專利名稱：一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及人體修復材料技術領域，特別是指一種能提高修復材料強度的膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組織修復材料的制備方法。
技術背景膠原是一種細胞外基質(ECM),屬于結構蛋白質，約占哺乳動物蛋白質總 質量的1/3，是構成皮膚、韌帶、軟骨、肌腱等結締組織或器官的主要成分， 同時膠原也是具有支撐器官、保護機體功能的重要結構蛋白。I型膠原是纖維 形成的膠原，是多細胞生物的細胞外基質的主要結構大分子，對維持骨結構的 完整及骨生物力學特性非常重要。將透明質酸引入到膠原中，能綜合發揮蛋白 質與糖胺聚糖兩種生物大分子的優勢，改善濕態力學性能，但是膠原仍然存在 與其他天然材料一樣的弱點——力學性能差。此外，膠原基組織修復材料在人 體生理環境中降解速度過快，也使其在組織工程支架、骨缺損及皮膚創面修復 方面的應用不夠理想，也限制其在某些特定生物學領域的應用。生物玻璃是一種硅酸鹽類的異質骨移植材料，具有不同于其它生物活性 材料的獨特屬性，與骨和軟組織都有良好的結合特性。當生物玻璃植入骨缺損 部位，在生物玻璃與體液之間會發生迅速的離子交換反應，在生物玻璃表面形 成含碳酸根的羥基磷灰石層(也稱碳酸羥基磷灰石層，hydroxyl-carbonate-apatite, HCA)層，通過該HCA層使材料與骨形成牢固的化學鍵合。雖然生物玻璃具 有良好的生物活性和生物相容性，但是由于其機械強度低，脆性大，因而嚴重 限制了這類材料在骨修復及骨組織工程中的應用。為了克服單一材料在性能上的缺陷，迄今，國內外生物復合材料領域取得 了許多研究進展。例如中國專利200610035107.5公開了--種復合三維多孔骨 組織工程支架材料及其制備方法和應用。雖然該制備方法獲得的復合材料具有 良好的生物活性和生物相容性，但是其力學性能和抗降解性能仍較低。 發明內容本發明究，提供一種不僅生物活性和生物相容性好，且與基體結合強度高、孔隙率適 當，并能有效提高力學性能和降解性能的膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組織修復材料的制備方法。 實現本發明目的是通過如下措施來實現的。一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組織修復材料的制備方法， 其特征在于本發明通過調節I型膠原與生物玻璃之間的比例和復合后溶液的 pH值，使構成組織修復材料網絡結構的膠原纖維束的直徑增大，從而改變復合材料顯微形貌，該方法包括如下步驟及其工藝條件(1) I型膠原與生物玻璃的復合在I型膠原溶液攪拌的狀態下加入生物玻璃，然后再攪拌1 3小時，得到 兩者的混合液；所述I型膠原與生物玻璃質量比為0.25 4:1;(2) 靜置分層將I型膠原與生物玻璃混合液在0 4。C下，靜置1 3天后，獲取混合液的 白色絮狀沉淀物；(3) 抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體 積的1/2 1/4，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠 液攪拌至均勻；(4) 調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑，調節pH值至8 10，所述生物緩沖 劑選自2-(N-嗎啡啉)乙磺酸或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽；(5) 加入透明質酸按照透明質酸與I型膠原的質量比為1:4 8，把透明質酸加入到上述步驟 (4)的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻；(6) 交聯在上述步驟(5)的溶液中加入交聯劑，攪拌1 3小時得到均勻溶液，所 述交聯劑的添加量與I型膠原的質量比為1:4 6;所述交聯劑選自l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)，或戊二醛，其中采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 (EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)混合交聯劑時，它們之間的質量比為(7) 成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在0 4。C下放置12 24小時后，成型 為樣品；(8) 冷凍干燥將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理12 24小時后脫模；再放入冷凍干燥 機內冷凍干燥處理24 48小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸 (Col/BG/HYA)組織修復材料。為了更好地實現本發明，上述方法的優選方法為 步驟(1)中，所述生物玻璃為鈣磷硅系生物活性玻璃。 所述鈣磷硅系生物活性玻璃為CaO-P205-Si02或Na20_CaO-P205-Si02系生 物玻璃。所述I型膠原與鈣磷硅系生物活性玻璃質量比為0.33 3:1。步驟(4)中，所述生物緩沖劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。步驟(5)中，所述透明質酸與I型膠原的質量比為1:5 7。步驟(6)中，所述l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)混合交聯劑質量比1.5: 1;交聯劑的的添加量與I型膠原的質量比為1: 5。本發明與現有技術相比具有如下突出的優點和效果1、本發明制備的膠原/生物玻璃/透明質酸(Cd/BG/HYA)組織修復材料 與基體結合強度高、孔隙率適當，力學性能和降解性能較現有技術提高。在制 備I型膠原/生物玻璃/透明質酸(Cd/BG/HYA)組織修復材料過程中，通過 調節I型膠原與生物玻璃之間的比例和調節復合后溶液的pH值，來增強膠原 纖維束之間的相互吸引作用，增強其聚集狀態，從而使得構成復合材料網絡結 構的膠原纖維束的直徑增大，達到了調控材料的顯微形貌以提高其力學強度的 目的。