專利名稱：共表達prrsv orf5和pcv2 orf2雙價核酸疫苗的制備方法
共表達PRRSV 0RF5和PCV2 0RF2雙價核酸疫苗的制備方法技術領域：
本發明豬繁殖與綜合癥病毒和豬圓環病毒雙價核酸疫苗的制備方法屬于生 物技術高新科技領域，可以由一種核酸疫苗同時預防豬繁殖與呼吸綜合征豬圓 環病毒病的免疫保護作用。 2、背景技術豬繁殖與呼吸綜合征可引起妊娠母豬流產、死產等繁殖障礙和仔豬呼吸道 癥狀。自2006年6月初以來，在我國湖北、湖南、江西、安徽等十幾個省份相 繼出現高致病性PRRSV為主要病原的豬"無名高熱綜合征"，給我國的養豬業 造成了嚴重的經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒為單股正鏈RNA病毒，長約 15kb。 0RF5編碼約25ku的糖蛋白GP5，能誘導機體產生中和抗體及特異性細胞 免疫。豬圓環病毒是一種小的、二十面體對稱、無囊膜、共價閉合、單股環狀 DNA病毒，是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的主要病原。根據PCV的致病性及 全基因組序列，可分為兩個血清型:PCV-1與PCV-2 。 PCV-2含有兩個主要閱讀 框0RF1和0FR2。其中0RF2為702bp，編碼233個氨基酸，是病毒的主要結構 蛋白，具有良好的免疫原性，是構建重組疫苗的首選基因。目前在一些豬場，常發生此兩種病毒的混合感染，且毒株的同源性極高，本 試驗旨在構建同時含有此兩種病毒的主要結構蛋白的真核表達載體，為進一歩 研究PCV 0RF2及PRRSV 0RF5編碼蛋白的生物學活性及研究豬圓環和豬繁殖與 呼吸綜合征病毒雙價核酸疫苗奠定了基礎，其應用解決了在生產中防制豬圓環 病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒混合感染要分別注射二種疫苗的麻煩，減少了注 苗應激，降低了勞動強度，具有極大的研究意義。3、發明內容本發明的目的是研制一種能夠有效控制豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環病毒 病的共表達pIRES-0RF2/0RF5雙價核酸疫苗，使豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環 病毒病容易混合感染并難以防治的現狀得以突破。本發明的目的是這樣實現的共表達PRRSV 0RF5和PCV2 0RF2雙價核酸疫苗的制備方法，是在哺乳動物 真核表達載體的2個多克隆位點中分別插入了 PRRSV 0RF5和PCV2 ORF2完整基 因，該核酸疫苗可在哺乳動物細胞中同時表達PRRSV GP5蛋白和PCV2 Cap蛋白。上述核酸疫苗通過以下方法構建而成1) 0RF2及0RF5的擴增 擴增PCV 0RF2的引物為Hl: 5， -ATCGCTAGCg07ga^aTGACGTATCCAA-3 ， 臉IH2: 5' - GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3 ， fcoR I預期擴增長度為702bp。(注加粗部分為Kozak序列)擴增PRRSV 0RF5的引物為 Yl: 5， -AATCTAGAg07gCaTGTTGGA-3 ， 勘IY2: 5， -GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3 ， 淑I預期擴增長度為702bp。(注加粗部分為Kozak序列)分別以PRRSV SD1株的cDNA和PCV2SD1株的DNA為模板，通過引物Yl/Y2 擴增PRRSV 0RF2，通過HI/ H2擴增PCV2 0RF2基因。2) pIRES-0RF2/0RF5真核重組表達載體的構建將PCR產物0RF2經雙酶切回收后插入真核表達載體pIRES得到pIRES-0RF2 ， RT-PCR產物0RF5經雙酶切回收后插入pIRES-0RF2構建成重組質粒 pIRES-0RF2/0RF5。經PCR、 RT-PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功構建了轉移 載體pIRES-0RF2/0RF5。3) pIRES-0RF2/0RF5真核重組質粒的轉染將構建成功的pIRES-0RF20RF5重組質粒用脂質體法轉染真核細胞 Marc-145，經G418加壓篩選獲得穩定表達的細胞株，以PCR、 RT-PCR、和間接 免疫熒光檢測目的蛋白的表達情況。結果表明經PCR、 RT-PCR檢測到兩種目 的基因的轉錄；間接免疫熒光試驗檢測到目的蛋白在細胞漿和細胞核中觀察到 了特異性的亮綠色熒光，證明蛋白得到表達。

圖1轉移載體的構建示意圖；圖2: SD1株PCV- 0RF2的PCR擴增示電鏡圖；附圖2說明1.DNA標準DL2000; 2.陰性對照；3. 0RF2基因擴增產物圖3: SD1株0RF5的PCR擴增電鏡圖； 圖4: pIRES轉移載體的雙酶切鑒定電鏡圖。 具體實施方式
