專利名稱：一種神經細胞誘導劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及促進胚胎干細胞分化為神經細胞的誘導劑；該誘導 劑的分子結構；該類誘導劑作為藥物化合物誘導胚胎干細胞成為神經細胞的方法；應用該 誘導劑分化得到的神經干細胞植入模型動物腦內治療阿爾茨海默病的用途。
背景技術：
胚胎干細胞是一種具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，是一種獨特的生物 資源。應用明確的定向誘導劑可以誘導胚胎干細胞分化成為多種類型的功能細胞，進而進 行細胞移植治療或者相關藥物的篩選。胚胎干細胞分化為神經細胞可用于神經系統疾病的 機制研究、細胞移植治療和神經系統治療藥物的篩選，有潛在的社會和經濟價值。但是，目 前還很缺乏高效的神經細胞誘導劑。 全反式維脯酰胺(N-all-trans-retinoyl-L-proline， ATRP)是基于全反式維甲 酸和芬維A胺結構設計的化合物。純化的ATRP具有抑制肝癌細胞轉移的作用。神經細胞 誘導分化方面的作用尚未有報道。 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)，又名老年性癡呆(senile dementia), 是一種常見于老年人的以進行性癡呆為特征的大腦退行性變性疾病，1907年由德國精神病 學、神經解剖學專家Alois Alzheimer首次描述并命名。阿爾茨海默病的主要病理表現為 神經元細胞外有大量老年斑、神經元細胞內有神經纖維纏結，這些病改變主要由淀粉樣蛋 白沉積和tau蛋白異常磷酸化引起的，主要出現在Entorhinal皮質和海馬回，同時病變部 位的神經元軸突與樹突退化、神經元凋亡。阿爾茨海默病在發達國家已經成為僅次于心血 管病、腫瘤和卒中而位居第4位的致死原因。 研究顯示，神經干細胞具有自我更新及產生多種類型神經細胞的能力，為神經系 統疾病的細胞移植治療提供了細胞來源。體外培養的神經干細胞具有以下優點(l)在可 控制的培養條件下實現快速體外擴增，滿足移植所需的細胞數量。(2)根據擬移植部位的細 胞類型及細胞結構特異性，在體外使神經干細胞分化成為受者部位細胞類型與構成相似的 細胞群體后再進行移植。也就是說為了滿足特殊部位移植的需要，可事先在體外對供者細 胞進行"裁剪加工"，使之定向分化，能更容易整合入靶組織，提高移植物存活率。(3)利用 神經干細胞可低溫凍存，而且復蘇后仍能維持原來的生物學性征這些特點，可構建各種不 同類型的神經干細胞庫。(4)神經干細胞可作為"治療性基因"的載體，對損傷或病變部位 施行基因治療，以實現外源性治療基因的準確定位，高效表達。(5)神經干細胞是未分化的 原始細胞，移植后與宿主發生的排斥反應較小，有利于移植神經干細胞長期成活并與宿主 細胞更好的融合。移植外源性神經干細胞，既可以直接進行神經干細胞移植；也可以利用細 胞因子等進行誘導之后再將其移植；還可以對神經干細胞進行基因修飾后再進行移植。
神經干細胞用于神經退變性疾病替代治療的設想始于病變較為局限的帕金森氏 病(Parkinson' s disease,PD)、亨庭頓氏病(Huntington' s disease,HD)等，并在實驗中 取得了較為理想的效果。外源性多分化潛能的神經干細胞(小鼠或大鼠)移植腦內后，可以在神經系統良好的存活、大量增殖并遷移到不同部位分化為相應的神經細胞。神經干細 胞具有的這種廣泛遷移的特性，使其移植替代治療病變較為廣泛的AD成為可能。

發明內容
本發明的目的是提供一種神經細胞的誘導劑，具體涉及式I的化合物全反式維脯 酰胺(簡稱ATRP)在促進胚胎干細胞誘導分化為神經細胞中的用途，及其誘導分化得到的 神經干細胞在治療阿爾茨海默病模型小鼠中的應用。 本發明所述的誘導劑通過促進信號分子ERK的磷酸化而加速胚胎干細胞向神經
細胞分化；誘導分化得到的神經干細胞通過立體定位植入阿爾茨海默病模型小鼠腦內可以
明顯改善治療小鼠的學習記憶功能。
(I )本發明的目的通過下述技術方案實現 通過細胞學、組織化學、分子生物學和生物化學實驗對式I的化合物(ATRP)促進
ERK磷酸化的作用及其促進胚胎干細胞誘導分化的作用進行分析；通過細胞學、組織化學
