專利名稱：：一種放射性緩釋粒子及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于放射醫學領域，涉及一種放射性緩釋粒子及其制備方法和應用。技術背景-放射性藥物"P-磷酸鉻(32P-chromicphosphate,32P-CP)膠體早年被用于腔內惡性積液治療、組織間質治療和淋巴治療[14]。"P是純e—發射體，平均能量為0.695MeV(最大能量為1.71Mev)，半衰期為14.28d，組織中射程平均為34mm(最大射程達7.6mm)，通過韌致輻射顯像可粗略觀察全身放射性分布，臨床應用中易于輻射防護，且來源容易，價格適中，是理想的治療用核素。3"P-CP膠體顆粒大小約2050nm(占60%)，理化性質穩定，屬納米級核素，是理想的內照射治療性藥物。放射性核素間質近距離照射療法(bmchytherapy)治療實體腫瘤是近年來發展迅速的一種新技術，其方法是將點狀放射源置于病變部位或其周圍，通過放射源發出的射線在其有效射程內持續使腫瘤組織發生血管萎縮、細胞凋亡與壞死。^P-CP膠體腫瘤間質注射治療實體瘤成為近年國內外研究熱點，目前已報道此放射性藥物在對原發性肝癌、胰腺癌、卵巢癌、腦膠質瘤、頭頸部腫瘤等實體瘤及其轉移灶的實驗和臨床研究中取得了良好的抑瘤和淋巴轉移灶治療效果[5—8]，"P膠體明顯優于1251，其原因是①^P傳能線密度(LET)約為發射純7射線1251的兩倍，因此由P射線所誘導的腫瘤細胞凋亡的相對生物學效應(RBE)比相應x射線、Y射線要高；②^P-CP膠體較易沿淋巴或微循環遷徙，兼治淋巴道微轉移灶；1251鈦金屬粒子永久插植對病員帶來不便，甚至發生臟器穿孔、沿血液循環遷徙至肺臟等嚴重事件，且醫療費用昂貴。但本課題組在預期增加32P-CP給藥劑量以提高腫瘤局部療效的研究中發現，全身藥物的分布尤其是肝脾內聚集明顯增加，顯著影響了腫瘤與正常組織的劑量有效分配比及靶點有效半減期，且明顯增大了對肝臟、脾臟和骨髓等組織器官的毒副作用，實驗動物較大劑量組較之對照組體重減輕并發生皮下出血點等不良反應[9]。因此，目前臨床給藥仍多以機體耐受劑量而定且各家不一，始終未能解決通過增加藥量而增強"P局部生物學效應、控制其在瘤體外的分布、減低毒副作用等問題。從而明顯限制了其在腫瘤核醫學領域的臨床應用。聚L-乳酸(poly(L-lactide),PLLA)是一種具有優良的生物相容性、一定的力學強度且可被人體降解吸收的高分子材料，降解產物乳酸和羥基乙酸可參與人體的新陳代謝，最終形成二氧化碳和水被排出體外，已作為臨床上多種緩釋藥物的藥用輔料，以PLLA為骨架制成的植入用緩釋氟尿嘧啶、順鉑等化療藥物以及可生物降解的PLLA藥用輔料己被國家食品和藥品監督管理局批準進入臨床研究[1()—|2]，其中植入用緩釋氟尿嘧啶被認定為高新技術成果(證書編號2002—004),同玻璃微球及鈦合金相比，PLLA作為載體優勢主要體現在①生物降解性PLLA在治療期間有效提高局部藥物治療劑量，并逐漸降解，緩慢釋出的藥物兼治微轉移灶，而玻璃微球等只能發揮局部治療作用，且注入體內永久滯留，可引起相應器官的功能損害，加重組織纖維化；②并發癥少玻璃微球粒徑小，給藥后易分流至靶器官外(如正常肝、肺或返流入胃十二指腸動脈)引起肝功能衰竭、肺臟纖維化及消化道出血等并發癥，使放射性微球的使用劑量受到很大限制。目前尚無采用PLLA與^P-CP膠體相結合的放射性抗腫瘤藥物。
發明內容本發明的目的是提供一種放射性磷酸鉻膠體緩釋粒子。本發明的另一個目的是提供放射性磷酸鉻膠體緩釋粒子的應用。本發明的目的是通過下列技術措施實現的一種放射性緩釋粒子，該粒子主要由"P-磷酸鉻與聚L-乳酸組成。所述的放射性緩釋粒子，其中聚L-乳酸分子量為700012000Da。所述的放射性緩釋粒子，其中于"P-磷酸絡與聚L-乳酸的用量為每克聚L-乳酸結合放射性活度為375037500MBq(即100-1OOOmci)的3卞-磷酸鉻。所述的放射性緩釋粒子的制備方法，包括下列步驟將0.751.25gPLLA和1020mg硬脂酸鎂置入研磨器中，加入4.57.5ml放射性濃度為18755625MBq/ml的32P-CP膠體溶液，加入2~3ml無水乙醇，5(TC攪拌30min，干燥5h，研磨至粉末狀，壓制成顆粒。