本發明膠原纖維束直徑由一般現有技術獲得的64nm左右，增加到 400-600nm左右，粗纖維間相互交織形成網絡結構，使材料的力學強度有效改 善。本發明的膠原-生物玻璃復合材料的孔隙率在80%左右，大孔孔徑在200u m左右，本發明中的復合材料的抗壓強度為1.5469土0.0995Mpa，而按照現有 技術中國專利200610035107.5制備的復合材料的抗壓強度僅為0.4827± 0. i584MPa。明質酸(Col/BG/HYA)組織修復 材料與現有技術相比，降解性能有很大的改善和提高，在模擬體液SBF中浸泡 28天后，純1型膠原的質量為原質量的30.85±10.55%，按照現有技術中國專 利200610035107.5制備的復合材料的質量為原質量的57.31±7.48%，而生物 玻璃的質量為原質量的104.30±2.06%，本發明制備的復合材料的質量為原質 量的106. 30±1. 34%。3、 本發明將I型膠原與生物玻璃及其它生物大分子物質進行復合，使材 料既能保持良好的生物活性和生物相容性，其力學性能也得到顯著改善；而且 對材料形狀沒有特別要求，可以制備成柱狀材料、膜材料及表面多孔材料。該 Col/BG/HYA組織修復材料植入人體有利于組織的生長，不僅用于骨組織工程 和骨修復，還可用于軟組織修復，為Col/BG/HYA組織工程復合材料廣泛應用 于組織工程領域提供可能。4、 本發明相對現有技術而言，工藝較簡單，成本較低，且操作簡便，易 于工業化推廣應用。
圖1為本發明實施例1 Coi/BG/HYA組織修復材料的掃描電鏡(SEM) 放大100倍的圖片；圖2為本發明實施例1 Col/BG/HYA組織修復材料的掃描電鏡(SEM) 放大10000倍的圖片；圖3為本發明實施例1 Col/BG/HYA組織修復復合材料與I型膠原支架、 現有技術制備的復合材料的抗壓強度測試結果比較；圖4為本發明實施例1 Col/BG/HYA組織修復材料與I型膠原支架、現有 技術制備的復合材料的在模擬體液中的降解情況比較。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。實施例1(1) I型膠原與生物活性玻璃的復合 在I型膠原溶液攪拌的狀態下，按I型膠原與生物活性玻璃質量比為0.33:1的比例加入CaO-P2(VSi02系生物玻璃，然后攪拌2小時，得到兩者的 混合液，其中CaO-P205-Si02系生物活性玻璃是通過溶膠-凝膠法制備；(2)靜置分層-將I型膠原與生物玻璃混合液在4°C下，靜置3天后，獲取混合液的白色 絮狀沉淀物；<3)抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體 積的1/4，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠液 攪拌至均勻；(4) 調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，調節pH值至9;(5) 加入透明質酸按照透明質酸與I型膠原的質量比為1:6，把透明質酸加入到上述步驟(4) 的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻；(6) 交聯采用l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (NHS)的混合交聯劑，"(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)的質量比為1.5:1;混合交聯劑的添加量與I型膠原的質量比 為1:5，在上述步驟(5)的溶液中加入混合交聯劑，攪拌2小時得到均勻溶液；(7) 成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在4。C下放置24小時后，成型為樣品；(8) 冷凍干燥將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理24小時后脫模；再放入冷凍干燥機內冷凍干燥處理48小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組 織修復材料。如圖1和圖2所示，圖l主要表征了，所得到樣品孔隙及孔徑的情況，大 孔孔徑有200Pm，其中又附有很多小孔徑，比較有利于細胞及營養物質的進 入；從圖2中，可以看出，對樣品強度增強起主要作用的是這些廣泛分布于支 架中的膠原纖維束，這些膠原纖維束直徑大約為400-600nm,比原膠原纖維直 徑64nm左右，大了很多，對材料強度的增強作出了主要貢獻，這種微觀結構 也未見報道。同時從圖3中，也可以看出有增強膠原纖維束出現的材料的抗壓 強度有明顯的提高。I型膠原支架的抗壓強度為0.0047土0.0014MPa，按照中 國專利200610035107.5制備的一種復合三維多孔骨組織工程支架材料的抗壓本發明制備的復合材料的抗壓強度提高為1.5469 士0.0995MPa。圖4是將I型膠原、按照現有技術中國專利200610035107.5制 備的一種復合材料，生物玻璃和本發明制備的的復合材料分別浸泡于模擬體液 SBF中，來考察各自的質量變化，在SBF中浸泡28天后，它們的質量分別是 原質量的30.85±10. 55%、 57. 31±7, 48%、 104. 30±2. 06%和106. 30±1. 34%， 這說明本發明的修復材料在降解性能上有了很大的提高。 