專利名稱：：乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及乳雙歧桿菌應用，更具體地說，本發明涉及乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中的應用。
背景技術：
：尿石癥是長期以來威脅人類健康的泌尿系統常見病之一，其中草酸釣結石占70%~80%,且有較高的復發率。因此其預防顯得尤為重要。草酸對尿液中草酸4丐過飽和程度的影響力比4丐大23倍，因此，高草g是草酸釣結石形成的重要危險因素。新的研究發現，50%~80%的尿草酸來源于飲食，腸道吸收草酸的量是影響尿草酸排泄量的重要因素。若能降低腸道草酸的吸收量，其方法不失為預防草酸鈞尿結石形成和復發的良策。近來發現，脊推動物(包括人)的腸道中常駐有一些能分解草酸的細菌，如嗜草酸桿菌、乳酸菌、雷氏普羅威登斯菌、糞腸球菌和遲緩真桿菌等，這些細菌能不同程度地降解腸道中的草酸，使腸道的草酸吸收量降低，尿草酸排泄量減少，具有預防草酸釣腎結石發生和復發的功效。但這些草酸分解菌除了乳酸菌外，都無商品化供應。益生菌是指經口或其它消化道入口途徑攝入，通過改善粘膜表面微生物或酶的平衡、刺激特異性或非特異性免疫機制而發揮作用的微生物制劑。益生菌進入動物消化道后，通過改善消化道菌群及酶的平衡，迅速提高機體的抗病能力、代謝能力和對食物的消化吸收能力，達到防治消化道疾病和促進生長的雙重作用。常見益生菌主要指兩大類乳酸菌群一類為雙歧桿菌，該類乳酸菌為全球公認有益菌，尚未有不利于人體的報道出現。常見的有嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等；另一類為乳桿菌，如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌等。其中較新型的兩個菌種為植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌o益生元是指能夠選擇性地刺激腸內一種或幾種有益菌生長繁殖，而且不被宿主消化的物質。益生元應具備以下四個條件(l)在胃腸道的上部既不能水解，也不能^:宿主吸收。(2)只能選擇性對腸內有益菌(乂又歧桿菌等)有刺激生長繁殖或激活代謝功能的作用。(3)能夠提高腸內有益于健康的優勢菌群的構成和數量。(4)能起到增強宿主機體健康的作用。常見的益生元有低聚果糖、大豆低聚糖、異麥芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龍膽糖、低聚木糖等。中國專利文獻CN101040638/>開了一種具有減肥功效的綠茶酸奶々大料，其乳酸菌令牛奶中的乳糖轉化而令人體容易吸收，并且有益于腸道有益菌群的繁殖，豐富的鈣質補充人體每日所需，在餐前飲用令胃部有飽腹感，既可以達到節食效果，還不會營養失衡。中國專利文獻CN1350460公開了一種乳桿菌科的新微生物，特別是乳桿菌屬的微生物，它們可用于預防或治療腹瑪。但是，關于乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中應用方面未見報道。
發明內容本發明的目的在于(1)提供乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中應用；(2)提供乳雙歧桿菌與可食用菌、益生元或可以接受的載體的組合物在預防泌尿系統結石中應用。本發明的技術方案如下乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中應用。其中乳雙歧桿菌與可食用菌、益生元或可以接受的載體的組合物在預防泌尿系統結石中應用。所述可食用菌選自各種雙歧桿菌、丁酸梭菌、乳脂明串菌、光和菌、明串珠菌、黑曲霉、米曲霉、凝結芽孢桿菌、酪酸梭狀芽孢桿菌、粘連芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、厭氧性擬桿菌、發酵乳桿菌、纖維二糖乳桿菌、彎曲乳桿菌、載耳布呂克氏乳桿菌、乳酸乳桿菌、胚牙乳桿菌、羅特氏乳桿菌、腸系膜明串球菌、乳酸片球菌、脆弱擬桿菌、毛狀擬桿菌、瘤胃擬桿菌、豬擬桿菌、約氏乳桿菌、唾液乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌、克菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌、發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、高加索乳桿菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、費氏丙酸菌、謝曼氏丙酸桿菌、釀酒酵母菌、乳酸鏈球菌、二乙酰乳酸鏈球菌、丁二酮乳酸鏈球菌、棉子糖鏈球菌、嗜熱鏈球雙尾菌、糞鏈球菌、中(間)鏈球菌、乳鏈球菌、嗜熱鏈球菌、乳脂鏈球菌、酵母菌、食草酸桿菌、雷氏普羅威登斯菌、糞腸球菌或遲緩真桿菌中一種或多種的混合物。