所述的放射性緩釋粒子在制備抗腫瘤的藥物中的應用。本發明的有益效果本發明以共混工序構成，以能夠體內生物降解的PLLA為載體，物理性均勻混入32P-CP膠體制備局部植入用放射性32P-CP-PLLA緩釋粒子。考察其理化性質及體外不同釋放介質中的釋出率，觀察正常小鼠緩釋粒子體內植入后的生物降解及放射性生物分布，了解放射性藥物分布及代謝動力學測定，放射性粒子胰腺癌荷瘤鼠模型瘤體內植入后不同時間點行SPECT顯像，分離瘤體及各臟器，進行放射性計數和瘤體組織形態學觀察。證實粒子理化性質穩定，具有良好的生物相容性和自身可降解性，30天粒子累計失重率達7%，放射性累計釋出約10%，"P-CP的緩慢釋出與載體PLLA的緩慢降解、粒子的溶蝕基本匹配同步，有效提高了放射性"P-CP在植入部位如瘤體內的分布，明顯提高植入部位/周圍組織(如瘤體/瘤周組織)放射性劑量分配比和植入部位(如瘤體內)放射性有效半減期，部分緩慢釋出的"P-CP可經淋巴引流入血而分布于肝臟和脾臟，其它臟器中放射性分布極少。瘤體生長抑制曲線存在著明顯量-效正相關關系，瘤體體積隨植入瘤體粒子放射性活度即組織吸收劑量的增加而減小，因此32P緩釋粒子劑型可通過增加粒子放射性劑量而增加植入局部療效及后續生物學效應，更有效地殺傷植入部位各種腫瘤細胞，由于射程短，對周圍組織電離作用較弱，對全身，尤其是對肝臟、脾臟和骨髓等重要臟器的毒副作用較小。本發明提供放射性32P-CP-PLLA緩釋粒子能較好地解決腫瘤治療中的定向給藥問題,將其植入瘤體或瘤周可增大局部藥物濃度、延長藥物的作用時間，減少全身性毒副作用。放射性32P-CP-PLLA緩釋粒子不改變32P的理化性質及其生物學效應，主要依靠32P在有效射程內的生物學作用，對P射線敏感的粒子周圍腫瘤細胞均產生較好的殺傷，可適用于已經實驗和臨床證明的原發性肝癌、胰腺癌、卵巢癌、腦膠質瘤、頭頸部腫瘤等實體瘤及其轉移灶的治療[5—8]。同時通過PLLA的降解、粒子的溶蝕，避免了現有籽源及玻璃微球的永久性植入及其嚴重合并癥，對實體瘤放射性核素間質近距離照射靶向治療具有巨大的應用優勢和前景。圖1是放射性^P-CP-PLLA緩釋粒子體外血清中釋出率曲線。圖2是放射性32P-CP-PLLA緩釋粒子體內累及失重率曲線。圖3是放射性^P-CP-PLLA緩釋粒子不同劑量組的瘤體生長抑制曲線。圖4是放射性"P-CP-PLLA緩釋粒子瘤體內植入瘤體組織形態學表現。光鏡下，瘤細胞體積增大、水腫；胞膜尚完整，核固縮、核碎裂、核溶解多見，且隨粒子放射性劑量的增大和時間的延長，上述改變愈顯著。a.(OMBq)空粒子對照組Pc-3瘤細胞排列致密、整齊；粒子瘤體實質植入后，b.(7.4MBq)細胞排列松散，部分細胞膜破裂，c.(37.5MBq)大部分腫瘤組織破壞，被纖維結締組織代替(HEX400)。具體實施例方式—.以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。—般性說明^P-CP由原子高科股份有限公司提供，是一種無菌、綠色膠體溶液，細菌內毒素含量〈15EU/ml，核純度>99.9%，放化純度^98%，粒度2050nm(60%)，放射性比活度^1850MBq/ml，PH6.08.0;PLLA，分子量7000，白色粉末狀，批號20000910，由合肥工業大學控釋室提供；顯像儀器為GEMillenniumVGHawkeye雙探頭SPECT儀，井型Y探測器購自合肥中佳公司；BS-110S型電子天平購自Sartorius公司；胰腺癌移植瘤模型由由上海腫瘤研究所實驗動物中心提供。實施例l:"P-CP-PLLA緩釋粒子的制備及其大體形態、粒徑考察。將0.751.25gPLLA和1020mg硬脂酸鎂置入研磨器中，加入4.57.5ml32P-CP膠體溶液(放射性濃度為18755625MBq/ml)，以2ml無水乙醇作為分散劑，恒溫(5(TC)攪拌器中低速(150r/min)攪拌30min，置入真空干燥箱干燥5h，在研磨器中將其研磨至粉末狀，壓制成放射性"P-CP-PLLA緩釋粒子。