實施例2(1) I型膠原與生物活性玻璃的復合-在I型膠原溶液攪拌的狀態下，按I型膠原與生物活性玻璃質量比為 0.25:1的比例加入Na20-CaO-P2CVSi02系生物玻璃，然后攪拌2小時，得到兩 者的混合液，其中Na20-CaO-P205-Si02系生物活性玻璃是通過熔融法制備；(2) 靜置分層將I型膠原與生物玻璃混合液在0°C下，靜置1天后，獲取混合液的白色 絮狀沉淀物；(3) 抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體 積的1/2，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠液 攪拌至均勻；(4) 調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，調節pH 值至9;(5) 加入透明質酸按照透明質酸與I型膠原的質量比為1:4，把透明質酸加入到上述步驟(4) 的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻-，(6) 交聯采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (NHS)的混合交聯劑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)的質量比為1:1;混合交聯劑的添加量與I型膠原的質量比為 1:4，在上述步驟(5)的溶液中加入混合交聯劑，攪拌i小時得到均勻溶液；(7) 成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在0°C下放置12小時后，成型為樣品；將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理12小時后脫模；再放入冷凍干燥機內冷凍干燥處理24小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組 織修復材料，其性能測試結果基本與實施例1相同。 實施例3(1) I型膠原與生物活性玻璃的復合 在I型膠原溶液攪拌的狀態下，按I型膠原與生物活性玻璃質量比為1:1的比例加入CaO-P20s-Si02系生物玻璃，然后攪拌3小時，得到兩者的混合液， 其中CaO-P205-Si02系生物活性玻璃是通過溶膠-凝膠法制備；(2) 靜置分層將I型膠原與生物玻璃混合液在1。C下，靜置3天后，獲取混合液的白色 絮狀沉淀物；(3) 抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體 積的1/4，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠液 攪拌至均勻；(4) 調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，調節pH值至9; <5)加入透明質酸 按照透明質酸與I型膠原的質量比為1:5,把透明質酸加入到上述步驟(4) 的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻；(6) 交聯在上述步驟(5)的溶液中加入交聯劑戊二醛，攪拌2小時得到均勻溶液， 所述交聯劑的添加量與I型膠原的質量比為1:5;(7) 成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在4。C下放置24小時后，成型樣品；(8) 冷凍干燥將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理24小時后脫模；再放入冷凍干燥機內 冷凍干燥處理48小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Coi/BG/HYA)組 織修復材料，其性能測試結果基本與實施例1相同。實施例4(1) I型膠原與生物活性玻璃的復合在I型膠原溶液攪拌的狀態下，按I型膠原與生物活性玻璃質量比為3:1 的比例加入Na20-CaO-P20s-Si02系生物玻璃，然后攪拌1小時，得到兩者的混 合液，其中Na20-CaO-P205-Si02系生物活性玻璃是通過熔融法制備；(2) 靜置分層將I型膠原與生物玻璃混合液在3°C下，靜置2天后，獲取混合液的白色 絮狀沉淀物；(3) 抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體 積的1/3，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠液 攪拌至均勻；(4) 調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，調節pH 值至8;(5) 加入透明質酸按照透明質酸與I型膠原的質量比為1:7，把透明質酸加入到上述步驟(4) 的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻；(6) 交聯采用l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (NHS)的混合交聯劑，l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)的質量比為2:1;混合交聯劑的添加量與I型膠原的質量比為 1:6，在上述步驟(5)的溶液中加入混合交聯劑，攪拌3小時得到均勻溶液；(7) 成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在4。C下放置12小時后，成型為樣品；(8) 冷凍干燥將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理12小時后脫模；再放入冷凍干燥機內 冷凍干燥處理48小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組 織修復材料，其性能測試結果基本與實施例1相同。實施例5(1) I型膠原與生物活性玻璃的復合 在I型膠原溶液攪拌的狀態下，按I型膠原與生物活性玻璃質量比為4:1的比例加入CaO-P20s-Si02系生物玻璃，然后攪拌2小時，得到兩者的混合液， 其中CaO-P205-Si02系生物活性玻璃是通過溶膠-凝膠法制備；(2) 靜置分層將I型膠原與生物玻璃混合液在4。