專利名稱：：一種知母提取物及其作為治療2型糖尿病藥物的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及糖尿病藥物領域，具體涉及一種用于治療糖尿病的知母提取物。知母(RhizomaAnemarrhenae)為百合禾斗植物(Anemarriienaasphodeloides)的干燥根莖，其性味苦寒，有清熱瀉火、生津潤燥的功效，是一常用的苦寒清熱藥。現代研究表明，知母中含有的知母皂苷(timosaponin)、芒果苷(chimonin，mangiferin)及其葡糖苷和知母多糖(anemaran)從不同機制降低血糖，可用于治療非胰島素依賴型糖尿病。知母皂苷可通過恢復胰島3細胞功能，增強外周組織對胰島素的敏感性，抑制a-葡萄糖苷酶活性三種途徑實現對血糖水平的控制。知母多糖能降低正常小鼠及由四氧嘧啶型小鼠的血糖指標。知母多糖的降血糖作用與其增加肝糖元合成、減少肝糖元分解、增加骨骼肌對葡萄糖攝取等因素有關。此外,醛糖還原酶(AR)在糖性白內障的發病中起著關鍵作用，還與糖尿病引起的角膜、視神經及外周神經的病變有關。知母多糖可作為醛糖還原酶(AR)抑制劑，緩解糖尿病的并發癥狀。芒果苷及芒果苷-7-O-3-糖苷對正常小鼠血糖無影響，但可降低KK-Ay小鼠血糖并且有降低血清胰島素水平的趨勢，其降糖機制可能是降低胰島素抵抗性。并且芒果苷在2型糖尿病中，對高脂血癥有益且可作為抗凝血藥用于心肌梗死的治療。
發明內容本發明的目的在于提供一種對2型糖尿病具有治療作用的知母提取物。本發明的另一個目的在于提供上述知母提取物在制備治療或預防2型糖尿病藥物中的應用。本發明的知母提取物，由如下方法制備而成(1)知母粉碎后，用612倍體積10%90%乙醇溶液提取13次，每次l3h，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏l;(10%90%乙醇溶液是指體積百分數，下述的乙醇溶液均是指體積百分數)(2)取稠膏l，以612倍體積水溶解，上大孔樹脂柱，以35個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；以40%80%乙醇溶液洗脫48個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，過濾，將沉淀干燥粉碎，得提取物l，即為知母提取物。為了提高提取效率，在上述知母提取物制備方法中，可將醇提取后的殘渣進一步用水提取，具體步驟如下所示(l)知母粉碎后，用612倍體積10%90%乙醇溶液提取13次，每次13h，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏1;過濾后殘渣加612倍體積水提取13次，每次l3h，趁熱過濾，合并濾液，濃縮得稠膏2;(2)取稠膏l，以612倍體積水溶解，上大孔樹脂柱，以35個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；以40%80%乙醇溶液洗脫48個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，過濾，將沉淀干燥粉碎，得提取物l;(3)取稠膏2，加1020倍體積水溶解，超濾，取截留液，濃縮干燥，得提取物2;所述超濾是采用超濾膜裝置及截留分子量10000300000的超濾膜進行超濾；(4)合并提取物l、2，即得知母提取物。上述制備方法得到的知母提取物1，主要含有皂苷類和雙苯吡酮兩類成分，且含量大于50%。知母提取物2，主要含有知母多糖類成分，且含量大于50%。本發明所述的知母提取物主要含有以下三類成分中的至少二類，此三類成分包括知母皂苷AI、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷AIV、知母皂苷BI、知母皂苷BII、知母皂苷BIII等皂苷類，知母多糖A、B、C、D等多糖類及芒果苷和芒果苷-7-O-P-糖苷等雙苯吡酮類，且這些有效成分總含量在50%與100%之間。本發明的知母提取物可制成片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋劑、注射劑等各種劑型的藥物，用來治療或預防糖尿病及其并發癥。經動物實驗證實，該知母提取物具有抑制小腸上皮a-葡萄糖苷酶的活性，增加靶細胞胰島素受體數目，改善靶細胞對胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗，促進胰島素分泌和降低血糖等功效。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明的知母提取物通過保護、修復胰島內分泌細胞而增加血清胰島素濃度，并增加肝糖元含量，競爭性地抑制小腸上皮a-葡萄糖苷酶的活性，從而延緩腸道對糖的吸收，起到降糖的作用；通過增加耙細胞胰島素受體數目，改善靶細胞對胰島素敏感性，從而減輕胰島素抵抗；并且對白內障、高血脂和心血管方面的糖尿病并發癥有防治作用，因此可制備成治療或預防2型糖尿病及其并發癥的藥物，具有很大的醫藥價值和經濟效益。圖1為知母提取物對a-葡萄糖苷酶活性影響的曲線圖。具體實施方式實施例l制備知母降糖片(1)將知母藥材粉碎，用8倍體積量的80%乙醇提取2次，每次lh，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏l。