專利名稱：一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根及其培養技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥。具體涉及一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根SAwHrl及其培養 技術。
背景技術：
丹參(Sa/v^/m'Wwr&加Bunge)是常用中藥，其藥用部位為根。丹參及以丹參為 主的中藥制劑是臨床治療心血管系統疾病的首選藥之一。除用于飲片外，丹參還是復方 丹參滴丸、復方丹參片、丹參注射液等很多種中成藥的主要原料。
丹參的主要活性成分有丹參酮等二萜醌類化合物和丹酚酸等水溶性酚酸類化合物。 丹酚酸類化合物的藥用價值越來越受到重視，目前已分離的丹酚酸類化合物有二十幾 種，均具有很強的抗過氧化和清除自由基的功能。丹酚酸B鎂鹽作為抑制肝纖維化和 肝硬化的二類新藥己獲得中國國家專利；以丹酚酸B為主要成分的注射用丹參多酚酸 鹽作為治療冠心病和心絞痛的藥物效果顯著；此外，丹酚酸在治療腦血管病基礎與臨床 研究中表現出獨特的作用效果啟示丹酚酸有望成為抗腦缺血理想藥物。由此可見，丹 酚酸作為治療肝病、心血管疾病和抗腦缺血的有效藥物進入臨床使用，對丹酚酸原料的 需求將會迅猛增加。
若單純依賴丹參的大面積栽培來提取丹酚酸類化合物，不僅占用了耕地，也增大了 提取成本。因此，怎樣應用中藥生物技術，利用丹參毛狀根提高和生產丹酚酸類藥用資 源，是緩解藥材資源壓力的有效途徑。另一方面，這樣對降低丹酚酸制劑的生產成本、 提高制劑質量也具有重要意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是研究設計能獲得穩定產生多種酚酸類化合物的丹參毛 狀根株系，提供高含量丹酚酸制劑的生產原料。
本發明提供了一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根SmHrl。該毛狀根(Hairy root)是本發明人首次由發根農桿菌侵染丹參葉片誘導獲得，因其來源于丹參(S"/v/a w/Wo/T/ /za Bunge),故命名為SmHrl。丹參毛狀根SwHrl在固體培養基和液體培養基 中均呈褐色毛發狀，固體培養時形態略粗壯。其生長失去向地性，且能在不添加任何激
5素的MSOH固體培養基及MSOH液體培養基(配方見實施例1)中持續穩定生長繁殖。 并能穩定合成多種丹酚酸類化合物。
本發明的另一 目的是提供了上述丹參毛狀根SmHrl的培養方法。
該方法包括下列步驟
(1) 應用YMB液體培養基培養的發根農桿菌(v4gro6a"eWww r/^ogem/s)侵染野 生型丹參(Sa/v/a m/Wo廳/H'za Bunge)葉片，在MSOH固體培養基中進行培 養，以篩選獲得丹參毛狀根S附Hrl;
(2) 將毛狀根SwHrl在MSOH固體培養基(配方見實施例l)， 25°C，黑暗靜置 培養3 5周后，選取長勢較為粗壯鮮嫩的毛狀根轉接到MSOH液體培養基(配 方見實施例l)中25'C，黑暗，120rpm水平回旋振蕩培養2 4周；再選取 長勢良好的毛狀根轉接到MSOH固體培養基中培養；如此反復，進行3 5次 交替繼代培養，篩選到在MSOH液體培養基中生長快速、遺傳穩定、并能穩 定產生多種酚酸類成分的丹參毛狀根株系SmHrl;
(3) 應用持續液體繼代培養(即液體培養基中培養的毛狀根轉接到液體培養基持 續培養的方法)、接種14天后在培養基中添加茉莉酸甲酯，使其終濃度為5 30nM，提高丹參毛狀根的生長量積累及藥用成分丹酚酸類化合物的含量。
YMB液體培養基組成(g/L)
Manitol 10
Yeast Extract 0.4
NaCl 0.1
MgS04 7H20 0.2
K2HP04 0.5 用NaOH和HC1調pH至7.2后于12rC高莊滅菌。
MSOH固體培養基組成(mg/L)
(1) 大量元素
KN03 1，900
CaCl2 2H20 440
MgS04 7H20 370
KH2P04 170
(2) 微量元素
KI 0.83 H3B03 6.2MnS04 4H20 22.3