所得^P-CP-PLLA粒子規格如下粒子為淡綠色圓柱體形，直徑0.85mm0.9mm，長2.2mm2.5mm，形態圓整，表面有微小孔隙，質地硬，質量0.9-l.lmg/粒，放射性活度11.2537.5MBq/粒，單顆粒子分裝密封保存。實施例2:放射性^P-CP-PLLA緩釋粒子體外放射性釋出率研究。選擇90粒質量和放射性活度較均勻的"P-CP-PLLA緩釋粒子(質量為l士0.05mg，放射性活度為33.75il.6875MBq)，隨機分成9組，每組10粒，分別測定每組粒子總放射性活度，記為A(n.o)(n為組別，記為19組)，置于9只培養皿中，每3只培養皿為一組，分別加入釋放介質生理鹽水、1640培養液、人血清各5.0ml。將其置水浴振蕩器中，溫度37。C，振蕩頻率100次/min。于l、3、7、15、21、30天(由t表示，時間點記為16)各取培養皿中釋放介質l.Oml，通過增強型活度計測量放射性計數，記為B(n.t,，衰減校正后放射性活度記為C(n.『VB(n.t)(注按時間點16衰減校正系數X分別為0.953，0.865，0.712，0.483，0.361，0.233)，分別計算t時間點、第n組粒子放射性釋出率-粒子釋出放射性總量/初始粒子放射性總量，艮卩RR(n.t)^5CVt)+2:(V(t.D]VA(n.0)，然后補入1.0ml同溫度的新鮮釋放介質。結果見表1，單因素方差分析顯示三種釋放介質對"P-CP-PLLA粒子釋放率的影響無統計學差異(F=0.07，P=0.9373),在人血清中的體外時間一累計釋出率曲線見圖1。隨時間延長及PLLA的降解，粒子釋出率緩慢增加，前3d釋出率曲線斜率相對較大，考慮與粒子同介質接觸面積較大有關，以后減慢且釋出率持續較平穩，30d時合計釋出率近10%。結果顯示緩釋粒子理化性質穩定，體外放射性釋出緩慢，無明顯突釋現象，顯著提高局部^p劑量及滯留接觸時間，避免引流區域短時間內受到較強的輻射損傷。表l不同釋放介質中"P-CP-PLLA隨時間體外釋出率結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3:"P-CP-PLLA緩釋粒子小鼠體內植入生物降解及"P生物學分布。選BALB/c小鼠35只，體重20i2g，隨機分成7組，每組5只，測定并選擇質量和放射性活度較均勻的"P-CP-PLLA緩釋粒子35顆(質量為li0.05mg，放射性活度為33.75士1.6875MBq)，分別測定放射性計數并經皮穿刺法植入小鼠左后腿肌肉中，每鼠一粒，對小鼠體內粒子植入局部和全身一般情況進行動態觀察，并分別于植入后0.5、1、3、7、14、21、30d取一組小鼠眶靜脈取血1ml，然后脫頸椎處死，分別取心、肝、脾、肺、腎、胰腺、胃、腸、腦、右后腿肌肉、粒子周圍肌肉及股骨等主要臟器和組織，稱濕重并測定其放射性計數，放射性衰減校正后計算。/。ID/g(每克組織放射性計數/每只小鼠植入粒子放射性計數xl.OOX)。生物降解率用失重百分率表示，即分別取出粒子清潔表面，真空干燥箱內干燥至恒重，用電子天平稱重,按下式計算:失重百分率(。/。)^(w『Wt)/wo(式中w。和Wt分別為粒子初植入前重量和植入t時間時粒子的重量)。"P-CP-PLLA緩釋粒子肌肉植入后，觀察動物的飲食、植入部位活動情況及皮毛外觀均較好，體重無明顯變化。"P-CP-PLLA緩釋粒子植入體內后累計失重率曲線見圖2，0.5、1、3、7、14、21、30d均值分別為1.49。/。，2.51%，4.26%，5.28%，5.67%，6,72%，7.20%，表明PLLA在體內隨植入時間延長不斷降解。緩慢釋出的"P-CP小鼠體內生物分布結果見表2。由表2可見肌肉內植入"P-CP-PLLA后，30天時約90。/,P滯留在緩釋粒子植入靶點部位，有效半減期達13天，不同時間點釋出的"P-CP在小鼠體內主要分布于粒子周圍肌肉組織，其次是脾臟和肝臟，心臟、血液、肺臟、腎臟、腦、骨骼攝取量極少。