(2)取稠膏1，用8倍體積量水溶解，上大孔樹脂柱，以5個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液。以50%乙醇溶液洗脫8個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，靜置，析出沉淀，過濾，將沉淀千燥粉碎，得提取物l，即知母提取物。(3)稱取250g上述知母提取物，加入250g硫酸鈣、10g交聯聚維酮混勻。以適量80%乙醇作潤濕劑制成軟材，以14目篩制粒，于6(TC溫度下干燥后過12目篩整粒，加入10g交聯聚維酮及3g硬脂酸鎂混勻后，制成1000片。實施例2制備知母降糖片(1)將知母藥材粉碎，以8倍體積量80%乙醇提取2次，每次lh，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏l;過濾后殘渣加8倍體積量水提取2次，每次l，趁熱過濾，合并濾液，濃縮得稠膏2。(2)取稠膏l，以8倍體積量水溶解，上大孔樹脂柱，以5個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液。以50%乙醇洗脫8個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，靜置，析出沉淀，過濾，將沉淀干燥粉碎，得提取物l。(3)取稠膏2，加20倍體積量水溶解，應用超濾膜裝置及截留分子量300000的超濾膜進行過濾，取截留液，濃縮干燥，得提取物2。(4)合并提取物1和提取物2，即得知母提取物。(5)稱取250g上述知母提取物，加入250g硫酸鈣、10g交聯聚維酮混勻。以適量80%乙醇作潤濕劑制成軟材，以14目篩制粒，于6(TC溫度下干燥后過12目篩整粒，加入10g交聯聚維酮及3g硬脂酸鎂混勻后，制成1000片。實施例3制備知母降糖膠囊(1)將知母藥材粉碎，以10倍體積量80%乙醇提取2次，每次lh，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏1;過濾后殘渣加10倍體積量水提取2次，每次l，趁熱過濾，合并濾液，濃縮得稠膏2。(2)取稠膏1，以8倍體積量水完全溶解，上處理好的大孔樹脂柱。以3個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液。以60%乙醇洗脫6個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，靜置，析出沉淀，過濾，將沉淀干燥粉碎，得提取物1。(3)取稠膏2，加10倍體積量水溶解，應用超濾膜裝置及截留分子量100000的超濾膜進行過濾后，取截留液，濃縮干燥，得提取物2。(4)合并提取物1和提取物2，即得知母提取物。(5)稱取250g上述知母提取物，加入250g硫酸鈣、10g交聯聚維酮混勻。以適量80%乙醇作潤濕劑制成軟材，以14目篩制粒，于6(TC溫度下干燥后過12目篩整粒，填入空膠囊中，即得。實施例4知母提取物對葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，格列苯脲(山西三晉藥業有限公司，批號20021016)，葡萄糖注射液(江西東亞藥業有限責任公司，批號2003092732)，血糖測定試劑盒(保定長城臨床試劑公司，批號991514)。2、方法取健康小鼠80只，雌雄各半，隨機分為正常對照組、模型組、格列苯脲組、知母提取物低、中、高劑量組(分別為50，100，150mg/kg)。連續灌胃給藥7d，正常對照組和模型組給予等劑量生理鹽水，格列苯脲組罐胃50mg/kg。末次給藥前禁食3h，給藥后30min腹腔注射葡萄糖注射液，劑量為2g/kg，造成高血糖模型，30min后眼眶取血，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值，結果見表l。表l知母提取物對葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影響組別劑量(mg/Kg)血糖(mmol/L)正常對照組-5.30±0.94*模型對照組-11.81±1.03知母提取物組507.65±1.77**1007.32±2.87**1506.61±1.11**格列苯脲組508.91±2.84*注與模型對照組比較，*P<0.01,**P<0.001。實施例5知母提取物對葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，格列苯脲(山西三晉藥業有限公司，批號20021016)，葡萄糖注射液(江西東亞藥業有限責任公司，批號2003092732)，血糖測定試劑盒(保定長城臨床試劑公司，批號991514)。2、方法取健康小鼠80只，雌雄各半，隨機分為正常對照組、模型組、格列苯脲組、知母提取物低、中、高劑量組(分別為50，100，150mg/kg)。連續灌胃給藥7d，正常對照組和模型組給予等劑量生理鹽水，格列苯脲組罐胃50mg/kg。末次給藥前禁食3h，給藥后30min腹腔注射葡萄糖注射液，劑量為2g/kg，造成高血糖模型，30min后眼眶取血，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值，結果見表2。表2知母提取物對葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與模型對照組比較，*P<0.01,**P<0.001。