專利名稱：共表達(dá)prrsv orf3及orf5雙基因核酸疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)高新科技領(lǐng)域，共表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5雙基因核酸疫苗，用于對(duì)豬提供針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫保護(hù)作用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征可引起妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)等繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀。自2006年6月初以來，在我國湖北、湖南、江西、安徽等十幾個(gè)省份相繼出現(xiàn)高致病性PRRSV為主要病原的豬“無名高熱綜合征”，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒為單股正鏈RNA病毒，長(zhǎng)約15kb。ORF3編碼分子量為40～50ku的糖蛋白GP3，GP3在豬體內(nèi)并不能刺激產(chǎn)生中和抗體，但它可通過細(xì)胞免疫為母豬提供一定的保護(hù)；ORF5編碼約25ku的糖蛋白GP5，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體及特異性細(xì)胞免疫。目前用于預(yù)防PRRS的弱毒苗和滅活苗已在我國廣泛應(yīng)用，但是豬繁殖與呼吸綜合征仍未得到有效控制。核酸疫苗可將病毒保護(hù)性抗原的基因以質(zhì)粒的方式導(dǎo)入動(dòng)物體，其表達(dá)蛋白既可刺激產(chǎn)生體液免疫又可產(chǎn)生細(xì)胞免疫，本發(fā)明中將PRRSV ORF3及ORF5基因同時(shí)插入真核重組表達(dá)載體構(gòu)建的核酸疫苗尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制一種能夠有效控制豬繁殖與呼吸綜合征的共表達(dá)PRRSV ORF3及ORF5雙基因的核酸疫苗，使豬繁殖與呼吸綜合征難以防治的現(xiàn)狀得以突破。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 在哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體的2個(gè)多克隆位點(diǎn)中分別插入了PRRSV ORF3及ORF5完整基因，獲得共表達(dá)PRRSV ORF3及ORF5雙基因的核酸疫苗，該核酸疫苗可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)PRRSV的GP3及GP5蛋白。
上述核酸疫苗通過以下方法構(gòu)建而成 1)ORF3及ORF5的擴(kuò)增 根據(jù)PRRSV美洲標(biāo)準(zhǔn)毒株ATCC VR-2332的基因序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)PRRSV山東省分離株SD1株ORF3及ORF5的引物，引物序列如下 ORF3的引物S15’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’ S25’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’ 預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為852bp。
ORF5的引物W15’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’ W25’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’ 預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為702bp。
以SD1株的cDNA為模板，通過引物S1及S2擴(kuò)增ORF3，通過W1及W2擴(kuò)增ORF5基因。
2)S-W-PIRES真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將ORF5的PCR產(chǎn)物W片段與pIRES重組質(zhì)粒經(jīng)Xba I和Not I雙酶切，將ORF5插入pIRES，構(gòu)建W-pIRES重組質(zhì)粒。將W-pIRES及ORF3的PCR產(chǎn)物S片段經(jīng)EcoR I和Nhe I雙酶切后，將ORF3的PCR產(chǎn)物S片段插入W-pIRES，構(gòu)建S-W-PIRES真核重組表達(dá)載體。
3)S-W-PIRES真核重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將S-W-PIRES轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞，通過RT-PCR檢測(cè)ORF3及ORF5的轉(zhuǎn)錄情況，通過免疫組化檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。上述試驗(yàn)均證明了目的基因的轉(zhuǎn)錄及目的蛋白的表達(dá)。
4)S-W-PIRES真核重組質(zhì)粒的動(dòng)物試驗(yàn) 將S-W-PIRES質(zhì)粒免疫小鼠及豬，同時(shí)設(shè)空載體PIRES及生理鹽水對(duì)照組，檢測(cè)核酸疫苗免疫后動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)GP3及GP5的ELISA抗體、中和抗體及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。上述試驗(yàn)均證明了核酸疫苗S-W-PIRES在動(dòng)物體內(nèi)均可刺激產(chǎn)生針對(duì)GP3及GP5的抗體，中和抗體效價(jià)可達(dá)1∶18.4以上，淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組。
該核酸疫苗首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)載體中插入了PRRSV ORF3及ORF5基因，突破了PRRSV常規(guī)滅活疫苗及弱毒疫苗的局限性，避免了弱毒疫苗使用后毒力返強(qiáng)情況的發(fā)生，彌補(bǔ)了滅活疫苗免疫后不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫的缺陷，又可使針對(duì)GP5的抗體優(yōu)先產(chǎn)生，改變了PRRSV感染后針對(duì)GP5的中和抗體產(chǎn)生慢而且產(chǎn)生量少的不足。該核酸疫苗可在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)不斷的產(chǎn)生GP3蛋白及GP5蛋白，使機(jī)體不斷產(chǎn)生針對(duì)兩者的體液免疫及細(xì)胞免疫，對(duì)豬體提供持久的免疫保護(hù)力，在PRRS的防控中具有廣闊的應(yīng)用前景。
4、實(shí)施例 1)PCR引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)PRRSV SD1株的序列及真核表達(dá)載體PIRES多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)分別針對(duì)ORF3和ORF5的引物，由上海博亞生物公司合成。
ORF3的引物S15’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’ S25’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’ 預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為852bp。