可食用菌優選自嗜酸乳桿菌或保加利亞乳桿菌。所述益生元選自低聚果糖、大豆低聚糖、異麥芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龍膽糖、低聚殼聚糖、低聚帕拉金糖、低聚木糖、異麥芽糖、乳酮糖、乳蔗糖、水蘇糖、棉子糖、多糖(云芝多糖、胡蘿含氮多糖)、蛋白質水解物(酪蛋白的水解物、a-乳清蛋白、乳4失蛋白)或多元醇(木糖醇，甘露醇，山梨醇，乳糖醇)中一種或多種的混合物。本發明所公開乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中的應用，其優點表現在對乳雙歧桿菌發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。乳雙歧桿菌安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。乳雙歧桿菌制成的酸奶表面比較光滑，呈白色略偏黃色，新鮮、細膩、潤滑、稠厚感較強、爽口；有發酵乳的滋氣味，酸甜適口，有醋酸味；凝乳均勻，無雜質，僅有少量乳清析出，感官評分達72.4分，酸度達83.8°T，乳酸菌含量為2.61xl07/mL。乳雙歧桿菌與可食用菌、益生元或可以接受的載體制成的組合物灌喂大鼠期間，各組大鼠的24h尿草酸排泄量都有所減少。為臨床提供一種非常適合患者長期服食的尿結石預防良品。圖1:含有乳雙歧桿菌的發酵劑接種量對酸奶感官品質的影響。圖2:含有乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的發酵劑接種量對酸奶感官品質的影響。圖3:實驗動物分組情況。圖4:各組大鼠在灌喂酸奶期間24h尿草酸排泄量的變化。圖5:大鼠體重變化與24h尿草酸排泄量變化的關系。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述。實施例110種可食用乳酸菌體外分解草酸能力實驗和在牛奶培養液中的繁殖能力實驗一、材料(一)實驗器材l.儀器5%0)2培養箱(Forma,3111型)，高壓滅菌鍋(上海博訊實業有限公司)，稱量天平，電爐，SmartSpecPlus分光光度計。2.Helber細菌計凄W反(上海易擴儀器有限/>司)3.比濁度測量儀(DENSIMAT，梅立艾/>司)4.器皿錐形瓶，量筒，吸管，試管(20ml),移液管，滴管。5.其他光學顯微鏡，擦鏡紙，吸水紙。(二)實驗試劑1.嗜酸乳桿菌(L.acidophiluKLDS1.8701s)、副干酪乳桿菌(L.paracaseiKIDS1.0201)、尿腸球菌(EnterococcaceaefaeciumKLDS6.0302)、乳雙歧桿菌(B.lactisKLDS2.0501)、青春雙歧桿菌(B.adolescentisKLDS2.0003)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantisKLDS2.0002)、長雙歧桿菌(B.longumKLDS2.0001)、乳酸乳3求菌乳脂亞種(Lactococcuslactissubsp.CremoriKLDS4.0315)、J呆力口利亞享L才干菌(L.bulgaricusKLDS1.0204)、嗜熱鏈球菌(S.the訓philusKLDS3.0207)的干燥冷凍純菌種(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室)。2.草酸銨、葡萄糖、己糖(分析純上海化學試劑公司)3.基礎培養液(MRS肉湯)(上海化學試劑公司提供原材料，自行配置)4.含草酸的MRS培養液(上海化學試劑公司提供原材料，自行配置)5.—水草酸鐘:6.麝香溴酚蘭:行配置)7.曱基紅指示劑:(分析純上海化學試劑公司)(上海化學試劑公司提供原材料，自(上海化學試劑公司提供原材料，自(分析純上海化學試劑公司)(上海化學試劑公司提供原材料，自行配置)8.鉻酸鉀9.美藍染色液:行配置)二、方法(一)菌種選擇可從國內各個菌種保藏中心和實驗室購買到的、可用于酸奶制作的乳酸菌。(二)主要試劑配置1.含5腿ol/L草酸的MRS培養液基礎培養液與相應的草酸糖溶液按l:1的體積配置混勻。