ZnS04 7H20 8.6
Na2Mo04 2H20 0.25
CuS04 5H20 0.025
CoCl2 6H20 0.025
(3) Fe鹽
Na2EDTA 2H20 37.3
FeS04 7H20 27.8
(4) 有機元素
肌醇 100
煙酸 0.5
鹽酸吡眵醇 0.5
鹽酸硫酸胺素 0.4
甘氨酸 2.0 用NaOH和HCl調pH5.8后，添加2%瓊脂粉，于12rC高壓滅菌。
MSOH液體培養基組成(mg/L)
(1) 大量元素
KN03 1，900
CaCl2 2H20 440
MgS04 7H20 370
KH2P04 170
(2) 微量元素
KI 0.83
H3B03 6.2
MnS04 4H20 22.3
ZnS04 7H20 8.6
Na2Mo04 2H20 0.25
CuS04 5H20 0.025
CoCl2 6H20 0.025
(3) Fe鹽
Na2EDTA 2H20 37.3
FeS04 7H20 27.8
(4) 有機元素
肌醇 100
煙酸 0.5鹽酸吡哆醇 0.5 鹽酸硫酸胺素 0.4 甘氨酸 2.0 用NaOH和HC1調pH5.8后于121"C高壓滅菌。
本發明丹參毛狀根SwHrl在本發明的培養方法下，接種培養21天生長量積累達到 1.05士0.06g (干重)；丹酚酸B含量為4.57士0.85W (干重)，與中國四川中江地區一年 生野丹參生藥材含量相當，后者含量為6.25±0.08% (干重)；迷迭香酸含量為4.67±0.09 % (干重)，遠高于中國四川中江地區一年生野丹參生藥材中迷迭香酸含量，后者為 0.49±0.08% (干重)；多次LC-MS初步確定為丹酚酸K和丹酚酸L的兩種化合物，以 吸收峰與之相近的丹酚酸B為內參，HPLC測得其含量分別為7.98±0.63%和 0.92±0.09%，均遠遠高于野丹參(見表一)。
應用本發明的丹參毛狀根SmHrl及本發明的培養方法可以顯著提高丹參毛狀根的 生長量積累及藥用成分丹酚酸類化合物的含量，從而為大規模生產這些化合物提供了高 產的株系及培養方法，將有利于提高以丹酚酸類化合物為主要成分的藥用制劑純度，降 低其生產成本，促進工業化生產。
表l丹參毛狀根S/nHrl與野丹參中酚酸類成分含量比較
丹酚酸B(mg/mg迷迭香酸(mg/mg丹酚酸K (mg/mg干丹酚酸L (mg/mg千生長時期
干重％)干重％)重％) **《 胸
丹參毛狀根SwHrl4.57±0.85%*4.67±0.09%*7.98±0.63%*0.92±0.09%*21天
四川中江野丹參6.25±0.08%*0.49±0.08%*未檢測到未檢測到一年
*數據均為三批次樣品測定結果。
**丹酚酸K、 L含量以丹酚酸B為內參進行計算。
表2丹參毛狀根SmHrl不同培養基中培養21天生長量及酚酸類成分含量比較
生長量(g干重)丹酚酸B(mg/mg迷迭香酸(mg/mg丹酚酸K (mg/mg干丹盼酸L (mg/mg
啊重％) **干重％) **
MSOH+茉莉酸甲酯1.05±0.06*4.57±0.85%*4.67±0.09%*7,98±0.63%*0.92±0.09%*
MSOH'0.94±0.12*3.95±0.03%*4.51±0.03%*4.83±0.06%*1.06±0.05%*
*數據均為三批次樣品測定結果。
**丹酚酸K、 L含量以丹酚酸B為內參進行計算。
丹參毛狀根中酚酸類成分LC-MS鑒別 色譜柱Discovery C18 (250mmx4.6畫x5nm) Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測器m/z 555.2質譜裂解為555—537—493—295—159.2 t , 109.2, 267.3, 277.3 推測為丹酚酸(Salvianolic acid ) K，結構為
/m/z717，質譜裂解為717—519—339 推斷可能為丹酚酸(Salvianolic acid ) L，結構為:


圖1丹參毛狀根SmHrl液體培養3周時照片。 圖2丹參毛狀根SmHrl固體培養5周時照片。 圖3LC-MS全離子流圖。 圖4 LC-MS m/z 537.3， 555.2選擇離子流圖。