結果顯示"P-CP-PLLA體內生物相容性、緩釋性能較好，放射性釋出與粒子生物降解率基本呈一致性變化，均處于較低水平，明顯增加植入靶點和正常組織劑量分配比和耙點部位有效半減期，對全身及重要臟器，尤其是對網狀內皮細胞豐富的肝臟、脾臟和骨髓等重要臟器的毒副作用較小。且粒子可在體內自身降解，避免了永久植入術等籽源體內永久滯留及嚴重并發癥的出現。表2"P-CP不同時間點各臟器的放射性攝取分數(3f土""=5)(%ID/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4:"P-CP-PLLA緩釋粒子荷人胰腺癌(Pc-3)間質植入放射性生物分布及劑量效應研究實驗42只荷瘤裸鼠，瘤體體積為(0.50±0.05)cm3(最長徑約lcm)，隨機平均分成7組，分別經皮瘤體間質植入"P-CP-PLLA粒子一顆，各組每只鼠平均植入粒子放射性活度分別為0MBq(空粒子組)、7.4MBq、14.8MBq、29.6MBq、37.5MBq、59.2MBq和74MBq，記為第17組，粒子植入后不同時間點通過SPECT軔致輻射顯像(低能通用型準直器，能峰70KeV，窗寬20%，采集時間20min)，觀察粒子植入后32P在小鼠體內生物分布情況。粒子植入后每隔2d，密切觀察瘤體表觀變化，并用游標卡尺測量各鼠瘤體兩個垂直方向上的最大徑(a、b)，按照公式V^^/2計算瘤體體積，繪制各劑量組的瘤體體積均值隨時間變化的腫瘤生長抑制曲線見圖3。21d小鼠脫頸椎處死，分離瘤體并制定組織切片，通過光鏡觀察瘤體細胞形態學改變。SPECT軔致輻射顯像可見放射性主要在植入部位(瘤體部位)聚集，瘤體以外組織未見明顯顯影，僅有極少的放射性分布，分別繪畫感興趣區，記錄放射性計數，計算相應部位放射性分布百分比，艮卩A。/F(At/2-""8)/A0xl00。/。。(Ao、At分別為O，t時感興趣區的放射性計數，t為粒子植入后時間，單位為天)，計算瘤體部位放射性有效半減期達13d。第25劑量組瘤體生長抑制曲線存在著明顯量-效正相關關系，瘤體體積隨植入瘤體粒子放射性活度即組織吸收劑量的增加而減小。"P通過輻射作用可明顯殺傷腫瘤細胞，瘤體縮小甚至消失，大體觀察見空粒子對照組瘤體增大明顯、質硬呈結節狀，表皮變薄、透亮，呈現為紅肉色，有的瘤體表皮發生潰瘍；27治療組的瘤體最早第7天開始表面發生淤血、潰破、結痂。光鏡下組織切片病理學檢査見圖4，第l組可見增生活躍的瘤細胞，Pc-3細胞排列緊密，血管豐富；粒子植入組顯示了不同程度的壞死、纖維化和包裹形成，第24組的平均瘤細胞壞死率逐漸增高，表現為大片凝固樣壞死或表現為殘存的瘤細胞排列松散或不松散，并出現分化較好的瘤細胞，第57組大部分腫瘤細胞被破壞由纖維結締組織所取代，瘤體日見縮小、干癟，結痂并最終脫落，光鏡下未見腫瘤組織。提示37.5MBq的劑量足以使直徑為lcm左右的腫瘤發生明顯壞死，在此基礎上，劑量的增加將不再引起壞死率的相應提高。對于體積較大的腫瘤，可采用多點粒子植入，以使腫瘤組織在一個較短的期間內接受到足夠的輻射能，達到迅速控制腫瘤生長的目的。"P-CP-PLLA粒子植入使植入部位腫瘤組織獲得較高的輻射量，而全身輻射劑量低，粒子植入能使放射性核素主要濃聚步較長時間滯留在Pc-3瘤組織內發揮直接殺傷作用。形態學檢查示大部分Pc-3細胞被破壞，并出現分化較好的瘤細胞。對腫瘤體積較大者，可通過增加粒子數目，射線射程內有效殺傷腫瘤細胞，而對射程以外周圍正常組織無損害作用。參考文獻1.DempkeW,FirusianN.Treatmentofmalignantpericardialeffusionwith32P-colloid.BrJCancer,1999,80:1955-1967.2.DeNittisAS,StambaughMD,LangP，etal.Completeremissionofnonesectablepancreaticcancerafterinfusionalcolloidalphosphorus-32brachytherapy，externalbeamradiationtherapy,and5-fluorouracil:preliminaryreport.AmJClinOncol，1999，22:355-360.3.FirusianN,DempkeW.AnearlyphaseIIstudyofintratumoralP-32chromicphosphateinjectiontherapyforpatientswithrefractorysolidtumorsandsolitarymetastases.Cancer,1999,85:980-987.4.