1)引物設計根據pIRES MCSA MCSB多克隆位點的序列和PCV-2及PRRSV 0RF5的核酸序 列，同時考慮外源基因的表達量在基因起始密碼子的前面加入Kozak序列，分 別設計了針對PCV-0RF2和PRRSV-0RF5的引物Hl/H2和Yl/Y2，并分別加入了相應的酶切位點。HI: 5， -ATCGCTAGCgCCgdaTGACGTATCCAA-3， 順e IH2: 5， - GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3 ， ￡b。R IYl: 5， -MTCTAGA6m7daTGTTGGA-3， 勘IY2: 5， -GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3 ， 淑I(注加粗部分為Kozak序列)2) 模板的制備 (1) PCR模板將死亡豬組織病料充分研磨制成懸浮液，凍融3次，離心取上清.加入蛋 白酶K至終濃度500l^g/mL、 SDS終濃度P/。， 55。C水浴2-3小時，用苯酚、苯酚 氯仿(1: 1)及氯仿各抽提一次，吸取水相，加入1A0體積的3mol/LNaAc及 2. 5倍體積的無水乙醇沉淀30min， 12 000rpm、 4。C離心15min。沉淀用70%洗滌 烘干后溶解于超純水中備用。 (2 ) RT-PCR模板取經反復凍融的細胞病毒液加TRIzol裂解液，充分震蕩后，靜置5min。繼 續加入氯仿(徹底混勻)4°C 12000rpm離心15min。將上清轉移至新的經DEPC 水處理的試管中，加異丙醇，混勻后室溫靜置15-30min 4°C 12000rpm離心 15min。用75%的乙醇洗滌沉淀一次，4°C 12000rpm離心5min。倒掉上清，在 印pendorf抽真空機上抽真空，沉淀溶于15叱DEPC水中備用。3) 目的基因擴增 (1) PCR擴增0RF2反應體系(總體積50^)如下超純水30. 5HL ， 10XPCR buffer 5PL， dNTP Mixture 4PL， MgC12 3叱，引物各l叱，模板5ML， Taq酶0. 5叱，充分混勻。0RF2基因擴增條件:預變性95。C 5min;變性94°C lmin;退火52°C lmin; 延伸72°C lmin，共30 Cycles,最終延伸72°C 10min。 (2 ) RT-PCR擴增反轉錄為cDNA:取RNA7^L+oligo(dT) l叱70°C溫育10min，冰育lOmin; 力口入5XReaction buffer機，d證Mixture 3^L， Ribo匿lease Inhibitor l叱，ddH20 3叱，M-MLV 1叱42°C水浴60-90min -2(TC保存。0RF5基因擴增條件預變性95。C 5min;變性94°C lmin;退火50°C lmin; 延伸72。C lmin，共30 Cycles,最終延伸72°C 10min。 4 )真核表達載體pIRES 0RF2/0RF5的構建 (1) pIRES—0RF2轉移載體的構建 (1.1) pIRES和0RF2的雙酶切將純化后的載體及片段按如下體系進行雙酶切EcoR 1...........................1)^1 EcoR 1...........................1WNhe 1...........................114 Nhe I............................ . ll^l10 XM Buffer...............2^1 10 XM Buffer...............2l4pIRES...........................514 0RF2...........................51^1ddH20........................11^1 ddH20........................11^137°C酶切lh(1. 2) pIRES和0RF2電泳鑒定并膠回收純化雙酶切產物，按照上海生工 膠回收試劑盒說明書進行(1.3) pIRES -0RF2的連接 pIRES...............21^10RF2...............Solution I............,12014 16°C保溫90min(1.4) pIRES -0RF2的轉化 (1. 4. 1) DH5 a感受態細胞制備以無菌接種環取凍存的DH5a菌種劃線接種LB Amp-平板37'C培養過夜， 該菌懸液以1: 100比例接種于LB液體培養基，37'C培養2-3h， 0D600=0. 5左右。〈1〉無菌條件下，將細菌轉移至50ml冰預冷的聚丙烯離心管中，冰上放置 lOmin， 4°C 4000rpm離心lOmin。〈2>棄上清，將管倒置lmin，用10ml冰預冷的0. lmol/L的CaCI2重懸沉淀， 冰上放置15 —30min后，4°C 4000rpm離心lOmin。〈3>棄上清，將管倒置lmin，加入4ml冰預冷的0. lmol/L的CaCI2，輕輕 懸浮細胞，加無菌甘油至終濃度為15%，混勻，分裝，每管200W，直接轉化或 一7(TC冰箱凍存備用。