實施例6知母提取物對鏈尿佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，優降糖(天津力生制藥廠生產，批號990203)，鏈尿佐菌素(Sigma公司生產)，血糖測定試劑盒(保定長城臨床試劑公司，批號991516)。2、方法取健康雄性小鼠80只，隨機選取10只作為正常對照組，其余70只禁食12h，按50mg/kg體重的劑量腹腔注射鏈尿佐菌素，正常對照組注射檸檬酸緩沖液，于造模后l周測定空腹血糖值，篩選血糖值超過Bmmol/L的小鼠為實驗模型鼠。將50只糖尿病實驗模型鼠隨機分為糖尿病模型組，優降糖(灌胃20mg/kg)，知母提取物低、中、高劑量組(分別為50，IOO，150mg/kg)。正常對照組和糖尿病模型組灌胃生理鹽水，連續給藥3周。末次給藥后禁食12h，眼眶取血，測血糖變化值，結果見表3。表3知母提取物對鏈尿佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注與模型對照組比較，*P<0.01,**P<0.05。實施例7知母提取物對四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，優降糖(天津力生制藥廠生產，批號990203)，四氧嘧啶(Sigma公司生產)，血糖測定試劑盒(保定長城臨床試劑公司，批號991514)。2、方法雄性昆明種小鼠80只，實驗前禁食12小時，隨機選取10只作為正常對照組，其余尾靜脈注入四氧嘧啶90mg/Kg，72小時后側血糖值，選其中50只血糖值〉13mmol/L者作為糖尿病小鼠。糖尿病小鼠隨機分為知母提取物高、中、低三個劑量組(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)。模型對照組，優降糖陽性對照組(20mg/Kg)，使各組的血糖值均數之間無顯著性差異，每組10只。各組每天灌胃給藥或生理鹽水，連續21天，于末次給藥后1小時從小鼠眼眶取血，葡萄糖氧化酶法測血糖值，結果見表4。由表4可知，給藥組血糖與模型對照組相比顯著降低(PO.Ol)，且血糖下降與知母提取物呈劑量依賴性。表4知母提取物對四氧嘧啶誘發糖尿病小鼠的血糖影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注與正常對照組比較，厶APO.01;與模型對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。實施例8知母提取物對四氧嘧啶糖尿病小鼠的肝糖元含量的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，優降糖(天津力生制藥廠生產，批號990203)，四氧嘧啶(Sigma公司生產)。2、方法雄性昆明種小鼠80只，實驗前禁食12小時，隨機選取10只作為正常對照組，其余尾靜脈注入四氧嘧啶90mg/Kg，72小時后側血糖值，選其中50只血糖值〉13.8mmol/L者作為糖尿病小鼠。糖尿病小鼠隨機分為知母提取物高、中、低三個劑量組(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)。模型對照組，優降糖陽性對照組(20mg/Kg)，使各組的血糖值均數之間無顯著性差異，每組10只。各組每天灌胃給藥或生理鹽水，連續21天，于末次給藥1小時后斷髓處死，按硫酸-蒽酮法，測定肝糖元含量，結果如表5所示表5知母提取物對四氧啼啶糖尿病小鼠的肝糖元含量的影響組別劑量(mg/Kg)肝糖元含量(mg/g)正常對照組-38.21±1.65模型對照組-18.67土1.47AA5021.28±2.28*知母提取物組10023.37±4.18**15027.49±4.24**優降糖組2026.67±4.75**注與正常對照組比較，AAP〈0.01;與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。實施例9知母總提取物對四氧嘧啶糖尿病小鼠的血胰島素和胰島組織形態學的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，四氧嘧啶(Sigma公司生產)，蒽酮試劑(上海五聯化工廠，批號9806)。2、方法雄性昆明種小鼠60只，實驗前禁食12小時，隨機選取10只作為正常對照組，其余尾靜脈注入四氧嘧啶90mg/Kg，72小時后側血糖值，選其中30只血糖值》3.8mmol/L者作為糖尿病小鼠。糖尿病小鼠隨機分為知母提取物高低兩個劑量組(50mg/Kg，150mg/Kg)及模型對照組，每組10只。各組每天灌胃給藥或生理鹽水，連續21天，于末次給藥1小時后斷髓處死，分別隨機從各組中取3只小鼠胰腺尾部組織，使用Gormori醛復紅和H.E染色方法，觀察胰島組織。觀察結果見表5。可見知母提取物對被四氧嘧啶破壞的胰島分泌細胞有一定的修復作用，并增加了胰島e細胞的分泌顆粒。結果見表6:表6胰島組織的形態學變化組別Gormori醛復紅染色H.E染色<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>知母提取e細胞的分泌顆粒增多，但顆粒稀e細胞形態結構較模型物組低劑疏，排列不均勻組有所改善，核仁較大且量組較少知母提取e細胞的分泌顆粒增多，顆粒濃密，e細胞形態結構接近正物組高劑核仁清晰且較大常，胞漿均勻，無空泡，量組仍有腫脹現象實施例10知母提取物對a-葡萄糖苷酶的活性的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，阿卡波糖(德國拜耳醫藥保健有限公司，批號101H6)，4-硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Merck公司)a-D-葡萄糖苷酶(Fluka公司)。