和動物行為學實驗對神經干細胞治療阿爾茨海默病模型小鼠進行分析。 結果顯示，ATRP在胚胎干細胞分化早期可以顯著地促進ERK的磷酸化，胚胎干細
胞的標志性分子加速丟失，而神經前體細胞、神經干細胞及神經元的標志性分子均提前檢
出；應用ERK信號通路的抑制劑可以阻斷ATRP的促進胚胎干細胞分化為神經細胞的功能，
從正反兩方面證實了 ATRP通過促進ERK的磷酸化發揮作用；誘導分化得到的神經干細胞通
過立體定位植入阿爾茨海默病模型小鼠腦內可以明顯改善模型小鼠的學習記憶功能。 進一步，本發明所述的化合物可制備促進胚胎干細胞誘導分化為神經細胞的藥
物，其所誘導分化得到的神經干細胞可制備治療阿爾茨海默病藥物。


圖1是RT-PCR結果顯示ATRP促進0ct4mRNA表達加速下調。
圖2是Western blot結果顯示ATRP促進0ct4蛋白質表達加速下降。
圖3是細胞免疫熒光結果顯示ATRP促進0ct4陽性的胚胎干細胞加速減少。
圖4是FACs檢測結果顯示ATRP促進Soxl^陽性的神經前體細胞提前出現。
圖5是細胞免疫熒光結果顯示ATRP促進Sox嚴P陽性的神經前體細胞提前出現。
圖6是RT-PCR結果顯示ATRP促進神經前體細胞和神經干細胞的標志(Pax6、 Nestin、BLBP、Prominin、01ig2、Musashi)、神經元的標志(Tujl、 M即2、 NCAM)提前出現。
圖7是細胞免疫熒光結果顯示ATRP促進Nestin陽性的神經干細胞提前出現。
圖8是Western blot結果顯示ATRP促進未成熟神經元的標志Tujl提前表達。
圖9是細胞免疫熒光結果顯示ATRP促進MAP2陽性的神經元和GFAP陽性的膠質 細胞提前出現。 圖10是Western blot結果顯示在胚胎干細胞分化早期，ATRP促進ERK的磷酸化。 圖11是RT-PCR結果顯示ATRP促進ERK的靶基因Elkl提前表達。 圖12是細胞免疫熒光結果顯示使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和
PD184352可以顯著阻斷ATRP所誘導的Soxl^陽性的神經前體細胞的出現。 圖13是FACs檢測結果顯示使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352
可以顯著阻斷ATRP所誘導的SoxlGFP陽性的神經前體細胞的出現。 圖14是細胞免疫熒光結果顯示獲得的神經干細胞呈神經干細胞特異性標志 Nestin陽性。 圖15是細胞免疫熒光結果顯示神經干細胞能夠分化為表達MAP2的神經元和表達 GFAP的神經膠質細胞。 圖16是Morris水迷宮測試指標-一 潛伏期治療后模型小鼠能夠更快地找到站 臺° 圖17是Morris水迷宮測試指標-一III象限時間百分比治療后模型小鼠在站臺 所在象限游泳時間明顯長于未治療模型小鼠。 圖18是Morris水迷宮測試第15天去除站臺，治療后模型動物在中心區域的游泳 時間明顯長于未治療模型小鼠。
具體實施例方式
下面結合實驗例對本發明進一步詳細描述但不限制本發明。
以下實驗中，所需物品說明 (1)所用胚胎干細胞為46C胚胎干細胞(在分化為神經前體細胞時表達Sox嚴P熒 光)，購于英國愛丁堡大學干細胞中心； (2) 46C胚胎干細胞的培養液成分為GMEM(Sigma公司)含2mM谷氨酰胺(Gibco 公司)、0.001% P-巰基乙醇(Gibco公司)、1X非必需氨基酸(Gibco公司)，10%胎牛血 清和2000單位/毫升重組人LIF(R&D公司)； (3)46C胚胎干細胞的分化培養液(N2B27)成分為含1 XN2 (Gibco公司)的DMEM/
F12 (Gibco公司)與含IX B27 (Gibco公司)的Neurobasal (Gibco公司)1 : 1混合； (4)細胞培養皿購于Nunc公司； (5)細胞培養皿包被用明膠購于Sigma公司； (6)細胞消化用胰酶購于Gibco公司； (7)無水乙醇購于國藥集團； (8) ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352購于Calbiochem公司；