C下，靜置3天后，獲取混合液的白色 絮狀沉淀物；(3) 抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體積的1/4，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠液 攪拌至均勻；(4) 調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，調節pH值至10;(5) 加入透明質酸按照透明質酸與I型膠原的質量比為1:8，把透明質酸加入到上述步驟(4) 的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻；(6) 交聯采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (NHS)的混合交聯劑，l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)的質量比為3:1;混合交聯劑的添加量與I型膠原的質量比為 L-6，在上述步驟(5)的溶液中加入混合交聯劑，攪拌3小時得到均勻溶液；(7) 成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在4°C下放置24小時后，成型為樣品；(8) 冷凍干燥將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理24小時后脫模；再放入冷凍干燥機內 冷凍干燥處理48小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組 織修復材料，其性能測試結果基本與實施例1相同。
權利要求
1、一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制備方法，其特征在于本發明通過調節I型膠原與生物玻璃之間的比例和復合后溶液的pH值，使構成組織修復材料網絡結構的膠原纖維束的直徑增大，從而改變復合材料顯微形貌，該方法包括如下步驟及其工藝條件(1)I型膠原與生物玻璃的復合在I型膠原溶液攪拌的狀態下加入生物玻璃，然后再攪拌1～3小時，得到兩者的混合液；所述I型膠原與生物玻璃質量比為0.25～4∶1；(2)靜置分層將I型膠原與生物玻璃混合液在0～4℃下，靜置1～3天后，獲取混合液的白色絮狀沉淀物；(3)抽濾先將步驟(2)的白色絮狀沉淀物抽濾，抽慮至沉淀物的體積縮小為原體積的1/2～1/4，即形成具有膠原纖維之間相互交錯分布的粘稠液，然后再把粘稠液攪拌至均勻；(4)調節pH值在上述均勻粘稠液中加入生物緩沖劑，調節pH值至8～10，所述生物緩沖劑選自2-(N-嗎啡啉)乙磺酸或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽；(5)加入透明質酸按照透明質酸與I型膠原的質量比為1∶4～8，把透明質酸加入到上述步驟(4)的粘稠液中，再次攪拌至溶液均勻；(6)交聯在上述步驟(5)的溶液中加入交聯劑，攪拌1～3小時得到均勻溶液，所述交聯劑的添加量與I型膠原的質量比為1∶4～6；所述交聯劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，或戊二醛，其中采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺混合交聯劑時，它們之間的質量比為1～3∶1；(7)成型將上述步驟(6)的溶液注入模具，在0～4℃下放置12～24小時后，成型為樣品；(8)冷凍干燥將樣品置于超低溫冰箱中冷凍處理12～24小時后脫模；再放入冷凍干燥機內冷凍干燥處理24～48小時，制得一種膠原/生物玻璃/透明質酸(Col/BG/HYA)組織修復材料。
2、 根據權利要求1所述的一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制 備方法，其特征在于步驟(1)中，所述生物玻璃為鈣磷硅系生物活性玻璃。
3、 根據權利要求1或2所述的一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料 的制備方法，其特征在于所述鈣磷硅系生物活性玻璃為CaO-P205-Si02或 Na20-CaO-P205-Si02系生物玻璃。
4、 根據權利要求1或2所述的一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料 的制備方法，其特征在于所述I型膠原與鈣磷硅系生物活性玻璃質量比為 0.33 3:1。
5、 根據權利要求1所述的一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制 備方法，其特征在于步驟(4)中，所述生物緩沖劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。
6、 根據權利要求1所述的一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制 備方法，其特征在于步驟(5)中，所述透明質酸與I型膠原的質量比為1:5 7。
7、 根據權利要求1所述的一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制 備方法，其特征在于步驟(6)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 和N-羥基硫代琥珀酰亞胺混合交聯劑質量比1.5:1;交聯劑的添加量與I型膠 原的質量比為1: 5。
全文摘要
本發明公開了一種膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料的制備方法，該方法包括I型膠原與生物玻璃的復合、靜置分層、抽濾、調節pH值、加入透明質酸、交聯、成型和冷凍干燥等步驟。在本發明制備膠原/生物活性玻璃/透明質酸復合組織修復材料過程中，通過調節I型膠原與生物玻璃之間的比例和調節復合后溶液的pH值，使構成組織修復材料網絡結構的膠原纖維束的直徑增大，調整了材料的顯微形貌，從而達到了提高其力學強度的目的。本發明所述膠原/生物玻璃/透明質酸組織修復材料在力學性能和降解性能均有改善，能廣泛應用于醫療領域中，不僅可用于組織工程支架，還可用于骨缺損修復和軟組織損傷修復。
文檔編號A61L27/40GK101601869SQ20091004046
公開日2009年12月16日 申請日期2009年6月23日 優先權日2009年6月23日
發明者剛 吳, 孟永春, 張娟娟, 徐彩霞, 王迎軍, 苗國厚, 趙娜如, 陳曉峰 申請人:華南理工大學