各菌種相應的含草酸MRS培養液的配方為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、屎腸球菌、乳雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌、乳酸乳球菌乳脂亞種A組草酸糖溶液+MRS肉湯；嗜熱鏈球菌B組草酸糖溶液+MRS肉湯。配置基礎培養液(MRS肉湯)將下列成分混合，調節pH至6.2~6.4,121。C高溫下滅菌15min,待冷卻后置于4。C冰箱中保存。酪蛋白胨io克牛肉膏IO克酵母膏浸出液5克Tween80l克磷酸二氫鉀2克己酸鈉5克檸檬酸三氨2克7水疏酸鎂0.5克石克酸猛0.5克水500ml草酸糖溶液按照下列的配比溶解各成分，配置好的草酸糖溶液在超凈臺中用0."um的濾器過濾滅菌。A組草酸銨10mmol/L+葡萄糖40g/L;B組草酸銨10腿01幾+葡萄糖4(^/1+己糖20g/L;2.配置草酸測定試劑草酸標準液一水草酸鉀1.0231克溶于蒸餾水至100ml(含無水草酸5mg/mL)，將儲備液稀釋100倍作為應用液，置于4。C冰箱中保存。麝香溴酚蘭指示劑0.lg麝香溴酚蘭+0.05mmol/LNaOH3.2ml+去離子2001111;或者0.lg麝香溴酚蘭溶于20.Oml100°/。乙醇中，徐徐加入蒸餾水80ml，不斷振蕩。4各酸鉀配制成1.Ommol/L的水溶液。曱基紅指示劑0.lg曱基紅+0.05mmol/LNaOH7.4ml+去離子水200ml。(三)實驗步驟l.復蘇干燥冷凍的純菌種操作流程如下l)安瓿管開封用70%酒精棉球擦凈安瓿管，用火焰將安瓿管頂端加熱，滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。2)菌抹恢復培養在超凈工作臺上用無菌吸管吸取0.3~0.5mlMRS滅菌培養液，滴入各純菌種安瓿中，輕輕震蕩使冷凍干菌溶解呈懸浮狀。吸取全部細菌懸浮液，移入含MRS培養液的無菌試管中，37°C5%C02培養箱中培養48h。如此反復培養23次，使細菌充分活化。2.調整細菌濃度取充分活化的10種菌液各lml，適當稀釋后，用顯微鏡直接計數法分別進行細菌計數，換算出各菌種活化后的濃度，然后加入適量的無菌生理鹽水，使各菌種的細菌濃度調整到3.0x1(T個/mL左右。顯微鏡細菌直接計數法的具體操作如下1)配制美藍染色液美藍0.025g，NaCl0.9g,KC10.042g，CaCl2.6H200.048g,NaHC030.02g,葡萄糖lg,蒸餾水100ml。2)制備細菌稀釋液取一管在液體培養液中培養的細菌培養液，充分振蕩混勻后，取lml菌液，用無菌生理鹽水將其稀釋100倍(稀釋倍數視待測菌懸液濃度，一般稀釋到每1中格平均有15~20個細菌為宜)。3)活體染色取配置的美藍溶液O.9ml于試管中，再取上述稀釋后的菌液0.lml相混勻，染色10min后進4亍計凄t。4)清洗計數板先用自來水沖洗，再用95%乙醇棉球輕輕擦洗，最后用吸水紙吸干(切勿在酒精燈上烘烤)，經鏡4企確證計數板上無污物或粘附的微生物后才可使用。蓋玻片也應用擦鏡紙擦亮。5)加菌液將蓋玻片蓋在計數室上。將染色后的菌懸液搖勻，用細口滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓菌懸液充滿計數區，注意計^t室內不能有氣泡產生，再用4聶子輕壓蓋玻片，以免菌液太多將蓋玻片頂起而改變計數室的容積。并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。靜置片刻，待菌體自然沉降并穩定后，開始計數。6)計數將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下找到大方格網的位置(視野宜調暗些)，找到計數室后，將它移至視野中央，再轉換高倍鏡觀察并計數。Helber細菌計數板由25個中格組成的，為了減少誤差，所選的中格位置應布點均勻，通常選取除四個角上4個中才各及中央的1個中格(即80個小格)。分別計各中才各中沒有染色的細菌。7)每個樣品重復計數2~3次，求出每一個小格中細胞平均數(N)，按公式計算出每ml菌懸液中含有細胞數-每個小格中細胞平均數(N)x系數(K)x菌液稀釋倍數(d)3j妾種細菌準備90支寫上標記的20ml無菌試管。將滅菌后的各菌種草酸培養液各取9份，每份9ml，分別加入各自的試管中。將細菌濃度為3.Oxio7個/mL的各菌種菌液各取9份，每份lml，分別接種在各自相應的培養液中。4.設空白對照組準備9支寫上標記的20ml無菌試管。取A組草酸培養液9份，每份9ml，分別加入試管中，每管再各加lml滅菌去離子水，作為空白對照組。