(9)胚胎干細胞的培養方法46C胚胎干細胞接種于0. 1 %明膠包被的細胞培養皿 上，隔天換液，生長至90%融合時傳代； (10)胚胎干細胞的分化培養的方法將46C細胞胚胎干細胞以lX10Vcm2 的密度接種于O. 1%明膠包被的細胞培養皿上黏附培養，以N2B27作為培養液，在無 ATRP[N2B27+0 (對照)或N2B27+0. 02 % ethanol (溶劑對照)]或有ATRP [N2B27+10—6M
5ATRP (實驗組)]的條件下生長分化，隔天換液； (11)阿爾茨海默病模型小鼠(Mo/HuAPPswePSldE9雙轉基因小鼠)購于Johns Hopkins大學； (12)立體定位注射儀購于Narishige公司，Morris迷宮購于上海吉量生物技術公 司。 實施例l ATRP對胚胎干細胞自我更新狀態的影響實驗
采用下述三種方法進行檢測 (1) RT-PCR檢測胚胎干細胞分子標志0ct4的mRNA表達水平
收集46C胚胎干細胞樣品和第1、3、5天的分化細胞樣品；用TRIzol (Invitrogen 公司)、DNase I和吸附柱(RNeasy MinElute Cleanup, Qiagen公司)獲得無DNA污染的總 RNA ;用逆轉錄酶匪LV (Invitrogen公司)將RNA逆轉錄為cDNA ;用PCR試劑盒(申能博彩 公司)以cDNA為模板進行PCR反應；在2%的瓊脂糖凝膠上進行DNA電泳；用凝膠成像系 統(Bio-Rad公司)采集電泳圖像，結果見附圖1 ; (2) Western blot檢測胚胎干細胞分子標志0ct4的蛋白質表達水平 收集46C胚胎干細胞樣品和第5天的分化細胞樣品；用裂解液裂解(裂解液
成分20mM Tris-HCl， pH 7. 4，2% Triton X_100， 10mM EDTA，5mMNaF and lmM sodium
orthovanadate);加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)和12%聚丙烯酰胺凝膠(分離膠)
上進行蛋白質電泳；電泳后用硝酸纖維素膜(Pall公司)轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1小
時；抗0ct4抗體(Santa Cruz公司)1 : 1000稀釋于5%脫脂奶粉，孵育硝酸纖維素膜4°C
過夜；二抗孵育后，ECL法發光；用凝膠成像系統(Bio-Rad公司)采集圖像，結果見附圖2; (3)細胞免疫熒光檢測胚胎干細胞分子標志0ct4的蛋白質表達情況 46C胚胎干細胞分化培養3天；用4%多聚甲醛固定；以1 : 500抗0ct4抗體稀釋
液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342染核染料(Sigma公司)孵育后，在倒置熒光顯微鏡
下觀察，結果見附圖3。 以上結果顯示ATRP加速胚胎干細胞的標志性分子0ct4的丟失，胚胎干細胞發生 分化。 實施例2 ATRP對胚胎干細胞神經分化的影響實驗
采用下述方法進行檢測 (l)FACs檢測分化得到的Sox嚴P陽性的神經前體細胞比例 將分化不同時間的細胞用0. 05%的胰酶消化制成單細胞懸液；在流式細胞儀上 進行GFP熒光的檢測，結果見附圖4 ; (2)細胞免疫熒光檢測分化得到的Soxl^陽性的神經前體細胞分布情況
46C胚胎干細胞分化培養3天；0. 01M PBS洗三次后，直接置于倒置熒光顯微鏡下 觀察，結果見附圖5; (3) RT-PCR檢測神經前體細胞和神經干細胞的標志(Pax6、 Nestin、 BLBP、
Prominin、01ig2、Musashi)、神經元的標志(Tujl、 Map2、 NCAM)的mRNA表達水平 收集46C胚胎干細胞樣品、成年小鼠大腦組織和第1、3、5、10天的分化細胞樣品；
總RNA獲得方法、逆轉錄方法及PCR方法同前，結果見附圖6 ; (4)細胞免疫熒光檢測Nestin陽性的神經干細胞分布情況