2、方法將知母提取物和阿卡波糖溶于DMSO緩沖液，并稀釋為不同濃度(10-400mg/ml)的藥液，與2U/ml葡萄糖苷酶10ul混勻，于37。C溫育15min，加入lO血nol/LPNPG90P1，于37。C溫育15min，在410nm波長下測定A值，以上反應在96孔板上完成，反應總體積為200"1。每個供試品同時做3復孔，取平均值，并重復3次實驗。阿卡波糖作為本法的陽性對照，同時設定空白對照和陰性對照。計算酶活性的抑制率:抑制率氣A陰性對照-A供試品)/(A陰性對照-八空白對照)*100%。以濃度(mg/ml)的對數做橫坐標，抑制率做縱坐標作圖，結果如圖l所示。實施例ll知母提取物對正常小鼠血糖的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，血糖測定試劑盒(保定長城臨床試劑公司，批號991518)。2、方法正常小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組正常對照組，灌胃生理鹽水；高、中、低劑量組(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)分別灌胃知母提取物，l次/d，連續用藥3周。末次給藥3h后眼眶取血，葡萄糖氧化酶法測血糖值，結果如表7所示，知母提取物低、中、高劑量組均能使血糖降低，表7知母提取物對正常小鼠血糖的影響組別劑量(mg/Kg)血糖濃度(mmol/L)正常對照組-9.57±1.75508.08±3.34*知母提取物組1007.95±2.37*1507.14±3.64**注與正常對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。實施例12知母提取物對正常小鼠糖耐量的影響1、材料知母提取物(按實施例2制備)，阿卡波糖(德國拜耳醫藥保健有限公司，批號101176)，昆明種小鼠(廣東藥學院藥理教研室提供)，血糖測定試劑盒(保定長城臨床試劑公司，批號991516)。2、方法取健康成年雄性小鼠50只，禁食2小時，隨機分成5組正常對照組、阿卡波糖組和知母提取物的高中低三個劑量組(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)，每組10只，使各組的血糖無顯著性差異。各給予相應劑量一次后，以10kg/kg劑量淀粉灌胃，給淀粉3小時后，眼眶采血側空腹血糖。結果如表8所示表8知母提取物對正常小鼠血糖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注與正常對照組比較，*P<0.01，**P<0.05。權利要求1.一種知母提取物，其特征在于由如下方法制備而成(1)知母粉碎后，用6～12倍體積10％～90％乙醇溶液提取1～3次，每次1～3h，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏1；(2)取稠膏1，以6～12倍體積水溶解，上大孔樹脂柱，以3～5個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；以40％～80％乙醇溶液洗脫4～8個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，過濾，將沉淀干燥粉碎，得提取物1，即為知母提取物。2.如權利要求1所述的知母提取物，其特征在于由如下方法制備而成(1)知母粉碎后，用612倍體積10%90%乙醇溶液提取13次，每次l3h，放冷后過濾，合并濾液，濃縮得稠膏l;過濾后殘渣加612倍體積水提取13次，每次13h，趁熱過濾，合并濾液，濃縮得稠膏2;(2)取稠膏1，以612倍體積水溶解，上大孔樹脂柱，以35個柱體積蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；以40%80%乙醇溶液洗脫48個柱體積，洗脫液濃縮至無醇，過濾，將沉淀干燥粉碎，得提取物1;(3)取稠膏2，加1020倍體積水溶解，超濾，取截留液，濃縮干燥，得提取物2;(4)合并提取物l、2，即得知母提取物。3.如權利要求2所述的知母提取物，其特征在于步驟(3)中所述的超濾是采用超濾膜裝置及截留分子量10000300000的超濾膜進行超濾。4.權利要求1所述知母提取物在制備治療或預防2型糖尿病藥物中的應用。全文摘要本發明公開一種知母提取物及其作為治療2型糖尿病藥物的應用。本發明是將知母藥材用水和含水乙醇提取后，用膜分離技術、大孔吸附樹脂分離，精制知母提取物。本發明的知母提取物的主要活性為知母皂苷類、知母多糖類和雙苯吡酮類中的三類或任意兩類，且主要活性成分的總含量高達50％以上。本發明的知母提取物經藥理實驗證明可作為治療或預防2型糖尿病及其并發癥的藥物，具有很大的醫藥價值和經濟效益。文檔編號A61K36/8964GK101229316SQ20081002620公開日2008年7月30日申請日期2008年1月31日優先權日2008年1月31日發明者馮毅凡,妍吳,青孟,石忠峰,郭曉玲申請人:廣東藥學院