ORF5的引物W15’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’ W25’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’ 預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為702bp。
2)病毒RNA的提取 將PRRSV SD1株接種Marc-145細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)75％左右病變并開始脫落時(shí)，凍融3次收集病毒液，用Trizol試劑盒提取病毒總RNA，操作方法按說明書進(jìn)行。
3)反轉(zhuǎn)錄 取提取的RNA 7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、RNase Inhibitor 1μL、ddH2O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。以此合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
4)PCR擴(kuò)增 以PRRSV SD1株cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過引物S1及S2擴(kuò)增ORF3，通過W1及W2擴(kuò)增ORF5基因。10×PCR Buffer 5μL，25pmol及L上、下游引物各2μL，10mmol及L dNTPs 4μL，1∶200稀釋的質(zhì)粒模板2μL，ddH2O 34μL，Taq E 1μL。95℃預(yù)變性5min，循環(huán)參數(shù)為94℃ 1min，退火溫度下(ORF3、ORF5片段的退火溫度分別為58.7℃、59.6℃)1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸8min。全部反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢查。針對(duì)ORF3及ORF5的PCR產(chǎn)物分別命名為S片段及W片段。
5)真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收。將真核表達(dá)載體PIRES及W片段分別經(jīng)XbaI+NotI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收。將經(jīng)XbaI+NotI雙酶切的PIRES回收片段與相應(yīng)酶切的W片段經(jīng)T4 DNA ligase連接，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液在Amp及LB平板上涂布，37℃培養(yǎng)16h進(jìn)行篩選。挑取克隆搖菌后提取質(zhì)粒，進(jìn)一步對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定，構(gòu)建W-PIRES真核表達(dá)載體。將鑒定正確的W-PIRES重組質(zhì)粒及S片段再分別經(jīng)過NheI+EcoRI雙酶切，按上述相同的方法連接，構(gòu)建S-W-PIRES真核雙表達(dá)載體。鑒定正確的克隆搖菌后送上海博亞公司測(cè)序。
6)COS1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將構(gòu)建成功的S-W-PIRES真核表達(dá)載體陽性克隆接種Amp及LB，堿裂解法質(zhì)粒大抽提，檢測(cè)所提質(zhì)粒DNA無RNA且超螺旋比例多于50％時(shí)用于轉(zhuǎn)染。COS1細(xì)胞長(zhǎng)至80％匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后72h進(jìn)行檢測(cè)。
7)RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系中PRRSV基因的轉(zhuǎn)錄 用Invitrogen公司的Trizol Reagent提取細(xì)胞總RNA，用12.5μL DEPC水溶解。RNA用于進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μL，其中模板RNA溶液12.5μL，5×buffer 4μL，10mmol及L dNTPs Mixture 1μL，RNase Inhibitor 0.5μL，下游引物1μL，AMV RNase 1μL。混勻后室溫放置10min，然后轉(zhuǎn)入42℃恒溫槽中保溫1h最后冰浴2min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)一步用于PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同4。全部反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢查。分別用針對(duì)ORF3及ORF5的引物所進(jìn)行的RT-PCR都可擴(kuò)增出特異性條帶，大小與預(yù)期大小相近。
8)免疫組化檢測(cè)瞬間表達(dá)情況 將合適濃度的細(xì)胞涂于載玻片上，晾干后，95％乙醇固定10min，PBS洗滌1次，晾干后4℃保存?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)于細(xì)胞片上滴加含0.3％ H2O2的80％-100％甲醇溶液，室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶30min，0.25％Triton-100室溫作用10min，PBS洗3次，用1％BSA室溫封閉20min，加入1％BSA稀釋的1∶100的PRRSV陽性豬血清，4℃過夜。PBS洗3次，再滴加1∶100稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，37℃孵育30min。PBS洗3次，再用50mM Tris-HCl(pH7.5)洗5min，加入DAB顯色液室溫3-10min，以出現(xiàn)棕色細(xì)胞而背景無非特異性染色為度，用去離子水沖洗中止顯色，觀察。可檢出染成棕色的陽性細(xì)胞，而正常細(xì)胞及對(duì)照質(zhì)粒PIRES轉(zhuǎn)染的細(xì)胞成陰性，鏡檢看不到染成棕色的細(xì)胞。
9)核酸疫苗的小鼠試驗(yàn) 用堿裂解法提取PIRES、S-W-PIRES真核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)定OD260及OD280，計(jì)算DNA含量＝OD260×50μg及mL×稀釋倍數(shù)，調(diào)整為1μg及μL。試驗(yàn)動(dòng)物為5周齡、體重20～22g的BALB及c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組15只，在小鼠的后腿兩側(cè)進(jìn)行注射免疫。第一組100μL S-W-PIRES；第二組注射PIRES對(duì)照100μL；第三組注射100μL PBS作為空白對(duì)照。首免與二免之間間隔2周，二免與三免之間間隔4周，三免后4周宰殺。每隔2周采集血清，分別用GP3、GP5做為抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)；進(jìn)行取宰殺后的血清進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。在二免后4周及三免后4周每組宰殺6只，分離脾臟淋巴細(xì)胞，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定。二免后2周，抗GP3蛋白及抗GP5蛋白的血清效價(jià)開始明顯上升；S-W-PIRES組中和抗體效價(jià)可達(dá)1∶32；S-W-PIRES免疫組淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于PIRES空載體免疫組及PBS免疫組。