5.培養前的細菌濃度測定從剛接種完細菌并充分振蕩混合后的各試管菌液中各取lml，適當稀釋后，用顯微鏡直接計數法分別進行細菌計數。6.培養前的草酸濃度測定從空白對照組各試管中分別取草酸培育液2ml，3000r/min離心10min后，每份取上清液lml,用鉻酸鉀氧化曱基紅催化光度法測量培養液中草酸的濃度，作為培養前的草酸濃度。具體操作如下鉻酸鉀氧化曱基紅催化光度法測定尿草酸取三支20.Oml試管，分別作樣品管C4")、標準管(A)和空白管C4扮。樣品管中加入用蒸餾水稀釋IO倍的混勻草酸培育液0.5ml，標準管中加入草酸標準工作液0.5ml，再各加蒸餾水l.Oml,空白管中加蒸餾水1.5ml,各管加溴麝香草酚藍指示劑1滴，滴加0.25腿ol/L氫氧化鈉或0.lmmol/L鹽酸使試管液成藍綠色，總量不超過0.5ml。加飽和石危酸4丐2.0ml及95%乙醇至20.0ml，混勻，加蓋。于室溫;改置3小時，以2500r/min離心10min，傾去上清液，倒置于濾紙上吸凈殘液，加0.4mol/L鹽酸2.0ml使沉淀溶解，分別轉移至三支10ml的比色管中，各力口曱基紅2.0ml、1.0mmol/L鉻酸鉀4.0ml，用水稀釋至刻度，搖勻，計時，15min時加1.Ommol/L氧氯化鋯溶液1.Oml，搖勻，倒入lcm比色杯，以水作參比，SmartSpecPlus分光光度計在515nm處測吸光度。按下列公式計算草酸培育液中草酸含量C(畫1/L)=dW/dA)x0.017.培養將上述培養管置于5%0)2培養箱中，37。C培養72h。8.培養后的細菌濃度測定培養后的菌液每種取lml,適當稀釋后，用顯微鏡直接計數法分別直接計數。9.培養后的草酸含量測定將培養72h后的含菌培養液置于沸水中30min滅菌，3000r/min離心10min后，每份取上清液lml,用鉻酸鉀氧化曱基紅催化光度法測量培養液中草酸的濃度。具體操作同上。10.IO種乳酸菌在牛奶中繁殖能力的測定將10種乳酸菌分別等量接種于12%的脫脂乳中，42。C培養3h，然后置于室溫自然冷卻O.5h，再置入2。C冷藏箱內培養10h。然后測定牛奶中乳酸菌的數量，計算10種乳酸菌在牛奶中單獨培養時的增殖倍數。將4種雙歧桿菌分別與嗜酸乳桿菌按照l:l的比例混合,接種于12%的脫脂乳中，同樣條件下培養后，測定牛奶中雙歧桿菌的數量，計算嗜酸乳桿菌對4種雙歧桿菌在牛奶中增殖能力的影響。11.統計學處理采用SAS軟件進行分析，草酸濃度均值用3f士s表示，乳酸菌均數用G土s表示，草酸分解率用百分數表示。組間均數比較用單因素方差分析。三、結果1.這IO種乳酸菌都具有體外分解草酸能力，但差異明顯，72h草酸降解率從29.03%~0.23%不等，其中最強為乳雙歧桿菌，最弱為屎腸3求菌。這10種乳酸菌在含草酸的MRS培養液中培養72h,都有不同程度的增殖，而它們的增殖能力與其草酸降解能力無相關性。2.這10種乳酸菌在脫脂乳中單獨培養72h，都有明顯的增殖，從37.11倍~13.90倍不等，其中最強為乳雙歧桿菌，最差為青春雙歧桿菌；雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌混合培養于脫脂乳時，嗜酸乳桿菌可促進雙歧桿菌的生長，其促生長效果由高到低依次為長雙歧桿菌>青春雙歧桿菌>乳雙歧桿菌〉嬰兒雙歧桿菌；篩選出的草酸降解能力和在脫脂乳中生長能力俱佳的最優菌種為乳雙歧桿菌。實施例2用乳雙歧桿菌制作預防尿結石的酸奶及測試一、材料(一)實驗器材1.儀器水浴鍋、冰箱、5%(]02培養箱、稱量天平、高壓滅菌鍋、攪拌器、電爐。2.器皿錐形瓶，量筒，吸管，試管，移液管，滴管。3.Helber細菌計數板上海易擴儀器有限公司提供。4.其他光學顯微鏡，纟察鏡紙，吸水紙、150目紗布等。(二)實驗試劑乳雙歧桿菌干燥冷凍純菌種(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室)1.脫脂乳(光明牌脫脂奶粉，超市購買)2.綿白糖(超市購買，符合GB317《白砂糖》)3.酚酞、NaOH等(分析純上海化學試劑7>司)二、方法1.酸奶的制作和理化指標測定1)菌種的活化先將裝乳雙歧桿菌種試管口用火焰徹底殺菌，然后打開棉塞，用滅菌吸管從試管底部吸取1~2ml菌液，立即移入預先準備好的滅菌脫脂乳培養液中，于42。C的恒溫培養箱中培養，待凝固后，再取出1-2ml,再照上述方法反復2~3移;隨活化后，用于調制母發酵劑。2)母發酵劑的制備將脫脂乳粉與水混合做成12%復原奶，分裝至25Oml的三角瓶中，每并瓦100ml，105。C滅菌15min，冷卻至45。