46C胚胎干細胞分化培養3天；用4%多聚甲醛固定；以1 : 200抗Nestin抗體 (Chemicon公司)稀釋液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下 觀察，結果見附圖7; (5) Western blot檢測未成熟神經元的標志Tujl的表達情況 收集46C胚胎干細胞樣品和第7、9、11天的分化細胞樣品；用裂解液裂解(裂解
液成分20mM Tris-HC1， pH 7.4，2% Triton X_100， 10mM EDTA，5mM NaF and lmM sodium
orthovanadate);加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)和12%聚丙烯酰胺凝膠(分離膠)
上進行蛋白質電泳；電泳后用硝酸纖維素膜(Pall公司)轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1小
時；抗Tujl抗體(R&D公司)1 : 200稀釋于5%脫脂奶粉，孵育硝酸纖維素膜4。C過夜；二
抗孵育后，ECL法發光；用凝膠成像系統(Bio-Rad公司)采集圖像，結果見附圖8 ; (6)細胞免疫熒光檢測MAP2陽性的神經元和GFAP陽性的膠質細胞分布情況 46C胚胎干細胞分化培養9和11天；用4X多聚甲醛固定；以1 : 200抗MAP2抗
體(Sigma公司)稀釋液和1 : 400抗GFAP抗體(Chemicon公司)稀釋液4。C孵育過夜；
二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結果見附圖9。 以上結果顯示ATRP促進神經前體細胞、神經干細胞、神經元和膠質細胞的標志性
分子的提前出現，促進了胚胎干細胞向神經細胞的分化。 實施例3胚胎干細胞分化早期ATRP對ERK磷酸化的影響實驗 采用下述方法進行檢測 (1) Western blot檢測在胚胎干細胞分化早期ERK的磷酸化水平
收集46C胚胎干細胞分化12小時的細胞樣品；用裂解液裂解(裂解液成 分20mM Tris-HCl， pH 7.4，2 % Triton X_100，10mM EDTA，5mM NaF andlmM sodium orthovanadate);加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)和12%聚丙烯酰胺凝膠(分離 膠)上進行蛋白質電泳；電泳后用硝酸纖維素膜(Pall公司)轉膜；5%脫脂奶粉室溫封 閉1小時；抗ERK抗體(Cell Signaling公司)或抗磷酸化ERK抗體(Cell Signaling公 司)l : 500稀釋于5X脫脂奶粉，孵育硝酸纖維素膜4t:過夜；二抗孵育后，ECL法發光；用 凝膠成像系統(Bio-Rad公司)采集圖像，結果見附圖10 ; [OO74] (2) RT-PCR檢測ERK的靶基因Elkl的表達情況 收集46C胚胎干細胞樣品、成年小鼠大腦組織和第1、3、5、10天的分化細胞樣品； 總RNA獲得方法、逆轉錄方法及PCR方法同前，結果見附圖11。 以上結果顯示胚胎干細胞分化早期，ATRP促進ERK的磷酸化，進而促進其耙基因 Elkl的表達。 實施例4 ERK信號通路的抑制劑對ATRP促神經誘導功能的影響實驗
采用下述方法進行檢測 (1)細胞免疫熒光檢測使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352后 Sox嚴P陽性的神經前體細胞的分布情況 46C胚胎干細胞在ATRP和ERK信號通路的抑制劑同時存在情況下分化培養116小 時；0.01M PBS洗三次后，直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察，結果見附圖12 ;
(2)FACs檢測使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352后SoxlGFP陽性 的神經前體細胞比例
將在ATRP和ERK信號通路的抑制劑同時存在情況下分化92小時的細胞用0. 05% 的胰酶消化制成單細胞懸液；在流式細胞儀上進行GFP熒光的檢測，結果見附圖13。
以上結果顯示ERK信號通路的抑制劑可以阻斷ATRP的促神經誘導功能。
實施例5神經干細胞的獲得與鑒定