(1. 4. 2) pIRES — 0RF2的轉化從一70。C冰箱中取20014感受態細胞懸液，室溫下解凍，立即置冰上，解 凍后取l(Hil連接產物加入20(mi感受態細胞DH5a中，混勻，冰浴30min， 42°C 熱休克90s，再冰浴l一2min，之后加入800W LB(Amp-)液體培養基，37。C振 蕩培養45min，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因。 將上述菌液搖勻后，室溫離心30s，取100W涂布于含Amp+的篩選平板上，正面朝上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37t:培養24h((1.5) pIRES-0RF2質粒的提取 按照上海生工質粒提取試劑盒說明書進行。(1.6) pIRES - 0RF2轉移載體的PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定10 X PCR buffer...............5pldNTP Mixture ..................糾HI.................................214H2.................................pIRES - 0RF2..................0. 5rtrTaq E........................0. 5^1ddH20...........................EcoR 1...........................114Nhe I...........................lHl10XM Buffer...............2)^1PIRES - ORF2..................5(4ddH20........................37°C酶切4h(1. 6) pIRES—ORF20RF5轉移載體的構建 構建過程參照pIRES—0RF2轉移載體的構建，并進行PCR鑒定、雙酶切鑒 定和測序鑒定。 5)測序測序由Takara公司完成。應用合成引物對重組質粒中的插入片段進行序列 測定，將所測序列與GenBank中其他毒株的相應基因核苷酸序列進行比較，并 對由核苷酸序列推導出來的氨基酸序列進行同源性比較.以確定擴增片段的可 靠性。結果1) PCR擴增產物鑒定提取重組質粒，用引物Hl/H2對PCV SD1株0RF2基因進行PCR鑒定，可見 一條702bp目的片段，與預期的擴增片段相符(圖2)。用引物Y1/Y2對SD1株 0RF5進行PCR擴增鑒定，同樣有702bp目的片段(圖3)。1. DNA標準DL2000; 2. 0RF5基因；3.陰性對照圖3: SD1株ORF5的PCR擴增。2) 重組質粒雙酶切鑒定通過Amp抗性及雙酶切連接篩選后，獲得重組質粒pIRES-0RF20RF5，并通 過雙酶切鑒定〈1.DNA標準DL2000; <2. pIRES - 0RF20RF5 fcoR I + vV力e I; <3. pIRES -0RF20RF5 Xba I + Not I; 〈4.重組質粒pIRES - 0RF20RF5; <5. DNA標準 入- 飽d III digest。3)插入片段的序列測序及分析pIRES-0RF20RF5轉移載體0RF2經測序其基因長702bp，編碼233個氨基酸 與測序后的SD1株PCV全長(DQ346683)中的0RF2相吻合，符合預期結果。將 其與Genbank中PCV毒株0RF2進行同源性比較。結果表明，不同毒株PCV-2的 0RF2核苷酸序列同源性介于91. 9%~100%，推導氨基酸同源性為90. 2%~100%。本 實驗擴增的ORF2與AY484416 (英國)，AF201897 (德國)，AY682990 (中國) 等國內外代表株核苷酸同源性均為99%。pIRES—ORF20RF5轉移載體ORF5基因702bp (DQ265739)的核苷酸推導氨 基酸與北美洲原型(VR-2332株)氨基酸同源性為99%，與DQ474992, DQ476795 兩支美洲株的同源性亦為99%，其中第10位的半胱氨酸被替換為精氨酸，第151 位的精氨酸被替換為甘氨酸，第13位、151位的精氨酸被認為是強毒的標志之 一，該位置的替換可能引起病毒的毒力改變。SEQUENCE LISTING<110>山東省農業科學院畜牧獸醫研究所<120> 共表達PRRSV 0RF5和PCV2 0RF2雙價核酸疫苗的制備方法 <160> 4<170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211> 31<212> 薩<213>人工序列<220><223>引物<400> 1atcgctagcg ccgccaccat gacgtatcca a 31<210> 2 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 2gccgcggaat tctcacttag ggttaagt 28<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 〈400〉 3aatctagagc cgccaccatg ttgga 25<210> 4 <211> 24 <212> 飄 <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 4gcgcggccgc tcactggcgt gtag 2權利要求