C左右，以無菌方式將充分活4匕的乳酸菌按4%(v/v)接種量分別接種到含有脫脂乳的三角瓶中，混勻后，于42。C的恒溫培養箱中培養發酵至凝固，凝固后，再反復接種23次，使乳酸菌保持一定的活力。置于6。C水箱保存。3)生產發酵劑的制備將脫脂乳粉與水混合做成12%復原奶，向其中添加8%蔗糖，攪拌溶解后，分裝至250ml的三角瓶中，每并瓦100ml。90。C5min滅菌，冷卻至45°C左右，按4%接種量(v/v)接種上述母發酵劑，于42°C的恒溫培養箱中培養至凝乳。置于6。C冰箱保存。4)制作酸奶將脫脂乳粉與水混合敗成2L復原奶后，150目紗布過濾。然后加入8%的蔗糖，攪拌溶解后，150目紗布過濾，等量分裝在4個1L的滅菌平底燒瓶中，90。C滅菌5min,冷卻到42。C后，按2%、3%、4%和5%接種量(v/v)分別接種上述生產發酵劑。在接種的過程中，原料乳始終保持攪拌狀態。每種接種濃度的牛奶經過充分攪拌后，迅速連續地灌入10只容量為100ml的清潔滅菌葡萄糖液體瓶中，每瓶裝50ml,于42°C發酵3h。冷卻，置于4。C儲存。5)酸度的測定酸石威滴定法吸取樣品10ml置于100ml三角燒并瓦中，加入20ml的蒸餾水，再加入0.5%酚酞指示劑2~3滴，搖勻，用0.lmol/L的NaOH溶液進行滴定，至孩t紅色，在2min內不消失為終點。記錄所消耗的NaOH溶液的體積(以ml為單位)。用以下公式計算滴定^:酸度(°T)=消耗0.lmol/L的NaOH溶液毫升數xlOOx堿'絲爾濃度6)感官評定取適量自制防石酸奶于50ml燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態，再聞氣味，然后用溫開水漱口，品嘗滋味。由10人分別對口感、滋味氣味及組織狀態進行評定。_表l酸奶感官評定評分表_li￥￥5具有酸乳特有的細膩、潤滑及稠厚感、爽口25-30~口感(30分)較細膩、潤滑，稠厚感不強或較為稀薄15~24較為粗糙，有沙粒狀或沙狀口感，或如々大水狀<15有發酵乳特有的滋氣味，酸甜適口，分為風味調35~40風味較淡，酸甜適口，勉強接受20-34風味淡薄，氣味不協調，不能接受<20凝乳均勻，無雜質，無或有少量乳清析出25-30凝乳較均勻，有乳清析出15-24凝乳不均勻，乳清嚴重析出<157)最佳發酵劑接種量的確定將感官評定得分最高的酸奶的發酵劑接種量定為最佳發酵劑接滋味和氣味(40分)組織狀態(30分)種量。8)乳酸菌量的測定用顯孩i鏡直接計數法進行活菌計數。3.統計學處理采用SAS軟件進行分析，細菌數量均值用G±s表示。三、結果1.發酵劑不同接種量制成的4種酸奶的感官品質評分值見表2和圖l,表2發酵劑接種量對酸奶感官品質的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>當接種量為4%時，感官評分最高，且與其他接種量時的感官評分的差異具有極顯著統計學意義(P<0.01)，接種量大于或小于4%都會使酸奶的感官品質下降。因此，發酵劑的最佳接種量為4%。2.4%接種量制成的酸奶感官品質的評價表面比較光滑，呈白色略偏黃色，新鮮，感官評分達72.4分，詳見表3。^_表3感官評定評分結果_ii^感官評定i11口感(30分)較細膩、潤滑，稠厚感較強、爽口滋味和氣味(40分)有發酵乳的滋氣味，酸甜適口，有醋酸味組織狀態(30分)凝乳均勻，無雜質，僅有少量乳清析_^_3.4%接種量制成的酸奶的酸度檢測結果#83.8°T,基本與國家標準(GB2746)的要求相符合。4.4%接種量制成的酸奶的微生物指標檢測結果乳酸菌總量約為2.61xlO"個/mL，達到國家標準的要求。實施例3用乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌制作預防尿結石的酸奶及測試一、材料同實施例2中材料。其中嗜酸乳杵菌干燥冷凍純菌種(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室)二、方法同實施例2中方法。其中菌種的復活裝乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌試管中，乳雙歧桿菌為2ml，嗜酸乳桿菌2ml。三、結果1.