(1) 46C胚胎干細胞單層貼壁培養 將46C胚胎干細胞以lOVcm2度接種于細胞培養皿上，用N2B27作為培養液；
(2)神經干細胞的出現和篩選 培養6天后，以PBS消化細胞，克隆化密度接種于細胞培養皿上，仍用N2B27作為 培養液；培養1天后，熒光顯微鏡下觀察出現大范圍Soxl^綠色熒光，表明有大量神經前體 細胞存在，改用含有EGF和bFGF各lOng/ml的N2B27作為培養液，并用嘌呤霉素篩選神經 干細胞； (3)神經干細胞的克隆化培養 篩選2天后，用含有EGF和bFGF的N2/B27作為培養液培養2周，挑出克隆，用含 有EGF和bFGF的N2/B27作為培養液擴增神經干細胞克隆，獲取克隆化的神經干細胞；
(4)神經干細胞的鑒定 1)細胞免疫熒光鑒定神經干細胞呈特異性標志Nestin陽性
用4%多聚甲醛固定神經干細胞；以1 : 200抗Nestin抗體(Chemicon公司)稀 釋液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結果見附圖 14 ; 2)細胞免疫熒光鑒定神經干細胞的分化潛能 在N2B27培養液中培養得到的神經干細胞一周；用4 %多聚甲醛固定細胞；以 1 : 200抗MAP2抗體(Sigma公司)稀釋液和1 : 400抗GFAP抗體(Chemicon公司)稀釋 液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結果見附圖15。
以上結果顯示成功獲得神經干細胞，并且該神經干細胞能夠分化為表達MAP2的 神經元和表達GFAP的神經膠質細胞。 實施例6神經干細胞植入阿爾茨海默病模型小鼠及其對動物認知能力的影響實 驗 (1)神經干細胞植入阿爾茨海默病模型小鼠 1)所選動物8月齡雄性小鼠，每只體重約30-35g 2)注射靶位右側腦室 3)注射細胞數2. OiU，" 105細胞 (2)Morris迷宮測試檢測動物的認知能力 細胞植入6周后，用Morris迷宮對實驗動物進行為期15天的行為學測試，檢測了 潛伏期、III象限時間百分比和第15天的中心區域時間百分比等指標，結果見附圖16-18。 注III象限為站臺所在象限。 以上結果顯示神經干細胞腦內移植可以明顯改善阿爾茨海默病模型小鼠的學習 記憶能力。
權利要求
一種神經細胞誘導劑，其特征在于含有式I的化合物，F2008102080861C0000011.tif
2. —種誘導胚胎干細胞成為神經細胞的方法，其特征在于采用權利要求1所述的化合 物通過細胞學、組織化學、分子生物學和生物化學實驗，對所述的化合物促進ERK磷酸化的 作用及其促進胚胎干細胞誘導分化的作用進行分析；通過細胞學、組織化學和動物行為學 實驗對神經干細胞治療阿爾茨海默病模型小鼠進行分析，從正反兩方面證實所誘導的胚胎 干細胞成為神經細胞。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的化合物在制備促進胚胎干細胞誘導 分化為神經細胞中的用途。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的誘導分化得到的神經干細胞在制備 治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及促進胚胎干細胞分化為神經細胞的誘導劑；該誘導劑的分子結構；該類誘導劑作為藥物化合物誘導胚胎干細胞成為神經細胞的方法；應用該誘導劑分化得到的神經干細胞植入模型動物腦內治療阿爾茨海默病的用途。經動物實驗，結果從正反兩方面證實了本發明誘導劑能通過促進ERK的磷酸化發揮作用；誘導分化得到的神經干細胞能通過立體定位植入阿爾茨海默病模型小鼠腦內可以明顯改善模型小鼠的學習記憶功能。本發明的化合物進一步可制備促進胚胎干細胞誘導分化為神經細胞的藥物，其所誘導分化得到的神經干細胞可制備治療阿爾茨海默病藥物。
文檔編號A61P25/28GK101768569SQ20081020808
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月29日 優先權日2008年12月29日
發明者吳興中, 宋后燕, 陸建峰 申請人:復旦大學