圖5—9 tR 22.11 min,推測為丹酚酸K的LC-MSn色譜圖(圖5-9分別為MSl、 MS2、 MS3、 MS4、 MS5: 555—537—493—295—159.2 t ， 109.2, 267.3， 277.3)。
圖10tR29.53，迷迭香酸的LC-MS圖i普(MS2: 359—161， 179， 197, 223)。 圖11 一12 tR 32.6，丹酚酸B的LC-MS圖譜(圖11 、 12分別為MS2、MS3: 717—519—321 )。 圖13 — 14 tR 36.47推斷可能為Salvianolic acid L (圖13、 14分別為MS2、 MS3: 717—519—339)。
圖15丹酚酸類化合物HPLC—DAD圖譜(A、 B:丹參毛狀根SmHrl培養21天時HPLC 圖譜。A: MSOH培養2周后加入MJ，生藥濃度8.120mg/mll; B: MSOH培養，生藥濃 度8.200mg/ml;) C:四川中江一年生野丹參HPLC圖譜(生藥濃度9.885mg/ml);上樣
量均為l(Hll 。圖譜中峰l:丹酚酸K， 2:迷迭香酸，3:丹酚酸B, 4:丹酚酸L)
具體實施例方式
實施例
10YMB液體培養基組成(g/L)
Manitol 10
Yeast Extract 0.4
NaCl 0.1
MgS04 7H20 0.2
K2HP04 0.5 用NaOH和HCl調pH至7.2后于121。C高壓滅菌。 MSOH固體培養基組成(mg/L)
(1) 大量元素
KN03 1,900
CaCl2 2H20 440
MgS04 7H20 370
KH2P04 170
(2) 微量元素
KI 0.83
H3B03 6.2
MnS04 4H20 22.3
ZnS04 7H20 8.6
Na2Mo04 2H20 0.25
CuS04 5H20 0.025
CoCl2 6H20 0.025
(3) Fe鹽
Na2EDTA 2H20 37.3
FeS04 7H20 27.8
(4) 有機元素
肌醇 100
煙酸 0.5
鹽酸吡哆醇 0.5
鹽酸硫酸胺素 0.4
甘氨酸 2.0 用NaOH和HCl調pH5.8后，添加2%瓊脂粉，于121""C高壓滅菌。
MSOH液體培養基組成(mg/L) (1)大量元素
KNO3 1,900 CaCl2 2H20 44MgS04 7H20 370
KH2P04 170
(2) 微量元素
KI 0.83
H3B03 6.2
MnS04 4H20 22.3
ZnS04 7H20 8.6
Na2Mo04 2H20 0.25
CuS04 5H20 0.025
CoCl2 6H20 0.025
(3) Fe鹽
Na2EDTA 2H20 37.3
FeS04 7H20 27.8
(4) 有機元素
肌醇 100
煙酸 0.5
鹽酸吡眵醇 0.5
鹽酸硫酸胺素 0.4
甘氨酸 2.0
用NaOH和HC1調pH5.8后于121'C高壓滅菌。
實施例2
丹參毛狀根獲得
(1) 發根農桿菌的準備 從平板上挑取發根農桿菌LBA9402單菌落，接種到YMB液體培養基中，28°C，
250rpm水平回旋振蕩培養2天。
(2) 侵染-
從無菌苗上取下葉片，醫用剪刀將葉片剪成化盤；將上述過夜培養的發根農桿菌菌 液稀釋10倍；將葉盤放入稀釋的農桿菌懸液中浸5min后，無菌濾紙吸去葉盤上多余 的農桿菌，放在MSOH固體培養基上25。C靜置暗培養2天。
(3) 轉化體篩選將發根農桿菌侵染過的葉片轉接到MSOH固體培養基，于25'C暗培養；l周后， 在葉盤切口周圍長出毛狀根；毛狀根生長到2cm左右時剪下轉入含有500/L頭孢霉素 的MSOH固體培養基中。3周后轉接到含400mg/L頭孢霉素的MSOH固體培養基；4 周后轉移到MSOH固體培養基中。
(4) 毛狀根的固體培養 毛狀根轉接到新配制的MSOH固體培養基上，于25'C靜置暗培養，每3周繼代一
次，備用。
(5) 毛狀根的液體培養
稱取固體培養基中生長旺盛的毛狀根0.5g接種到盛有100ml MSOH液體培養基的 250ml三角燒瓶中，黑暗，25°C， 120rpm水平回旋振蕩培養。
(6) 茉莉酸甲酯誘導培養
液體培養毛狀根生長2周后，加入茉莉酸甲酯使其終濃度為5pM，繼續振蕩培養8
天。 實施例3
丹參毛狀根獲得
(1) 發根農桿菌的準備
