcm平皿，IOmL/平皿。輕輕前后搖動平皿，使細胞懸液均勻分布于瓶 底，37°C、5% CO2、飽和濕度為95%的培養箱中培養。
[0050] 實施例2脂肪干細胞的質量鑒定
[0051] 取實施例1制備的脂肪干細胞，分別進行表面抗原檢測、成脂誘導分化、成骨誘導 分化，鑒定實施例1提供的脂肪干細胞的質量。
[0052] 1、脂肪干細胞的表面抗原檢測
[0053] 檢測采用流式細胞儀，分別檢測實施例1提供的脂肪干細胞中⑶44、⑶73、⑶90、 CD105、CD34、CD45 及 HLA-DR 表達，具體為：
[0054] 取不同代數的脂肪干細胞，吸去培養基，0.25%胰酶常規消化，制成IXlO5的細 胞懸液，分別取抗人⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶34、⑶45及HLA-DR的單克隆抗體各5 μ L， 加入細胞懸液500 μ L，室溫下避光孵育20min，同時設立空白同型對照，1500r/min離心 5min，棄上清，用含10% FBS的PBS洗滌2遍，用500 μ L PBS重懸后上機檢測。檢測結果如 圖1所示。結果顯示：實施例1制備的干細胞中，⑶44、⑶73、⑶90、⑶105的表達量> 99%， 而⑶34、⑶45及HLA-DR的表達量小于1%。證明本發明實施例1制備的脂肪干細胞純度 良好。
[0055] 2、脂肪干細胞成脂誘導分化
[0056] 取Ρ3代脂肪干細胞，消化，以IO6個細胞/孔密度接種于6孔培養板中，24h后，細 胞貼壁并伸展，更換成脂分化培養基（含有DMEM-F12培養基、體積分數為10%胎牛血清、 10mg/L 胰島素、1 μ mol/L 地塞米松、100 μ mol/L 吲哚美辛、500 μ mol/L IBMX)，含有 10%胎 牛血清的完全培養基組作為陰性對照。每3d更換1次培養基，定向分化誘導第21d后即可 以使用油紅〇染色定性觀察體外誘導分化的結果。結果如圖2所示。結果顯示，經21天的 誘導分化，干細胞成功的分化出了脂肪粒，表明實施例1制備的脂肪干細胞的活性良好。
[0057] 3、脂肪干細胞成骨誘導分化
[0058] 取P3代脂肪干細胞，消化，以IO6個細胞/孔密度接種于6孔培養板中，24h后，細 胞貼壁并仲展，更換成骨誘導培養基（含有DMEM-F12、體積分數為10% FBS、0. lymol/L地 塞米松、50 μ mol/L抗壞血酸、lOmmol/L β -甘油磷酸），含有10%胎牛血清的完全培養基組 作為陰性對照。每3d更換1次培養基，定向分化誘導。第28d后即可以使用茜素紅染色定 性觀察體外誘導分化的結果。結果如圖3所示。結果顯示，經28天的誘導分化，干細胞成 功的分化出現了鈣結節。表明實施例1制備的脂肪干細胞的活性良好。
[0059] 實施例3本發明提供的組合物功能鑒定
[0060] 一、本發明提供的組合物的制備：取實施例1制得的脂肪干細胞和玻尿酸按照表1 混合。
[0061] 表1各組分含量
[0062]

【權利要求】
1. 一種醫用組合物，其特征在于，包括：間充質干細胞和玻尿酸。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述玻尿酸的體積分數為80 %?90 %。
3. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述間充質干細胞的濃度為1. 0X 10 4個/mL ?1. 0X107個/mL。
4. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述間充質干細胞為脂肪干細胞。
5. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述脂肪干細胞的制備方法為：將脂肪 組織經I型膠原酶消化后，培養至80%融合，經胰酶消化后繼代培養，獲得脂肪干細胞。
6. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述I型膠原酶占所述脂肪組織的質 量分數為0.25%。
7. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述培養的培養基為含有15% FBS的 DMEM-F12培養基；培養的接種濃度為1. OX 105個/mL ;培養的條件為37°C、5% C02、飽和濕 度。
8. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述胰酶的量為5mg。
9. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述繼代培養的培養基為含有15% FBS 的DMEM-F12培養基；培養的接種濃度為5. OX 104個/mL ;培養的條件為37°C、5% C02、飽和 濕度。
10. 如權利要求1?9任一項所述的醫用組合物在制備美容、除皺、整形制劑中的應用。
【文檔編號】A61Q19/08GK104490727SQ201410718100
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 王小燕, 馬巖巖, 盧瑞珊 申請人:廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司