發酵劑不同接種量制成的4種酸奶的感官品質評分值見表4和1923.3±1.7分25.6±1.2分23.5±2.6分圖2,表4發酵劑接種量對酸奶感官品質的影響接種量感官品質評分2%較細膩、潤滑，稀薄；風味較淡，甜味較強，有醋酸味；57.5±6.2凝乳較均勻，較多乳清析出3%較細膩、潤滑，稠厚感尚可；風味較淡，酸度不強，有醋67.2±8.1**酸味；凝乳較均勻，有乳清析出4%細膩、潤滑、稠厚感較強、爽口；有發酵乳的滋氣味，酸73.7±5.4*甜適口，有醋酸味；凝乳均勻，無雜質，僅有少量乳清析出5%較為粗糙，輕微沙粒狀口感；風味較淡，偏酸，有醋酸味；63.9±4.3*_凝乳較均勻，有較多乳清析出_**:P<0.01,3%vs2%*:P<0.05,4%vs2%、3%、5%;5%vs2%當接種量為4%時，感官評分最高，且與其他接種量時的感官評分的差異具有極顯著統計學意義(P<0.01),接種量大于或小于4%都會使酸奶的感官品質下降。因此，發酵劑的最佳接種量為4%。2.4%接種量制成的酸奶感官品質的評價表面比較光滑，呈白色略偏黃色，新鮮，感官評分達73.7分，詳見表5。表5感官評定評分結果指標感官評定分數口感(30分)較細膩、潤滑，稠厚感較強、爽口滋味和氣味(40分)有發酵乳的滋氣味，偏酸，有醋酸味組織狀態(30分)凝乳均勻，無雜質，僅有少量乳清析出24.8±4.6分23.4±5.l分25.5±3.7分3.4%接種量制成的酸奶的#檢測結果酸度81.2°T,基本與國家標準(GB2746)的要求相符合。4.4%接種量制成的酸奶的^:生物指標;險測結果乳酸菌總量約為3.49x1(T個/mL，完全達到國家標準的要求。實施例4用乳雙歧桿菌制作防石酸奶與市售酸奶體外分解草酸能力的比4交一、材料(一)實驗器材1.滅菌平板，5%0)2培養箱，高壓滅菌鍋，稱量天平，電爐，錐形瓶，吸管。2.721分光光度計(廈門分析儀器廠)3.Helber細菌計數板上海易擴^f義器有限公司(二)實驗試劑1.市售酸奶出廠第二天的180g裝的塑罐裝味全牌酸奶，超市購買，4'C冰箱中儲存，在7天儲存期內使用。2.自制防石酸奶(實施例2按4°/。接種量制成的酸奶)3.草酸銨、葡萄糖、已糖(分析純上海化學試劑公司)4.一水草酸鉀(分析純上海化學試劑公司)5.麝香溴酚蘭(上海化學試劑公司提供原材料，自行配置)6.曱基紅指示劑(上海化學試劑公司提供原材料，自行配置)7.鉻酸鐘(分析純上海化學試劑公司)二、方法1.滅菌奶的滅菌方法出廠第二天的塑罐裝味全牌酸奶和制成第二天的防石酸奶，105。C滅菌15min,4。C冰箱中儲存，在7天儲存期內使用。2.配置10mmol/L的草酸糖溶液草酸銨10腿ol/L+葡萄糖40g/L。配制好的草酸糖溶液在超凈臺用0.46um的濾器過濾滅菌。213.取45支20ml的滅菌試管，分成5組，分別為活菌防石酸奶組、活菌味全牌酸奶組、滅菌防石酸奶組、滅菌味全牌酸奶組和空白對照組，每組9支，在無菌操作臺中，分別向各組的試管中加入相應的活菌防石酸奶、活菌味全牌酸奶、滅菌防石酸奶、滅菌味全牌酸奶和無菌生理鹽水，每支試管5ml。4.在無菌操作臺上，向上述試管中各加無菌1Ommol/L的草酸糖溶液5ml，混勻，再向各試管中滴加23ml的滅菌石蠟油，加蓋無菌膠塞。5.培養前細菌計數從活菌味全牌酸奶組和活菌防石酸奶組的各試管中分別取液體lml,適當稀釋后，用顯樣t鏡直接計數法計數細菌，作為培養前的細菌濃度。6.培養前草酸含量測定/人空白對照組各試管中分別取液體2ml，3000r/min離心10min后，每份取上清液lml，用鉻酸鉀氧化曱基紅催化光度法測量培養液中草酸的濃度，作為培養前的草酸濃度。7.培養將上述各試管置于5%0)2培養箱中，37。C培養3天。8.培養后草酸含量測定將培養72h后的各試管置于沸水中30min滅菌，3000r/min離心10min后，每份取上清液lml，用鉻酸鉀氧化曱基紅催化光度法測量培養液中草酸的濃度。9.統計學處理采用SAS軟件分析，草酸濃度均值用3f士s表示，乳酸菌均數用G土s表示，草酸分解率用百分數表示。組間均數比較用單因素方差分析。三、結果1.自制防石酸奶與市售酸奶的分解草酸能力結果見表6。表6酸奶中草酸濃度在培養前后的變化(f±smmol/L)~~培養前培養72h后72h草酸總~酸奶中細菌分解草酸奶中細組別(A)(B)#分解率(％)酸率(％)菌分解草.(A-B)/A(對照組B-實驗組酸量B)/對照組B對照組B-實驗組B*:P<0.05培養后vs培養前#:培養72h后各組草酸濃度差異，P>0.05培養后的草酸濃度，五個組之間雖有一定的差異，但是這種差異在統計學上尚未達到顯著意義(P>0.05)。兩個活齊酸奶組的草酸含量降幅均超過空白對照組和相應的滅菌對照組，其中活菌防石酸奶組的草酸含量比空白對照組減少0.59mmol/L,比滅菌防石酸奶組減少0.54隱ol/L;活菌味全牌酸奶組的草酸含量比空白對照組減少0.28mmol/L，比滅菌味全牌酸奶組減少0.26mmol/L,活菌防石酸奶組的蘋酸濃度降幅超過活菌味全牌酸奶2.1倍。實施例5用乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌制作防石酸奶與市售酸奶體外分解草酸能力的比較一、材料同實施例4中材料。