從平板上挑取發根農桿菌LBA9402單菌落，接種到YMB液體培養基中，28°C， 250rpm水平回旋振蕩培養2天。
(2) 侵染
從無菌苗上取下葉片，醫用剪刀將葉片剪成葉盤；將上述過夜培養的發根農桿菌菌 液稀釋10倍；將葉盤放入稀釋的農桿菌懸液中浸5min后，無菌濾紙吸去葉盤上多余 的農桿菌，放在MSOH固體培養基上25'C靜置暗培養2天。
(3) 轉化體篩選-
將發根農桿菌侵染過的葉片轉接到MSOH固體培養基，于25'C暗培養；IO天后， 在葉盤切口周圍長出毛狀根；毛狀根生長到2cm左右時剪下轉入含有500/L頭孢霉素 的MSOH固體培養基中。4周后轉接到含300mg/L頭孢霉素的MSOH固體培養基中； 3周后轉移到MSOH固體培養基中。(4) 毛狀根的固體培養 毛狀根轉接到新配制的MSOH固體培養基上，25°0靜置暗培養，每4周繼代一次，備用。
(5) 毛狀根的液體培養
稱取固體培養基中生長旺盛的毛狀根i.Og接種到盛有100ml MSOH液體培養基的 250ml三角燒瓶中，25。C黑暗，120rpm水平回旋振蕩培養。
(6) 茉莉酸甲酯誘導培養
液體培養毛狀根生長2周后，加入茉莉酸甲酯使其終濃度為15pM，繼續振蕩培養 8天。
實施例4
丹參毛狀根獲得
(1) 發根農桿菌的準備
從平板上挑取發根農桿菌LBA9402單菌落，接種到YMB液體培養基中，28°C， 250rpm水平回旋振蕩培養2天。
(2) 侵染
從無菌苗上取下葉片，醫用剪刀將葉片剪成葉盤；將上述過夜培養的發根農桿菌菌 液稀釋10倍；將葉盤放入稀釋的農桿菌懸液中浸5min后，無菌濾紙吸去葉盤上多余 的農桿菌，放在MSOH固體培養基上25'C靜置暗培養2天。
(3) 轉化體篩選
將發根農桿菌侵染過的葉片轉接到MSOH固體培養基，于25'C暗培養；l周后， 在葉盤切口周圍長出毛狀根；毛狀根生長到2cm左右時剪下轉入含有500/L頭孢霉素 的MSOH固體培養基中。4周后轉接到含300mg/L頭孢霉素的MSOH固體培養基中； 3周后轉移到MSOH固體培養基中。
(4) 毛狀根的固體培養 毛狀根轉接到新配制的MSOH固體培養基上，25'C靜置暗培養，每5周繼代一次，
備用c
(5) 毛狀根的液體培養稱取固體培養基中生長旺盛的毛狀根0.5g接種到盛有100ml MSOH液體培養基的 250ml三角燒瓶中，25。C黑暗，120rpm水平回旋振蕩培養。 (6)茉莉酸甲酯誘導培養
液體培養毛狀根生長2周后，加入茉莉酸甲酯使其終濃度為30pM，繼續振蕩培養 8天。
實施例5
丹參毛狀根中酚酸類成分LC-MS鑒別
色譜柱Discovery C18 (250mmx4.6mmx5nm)
Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測器
檢測波長280nm;柱溫25°C;流速lml/min;進樣量
流動相A-乙腈B-水乙腈甲酸(90: 10: 0.4) 梯度條件
時間A的比例B的比例
Omiii0100%
40min30%70%
MS分析應用帶有Xcalibur工作站的離子阱僅器。MS以及多級MS分析選用負離 子模式，在以下條件下進行毛細管電壓19V，噴霧電壓4.5V,毛細管溫度30(TC，鞘 氣流速20Arb，輔助氣流速5Arb，全掃描質譜范圍母離子為附/zlO(M000，子離子為 w/z50-500。HPLC以及LC-MS數據分析采用儀器隨帶的Finnigan Xcalibur 1.3軟件進行。
實施例6
丹參毛狀根中酚酸類成分HPLC含量測定
(1) 酚酸類成分提取方法
丹參毛狀根冷凍干燥后，在自封袋內搓成大約30 80目的細粉，混勻后，稱取大 約0.08g左右的樣品于具塞試管中，精密稱定，精密加入10ml 70%的甲醇，超聲提取 40min，室溫下放置沉淀后，吸取上清液，0.45nm微孔濾膜濾過，即得進樣樣品。
(2) 色譜條件
色譜柱Discovery C18 (250mmx4.6mmx5(im) Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測器 檢測波長280nm;柱溫25°C;流速lml/min。
15流動相A-乙腈B-水乙腈甲酸(90: 10: 0.4v/v) 梯度條件