1.共表達PRRSV ORF5和PCV2 ORF2雙價核酸疫苗的制備方法，其特征在于在哺乳動物真核表達載體的2個多克隆位點中分別插入了PRRSV ORF5和PCV2ORF2完整基因，該核酸疫苗可在哺乳動物細胞中同時表達PRRSV GP5蛋白和PCV2Cap蛋白；上述核酸疫苗通過以下方法構建而成1)ORF2及ORF5的擴增擴增PCV ORF2的引物為H15’-ATCGCTAGCGCCGCCACCATGACGTATCCAA-3’Nhe IH25’-GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3’ EcoR I預期擴增長度為702bp；加粗部分為Kozak序列擴增PRRSV ORF5的引物為Y15’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’ Xba IY25’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’Not I預期擴增長度為702bp；加粗部分為Kozak序列在每條引物的5’端均含有限制性內切酶酶切位點，分別以PRRSV SD1株的cDNA和PCV2SD1株的DNA為模板，通過引物Y1/Y2擴增PRRSV ORF2，通過H1/H2擴增PCV2 ORF2基因；以PCV SD1株的DNA為模板，應用RT-PCR技術擴增ORF2全基因，通過每對引物的限制性酶切位點，把ORF5及ORF2分別插入pIRES兩個不同的多克隆位點中，產生pIRES-ORF2/ORF5重組質粒，該質粒經酶切及PCR鑒定 id="icf0001" file="A2008100140540002C1.tif" wi="2" he="4" top= "166" left = "28" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>2)pIRES-ORF2/ORF5真核重組表達載體的構建將PCR產物ORF2經雙酶切回收后插入真核表達載體pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR產物ORF5經雙酶切回收后插入pIRES-ORF2構建成重組質粒pIRES-ORF2/ORF5，經PCR、RT-PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功構建了轉移載體pIRES-ORF2/ORF5；3)pIRES-ORF2/ORF5真核重組質粒的轉染將構建成功的pIRES-ORF2ORF5重組質粒用脂質體法轉染真核細胞Marc-145，經G418加壓篩選獲得穩定表達的細胞株，以PCR、RT-PCR、和間接免疫熒光檢測目的蛋白的表達情況，證明經PCR、RT-PCR檢測到兩種目的基因的轉錄；間接免疫熒光試驗檢測到目的蛋白在細胞漿和細胞核中觀察到了特異性的亮綠色熒光，證明蛋白得到表達。
全文摘要
本發明豬繁殖與綜合癥病毒和豬圓環病毒雙價核酸疫苗的制備方法，簡稱共表達PRRSV ORF5和PCV2 ORF2雙價核酸疫苗的制備方法，本發明根據哺乳動物細胞真核表達載體pIRES MCSA MCSB多克隆位點的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD1株的ORF2基因閱讀框架，同時考慮外源基因的表達量在基因起始密碼子的前面加入Kozak序列，分別設計了針對ORF5、ORF2的引物Y1/Y2，H1/H2。將PCR產物ORF2經雙酶切回收后插入真核表達載體pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR產物ORF5經雙酶切回收后插入pIRES-ORF2構建成重組質粒pIRES-ORF2/ORF5。經PCR、RT-PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功構建了轉移載體pIRES-ORF2/ORF5。
文檔編號A61P15/00GK101401936SQ20081001405
公開日2009年4月8日 申請日期2008年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者任慧英, 吳家強, 順 周, 張秀美, 俊 李, 溫建新, 王金寶, 趙鴻雁 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所