其中自制防石酸奶(實施例3按4%接種量制成的酸奶)234.92±0.374.78±0.492.84.92±0.374.76±0.413.34.92±0.374.73±0.164.34.92±0."4.50±0.45*8.54.92±0.374.19±0.23*14.85.912.30,280.59白照菌售菌制菌售菌制空對滅，滅自活t活自方法同實施例4中方法。三、結果1.自制防石酸奶與市售酸奶的分解草酸能力結果見表7。表7酸奶中草酸濃度在培養前后的變化(±腿ol/L)培養前培養72h后72h草酸酸奶中細菌分解草酸奶中細菌分組別(A)(B)#總分解酸率(％)解草酸量率(％)(對照組B-實驗組對照組B-實驗(A-B)/AB)/對照組B組B空白對照4.92±0.374.78±0.492.8——滅菌市售4.92±0.374.76±0.413.3——滅菌自制4.92±0.374.74±0.583.7—-活菌市售4.92±0.374.50±0.45*8.55.90.28活菌自制4.92±0.374.15±0.52*15713.20.63*:P<0.05培養后vs培養前:培養72h后各組草酸濃度差異，P〉0.05培養后的草酸濃度，五個組之間雖有一定的差異，但是這種差異在統計學上尚未達到顯著意義(P>0.05)。兩個活菌酸奶組的草酸含量降幅均超過空白對照組和相應的滅菌對照組，其中活菌防石酸奶組的草酸含量比空白對照組減少0.63mmol/L,比滅菌防石酸奶組減少0.59隱ol/L;活菌味全牌酸奶組的草酸含量比空白對照組減少0.28mmol/L,比滅菌p未全牌酸奶組減少0.26mmol/L，活菌防石酸奶組的草酸濃度降幅超過活菌，味全牌酸奶2.25倍。實施例6用乳雙歧桿菌制作防石酸奶與市售酸奶對大鼠尿草酸排泄量影響的比較一、材料(一)實驗動物選用健康清潔級成年雄性SD大鼠(復旦大學實驗動物科學部提供)50只，體重180200g/只。(二)實驗器材1.大鼠代謝籠(蘇州實驗器械有限公司)2.721分光光度計(廈門分析儀器廠)3.IVC大鼠飼養籠(上海紹豐實驗動物設備有限公司)(三)實驗試劑1.活菌市售酸奶出廠第2天的180g裝的塑罐裝p未全牌酸奶，超市購買，4。C水箱中儲存，限7天儲存期內使用。2.滅菌市售酸奶出廠第2天的180g裝塑罐裝味全牌酸奶，超市購買，105。C高溫滅菌15分鐘，4'C冰箱中儲存，限7天儲存期內使用。0.9%生理鹽水(上海市華源長富藥業有P艮^^司)自制防石酸奶(實施例2按4%接種量制成的酸奶)5.滅菌自制防石酸奶自制的防石酸奶，121。C高溫滅菌15分鐘，4。C水箱中儲存，P艮7天儲存期內使用。實-險方法1.動物分組選取健康SD雄性大鼠50只，隨機分為5組，每組實驗動物分組情況見圖3。2.大鼠適應性喂養3天，喂正常鼠飼料，飲自來水。3.第4天開始灌喂，灌喂物見后面的實驗動物分組情況。4.灌喂前1天、灌喂期內每隔4天用代謝籠分別收集各鼠24h尿1025液，用濃HC1酸化至pH-l.0左右，置于水箱保存。5.灌喂前1天、灌喂期內每隔4天測大鼠體重的變化。6.用鉻酸鉀氧化曱基紅催化光度法測定鼠24h尿液草酸排泄量。7.統計學處理采用SAS軟件進行分析，'草酸濃度均值用f士s表示。組間均數比較用單因素方差分析。相關性4全驗用SAS軟件中的相關性檢驗方法。三、結果灌喂期間，各組大鼠的24h尿草酸排泄量都有所上升。其中，三個對照組大鼠尿草酸排泄量走勢的組間差異不大，且無統計學意義。防石酸奶灌喂組和味全牌酸奶灌喂組大鼠尿草酸排泄量的上升走勢明顯弱于三個對照組，其與各自滅菌對照組的差異分別于8天后和12天后具有顯著統計學意義；防石酸奶組尿草酸排泄量上升走勢明顯緩于味全牌酸奶組(圖4)，其差異在灌胃第16天后具有顯著統計學意義，防石酸奶組大鼠24小時尿草酸排泄量比味全牌酸奶組低15.6%,其尿草酸減排效果比后者提高82.9%。實施例7用乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌制作防石酸奶與市售酸奶對大鼠尿草酸排泄量影響的比較一、材料同實施例6中材料。其中自制防石酸奶(實施例3按4%接種量制成的酸奶)二、方法同實施例6中方法。三、結果灌喂期間，各組大鼠的24h尿草酸排泄量都有所上升。其中，三個對照組大鼠尿草酸排泄量走勢的組間差異不大，且無統計學意義。防石酸奶灌喂組和味全牌酸奶灌喂組大鼠尿草酸排泄量的上升走勢明顯弱于三個對照組，其與各自滅菌對照組的差異分別于8天后和12天后具有顯著統計學意義；防石酸奶組尿草酸排泄量上升走勢明顯緩于味全牌酸奶組，其差異在灌胃第16天后具有顯著統計學意義，防石酸奶組大鼠24小時尿草酸排泄量比味全牌酸奶組低18.8%，其尿草酸減排效果比后者提高100%(圖5)。