鄭佳坤，林小聰，汪朝陽,等"P內放療加VM26灌注聯合治療55例腦腫瘤的療效觀察.實用癌癥雜志,2002,17:302-303.5.ZhangDS，LiuL,JinLQ，etal.Effectofphosphorus-32glassmicrospheresonhumanhepatocellularcarcinomainnudemice.WorldJGastroenterol.2004Junl;lO(l1):1551-4.6.AlimiKA，FirusianN，DempkeW.Effectsofintralesional32-Pchromicphosphateinrefractorypatientswithheadandnecktumours.AnticancerRes,2007Jul-Aug;27(4C):2997-3000.7.FirusianN，DempkeW.AnearlyphaseIIstudyofintratumoralP-32chromicphosphateinjectiontherapyforpatientswithrefractorysolidtumorsandsolitarymetastases.Cancer.1999Feb15;85(4):980-7.8.DaozhenC，LuL,GuanshengT,ZhiyongL，XudongL，YingH.Preventingandtreatinglymphaticminutemetastasiswith(32)p-chromicphosphateduringanoperation.CancerBiotherRadiopharm.2007Feb;22(l):24-32.9.高文，劉璐,尹其華，等"P膠體間質給藥在荷人胰腺癌裸鼠的體內生物學分布及形態學表現.中華放射醫學與防護雜志，2004,24(l):23-25.10.杜衛東,袁祖榮，倪泉興,等.5-氟尿嘧啶緩釋劑瘤內注射治療胰腺癌的實驗研究.外科理論與實踐,2004，9(3):204-207.11.任寧，吳志全,樊嘉，等.植入式絲裂霉素控釋劑的抑瘤作用.中華實驗外科雜志，2003,20(4):367-368.12.劉愛國，梅蔚德，許健健，等.緩釋植入化療藥物的臨床研究進展.癌癥進展雜志，2004,2(4):270-276.權利要求1、一種放射性緩釋粒子，其特征在于是該粒子主要由32P-磷酸鉻與聚L-乳酸組成。2、根據權利要求l所述的放射性緩釋粒子，其特征在于聚L-乳酸分子量為700012000Da。3、根據權利要求1所述的放射性緩釋粒子，其特征在于3卞-磷酸鉻與聚L-乳酸的用量為每克聚L-乳酸結合放射性活度為375037500MB的3￥-磷酸鉻。4、權利要求1所述的放射性緩釋粒子的制備方法，其特征在于包括下列步驟將0.751.25gPLLA和1020mg硬脂酸鎂置入研磨器中，加入4.57.5ml放射性濃度為18755625MBq/ml的32P-CP膠體溶液，加入2~3ml無水乙醇，5(TC攪拌30min，干燥5h，研磨至粉末狀，壓制成顆粒。5、權利要求1所述的放射性緩釋粒子在制備抗腫瘤的藥物中的應用。全文摘要本發明屬于放射醫學領域，公開了一種放射性緩釋粒子及其制備方法和應用。該粒子主要由³²P-磷酸鉻與聚L-乳酸組成。該粒子能較好地解決腫瘤治療中的定向給藥問題，將其植入瘤體或瘤周可增大局部藥物濃度、延長藥物的作用時間，減少全身性毒副作用。文檔編號A61P35/00GK101322849SQ20081002211公開日2008年12月17日申請日期2008年7月18日優先權日2008年7月18日發明者璐劉,李少華,杜同信,峰王,王自正,祁本忠,邵國強,黃培林申請人:王自正;劉璐;黃培林;祁本忠;王峰;李少華;杜同信;邵國強