10)核酸疫苗的豬體試驗(yàn) 用堿裂解法提取PIRES、S-W-PIRES真核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)定OD260及OD280，計(jì)算DNA含量＝OD260×50μg及mL×稀釋倍數(shù)，調(diào)整為1μg及μL。選用一月齡血清學(xué)檢測(cè)PRRS陰性大白仔豬24頭，隨機(jī)分為3組，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。兩后肢肌肉及耳背部皮內(nèi)注射DNA疫苗。分組情況如下第一組注射400μgS-W-PIRES；第二組注射空白質(zhì)粒PIRES對(duì)照；第三組注射PBS作為空白對(duì)照。首免與二免之間間隔2周，二免與三免之間間隔2周。自首免后每間隔2周采血一次，采用前腔靜脈采血，共4次。血清進(jìn)行PRRSV抗體的ELISA檢測(cè)及中和抗體檢測(cè)。在二免后2周及三免后2周采血分離外周血脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。二免后2周，抗GP3蛋白及抗GP5蛋白的血清效價(jià)開始明顯上升；S-W-PIRES組中和抗體效價(jià)可達(dá)1∶18.4；S-W-PIRES免疫組淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于PIRES空載體免疫組及PBS免疫組。
權(quán)利要求
1.共表達(dá)PRRSV ORF3及ORF5雙基因核酸疫苗的制備方法，其特征在于通過RT-PCR方法分別擴(kuò)增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并將2個(gè)基因插入哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pIRES的2個(gè)多克隆位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒S-W-PIRES的共表達(dá)PRRSV ORF3及ORF5雙基因核酸疫苗，該核酸疫苗在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)PRRSV的GP3及GP5蛋白；制備步驟如下
1)ORF3及ORF5的擴(kuò)增
根據(jù)PRRSV美洲標(biāo)準(zhǔn)毒株ATCC VR-2332的基因序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)PRRSV山東省分離株SD1株ORF3及ORF5的引物，引物序列如下
ORF3的引物S15’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’
S25’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’
預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為852bp
ORF5的引物W15’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’
W25’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’
預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為702bp
在每條引物的5’端均含有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以SD1株的cDNA為模板，通過引物S1及S2擴(kuò)增ORF3，通過W1及W2擴(kuò)增ORF5基因；
預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為702bp；
2)S-W-PIRES真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建
將ORF5的PCR產(chǎn)物W片段與pIRES重組質(zhì)粒經(jīng)Xba I和Not I雙酶切，將ORF5插入pIRES，構(gòu)建W-pIRES重組質(zhì)粒，將W-pIRES及ORF3的PCR產(chǎn)物S片段經(jīng)EcoR I和Nhe I雙酶切后，將ORF3的PCR產(chǎn)物S片段插入W-pIRES，構(gòu)建S-W-PIRES真核重組表達(dá)載體；
3)S-W-PIRES真核重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
將S-W-PIRES轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞，通過RT-PCR檢測(cè)ORF3及ORF5的轉(zhuǎn)錄情況，通過免疫組化檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，上述試驗(yàn)均證明了目的基因的轉(zhuǎn)錄及目的蛋白的表達(dá)；
4)S-W-PIRES真核重組質(zhì)粒的動(dòng)物試驗(yàn)
將S-W-PIRES質(zhì)粒免疫小鼠及豬，同時(shí)設(shè)空載體PIRES及生理鹽水對(duì)照組，檢測(cè)核酸疫苗免疫后動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)GP3及GP5的ELISA抗體、中和抗體及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，證明核酸疫苗S-W-PIRES在動(dòng)物體內(nèi)刺激產(chǎn)生針對(duì)GP3及GP5的抗體，中和抗體效價(jià)達(dá)1∶18.4，淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組。
全文摘要
本發(fā)明提供一種共表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5雙基因核酸疫苗的制備方法，該方法是通過RT-PCR方法分別擴(kuò)增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并將2個(gè)基因插入哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pIRES的2個(gè)多克隆位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒S-W-PIRES。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞，通過RT-PCR方法檢測(cè)到PRRSV ORF3及ORF5基因的轉(zhuǎn)錄，通過免疫組化檢測(cè)到目的蛋白的瞬間表達(dá)。該核酸疫苗可在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)不斷的產(chǎn)生GP3蛋白及GP5蛋白，使機(jī)體不斷產(chǎn)生針對(duì)兩者的抗體及細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)豬體提供持久的免疫保護(hù)力，在PRRS的防控中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K39/295GK101219216SQ20081001367
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者王金寶, 任慧英, 俊 李, 張秀美, 溫建新, 順 周, 李文立, 張樂萃, 宋春陽 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)