本發明乳雙歧桿菌通過口服方式施用于食用者。用于口服時，可將其制成常規的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠嚢等，制成液體制劑如水或其他液體。實施例8片劑活性成分乳雙歧桿菌凍干粉20mg(109cfu)乳糖187mg玉米淀粉50mg硬脂酸4美3mg制備方法將活性成分、乳糖、玉米淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片。實施例9乳雙歧桿菌凍干并分200mg(10"cfu)乳酸飲料(超市購買)50mL27制備方法將乳雙歧桿菌凍干粉溶解于乳酸飲料中，經過充分攪拌后，置于4。C儲存。實施例IO乳雙歧桿菌凍干4分200mg(10'。cfu)低聚果糖(購于江門量子高科生物工程有P艮公司)l.Og硬脂酸鎂5mg制備方法將乳雙歧桿菌、低聚果糖、硬脂酸鎂混合后裝入硬明膠膠嚢中。實施例ll乳雙歧桿菌凍干粉200mg(101Qcfu)低聚異麥芽糖(購于江門量子高科生物工程有限公司)2.Og嗜酸乳桿菌凍干粉lmg(購于中國普通樣i生物保藏管理中心)硬脂酸4美8mg制備方法將乳雙歧桿菌、低聚異麥芽糖、嗜酸乳桿菌、硬脂酸鎂混合，過濾，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠嚢中。權利要求1、乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中的應用。2、根據權利要求l所述的應用，其中乳雙歧桿菌與可食用菌、益生元或可以接受的載體的組合物在預防泌尿系統結石中的應用。3、根據權利要求2所述的應用，其特征在于可食用菌選自各種雙歧桿菌、丁酸梭菌、乳脂明串菌、光和菌、明串珠菌、黑曲霉、米曲霉、凝結芽孢桿菌、酪酸梭狀芽孢桿菌、粘連芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、厭氧性擬桿菌、發酵乳桿菌、纖維二糖乳桿菌、彎曲乳桿菌、栽耳布呂克氏乳桿菌、乳酸乳桿菌、胚牙乳桿菌、羅特氏乳桿菌、腸系膜明串球菌、乳酸片球菌、脆弱擬桿菌、毛狀擬桿菌、瘤胃擬桿菌、豬擬桿菌、約氏乳桿菌、唾液乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌、克菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌、發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、高加索乳桿菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、費氏丙酸菌、謝曼氏丙酸桿菌、釀酒酵母菌、乳酸鏈球菌、二乙酰乳酸鏈球菌、丁二酮乳酸鏈球菌、棉子糖鏈球菌、嗜熱鏈球雙尾菌、糞鏈球菌、中間鏈球菌、乳鏈球菌、嗜熱鏈球菌、乳脂鏈5求菌、酵母菌、食草酸桿菌、雷氏普羅威登斯菌、糞腸球菌或遲緩真桿菌中一種或多種的混合物。4、根據權利要求3所述的應用，其特征在于可食用菌選自嗜酸乳桿菌或保加利亞乳桿菌。5、根據權利要求2所述的應用，其特征在于益生元選自低聚果糖、大豆低聚糖、異麥芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龍膽糖、低聚殼聚糖、低聚帕拉金糖、低聚木糖、異麥芽糖、乳酮糖、乳蔗糖、水蘇糖、棉子糖、多糖、蛋白質水解物或多元醇中一種或多種的混合物。6、根據權利要求5所述的應用，其特征在于益生元選自低聚果糖或低聚異麥芽糖。全文摘要本發明涉及乳雙歧桿菌應用。本發明的技術方案如下乳雙歧桿菌在預防泌尿系統結石中應用。其中乳雙歧桿菌和可食用菌、益生元或可以接受的載體的組合物在預防泌尿系統結石中應用。其優點表現在對乳雙歧桿菌發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。乳雙歧桿菌安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。為臨床提供一種非常適合患者長期服食的尿結石預防良品。文檔編號A61K31/7016GK101606952SQ20081003904公開日2009年12月23日申請日期2008年6月17日優先權日2008年6月17日發明者張士青,李建濤,趙樹田,欣顧申請人:上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院