時間A的比例B的比例
Omin0100%
40min30%70%
1權利要求
1、一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根，其特征在于該丹參毛狀根的丹酚酸B含量為4.57±0.85％干重；迷迭香酸含量為4.67±0.09％干重；丹酚酸K含量為7.98±0.63％干重和丹酚酸L含量為0.92±0.09％干重。
2、根據權利要求1所述的一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀 根，其特征在于其中所述丹酚酸K結構為
3.<image>image see original document page 2</image>
4. 一種如權利要求1所述的高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根 的培養方法，其特征在于該方法包括下列步驟-(1) 應用YMB液體培養基培養的發根農桿菌侵染野生型丹參葉片， 在MSOH固體培養基中進行培養，篩選獲得丹參毛狀根(2) 將丹參毛狀根在MSOH固體培養基中，25°C，黑暗靜置培養3 5 周后，選取長勢較為粗壯鮮嫩的毛狀根轉接到MSOH液體培養基中，25°C，黑暗，120rpm水平回旋振蕩培養2 4周；再選取長勢良好的毛狀根轉接 到MSOH固體培養基中培養；如此反復，進行3 5次交替繼代培養，篩選 到在MSOH液體培養基中生長快速、遺傳穩定、并能穩定產生多種酚酸類 成分的丹參毛狀根株系；(3)應用持續液體繼代培養，將液體培養基中培養的毛狀根轉接到 液體培養基持續培養、接種14天后在培養基中添加茉莉酸甲酯，使其終 濃度為5 30MM;所述YMB液體培養基組成為g/L Manitol 10 Yeast Extract 0.4 NaCl 0.1 MgS04 7H20 0.2K2HP04 0.5 用NaOH和HC1調pH至7.2后于121 'C高壓滅菌;所述MSOH固體培養基組成為mg/L(1) 大量元素KN03 1,900CaCl2 2H20 440MgS04 7H20 370KH2P04 170(2) 微量元素KI 0.83H3B03 6.2MnS04 4H20 22.3ZnS04 7H20 8.6Na2Mo04 2H20 0.25CuS04 5H20 0.025CoCl2 6H20 0.025(3) Fe鹽Na2EDTA 2H20 37.3FeS04 7H20 27.8(4)有機元素肌醇 100煙酸 0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫酸胺素 0.4甘氨酸 2.0 用NaOH和HCH周pH5.8后，添加2%瓊脂粉，于121'C高壓滅菌；所述MSOH液體培養基組成為mg/L(1) 大量元素KN03 1,900CaCl2 2H20 440MgS04 7H20 370KH2P04 170(2) 微量元素KI 0.83H3B03 6.2MnSO4 4H20 22.3ZnS04 7H20 8.6Na2Mo04 2H20 0.25CuS04 5H20 0.025CoCI2 6H20 0.025(3) Fe鹽Na2EDTA 2H20 37.3FeS04 7H20 27.8(4) 有機元素肌醇 100煙酸 0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫酸胺素 0.4甘氨酸 2.0用NaOH和HCl調pH5.8后于121'C高壓滅菌。
全文摘要
本發明提供了一種高含量酚酸類化合物的丹參毛狀根SmHr1及其培養方法，本發明的丹參毛狀根含有丹酚酸B、丹酚酸K、丹酚酸和迷迭香酸化合物，含量高于野丹參。應用本發明的培養方法可以顯著提高丹參毛狀根的生長量積累及藥用成分丹酚酸類化合物的含量，從而為大規模生產這些化合物提供了高產的株系，降低生產成本，促進工業化生產。
文檔編號A61K36/53GK101491571SQ20081003293
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者周吉燕, 張金家, 王崢濤, 胡之璧, 趙淑娟 申請人:上海中醫藥大學