專利名稱：一種巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米粒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒、 其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
納米粒是指粒徑介于IO-IOOOnm之間的固態(tài)膠體粒子。由于其可提高藥物溶解性 和穩(wěn)定性，延長體內(nèi)循環(huán)時間，且具有良好的緩控釋效果，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和基因藥物 給藥系統(tǒng)。現(xiàn)有技術(shù)公開了眾多制備納米粒的方法，包括溶劑揮發(fā)法、表面聚合法、乳化法、 自組裝法等。荷正電的聚合物分子與荷負(fù)電的藥物通過靜電作用自組裝形成納米粒，制備 過程無需使用有機(jī)溶劑及加熱、劇烈震蕩等手段，可有效保持藥物活性，因此已被廣泛應(yīng)用 (Mao et al.，J Pharm Sci 2006,95 1035-48)。殼聚糖是自然界中唯一存在的堿性多糖，由于其無毒、可生物降解及生物相容性 良好的，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、食品、醫(yī)藥、水處理、化妝品等領(lǐng)域。但殼聚糖僅溶于少數(shù)酸 性溶液，限制了其應(yīng)用。殼聚糖季胺鹽是殼聚糖經(jīng)季胺化修飾后的產(chǎn)物，在中性條件下易 溶。對于蛋白質(zhì)多肽藥物口服給藥而言，殼聚糖季胺鹽在中性條件下荷較強(qiáng)的正電，可與荷 負(fù)電的小腸黏液層作用，增強(qiáng)黏膜黏附性；其通過與帶負(fù)電荷的生物黏膜表面的類脂質(zhì)作 用，打開小腸上皮細(xì)胞間緊密連結(jié)，促進(jìn)親水性大分子藥物經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運和吸收(vander Merwe et al. ,Eur J Pharm Biopharm 2004，58 :225_35)。此外，荷正電的殼聚糖季胺鹽還 可與生理條件下荷負(fù)電的蛋白質(zhì)藥物，如胰島素，通過靜電作用和聚電解質(zhì)效應(yīng)縮合形成 納米粒，從而進(jìn)一步提高藥物的穩(wěn)定性，促進(jìn)藥物經(jīng)胞內(nèi)途徑和Peyer’ s結(jié)的攝取途徑吸 收。對于基因傳釋而言，荷正電的殼聚糖季胺鹽與荷負(fù)電的核酸分子在一定的比例下可縮 合形成表面帶正電的納米復(fù)合物。其可與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜作用，促進(jìn)核酸分子經(jīng)胞吞、胞 飲等途徑入胞，產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)染。此外，納米復(fù)合物還能有效防止細(xì)胞內(nèi)外的核酸內(nèi)切酶和核 酸外切酶對核酸分子的降解(Kean et al.，J Control Release 2005，103 143-53.)。巰基化聚合物(Thiomer)作為一種新型的黏膜黏附性材料，是親水性高分子聚合 物的側(cè)鏈經(jīng)巰基化合物修飾所得的產(chǎn)物。研究報道，生理條件下其可與黏膜黏液層糖蛋白 中富含半胱氨酸的區(qū)域形成二硫鍵，以共價鍵緊密結(jié)合于黏膜，延長藥物在體內(nèi)的滯留時 間，提高藥物的局部濃度，促進(jìn)藥物吸收(Bernkop-Schnurich et al. ,Adv Drug Deliv Rev 2005,57 :1569-82)。目前已對殼聚糖、海藻酸、聚丙烯酸、卡波普、羧甲基纖維素鈉等高分子 聚合物進(jìn)行了巰基化修飾，其黏膜黏附力提高了幾倍至上百倍。巰基化聚合物還可通過抑 制酪氨酸磷酸酶的活性和P糖蛋白促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物的小腸吸收。此外，巰基化殼聚糖，如殼 聚糖-巰基乙酸共聚物(Lee et al. ,Pharm Res 2006，24 157-67)、殼聚糖_4_巰基-丁基 脈共聚物(Schmitz et al. , Biomaterials 2007,28 :524_531)等，也已應(yīng)用于基因傳釋系 統(tǒng)。巰基化殼聚糖上的氨基質(zhì)子化荷正電，與負(fù)電荷PDNA縮合形成納米復(fù)合物，提高pDNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染。然而，由于巰基化殼聚糖在中性條件下溶解度較差，因此限制了其進(jìn)一步應(yīng)用,

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米 粒、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的納米粒由荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽和荷負(fù)電的蛋白 質(zhì)多肽藥物或核酸藥物經(jīng)聚電解質(zhì)作用生成。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種巰基化殼聚糖季胺鹽，所述的巰基化殼聚糖季 胺鹽為殼聚糖的氨基依次經(jīng)季胺化修飾和巰基化修飾所得的共聚物，其中殼聚糖重均分子 量為30 1，OOOkDa,季胺化度為15 80 % (摩爾百分?jǐn)?shù))，巰基化修飾物為半胱氨酸或巰 基乙酸，(根據(jù)1H NMR計算而得，方法參見Eur J Pharm Biopharm 2004，57 :77_83)，游離 巰基修飾率為40 400 μ mol/g, 二硫鍵修飾率為60 600 μ mol/g。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述的巰基化殼聚糖季胺鹽為殼聚糖季胺鹽-半胱氨酸共 聚物，其具有下式結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
一種巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的自組裝納米粒由荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽和荷負(fù)電的蛋白質(zhì)多肽藥物或核酸藥物經(jīng)聚電解質(zhì)作用生成，其中，所述的巰基化殼聚糖季胺鹽為殼聚糖的氨基依次經(jīng)季胺化修飾和巰基化修飾所得的共聚物，其中殼聚糖重均分子量為30～1,000kDa，季胺化度為15～80％，摩爾百分?jǐn)?shù)，巰基化修飾物為半胱氨酸或巰基乙酸，所述的巰基化殼聚糖季胺鹽游離巰基修飾率為40～400μmol/g，二硫鍵修飾率為60～600μmol/g。
2.按權(quán)利要求1所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，其中所述的 巰基化殼聚糖季胺鹽，按如下步驟制備(1)合成殼聚糖季胺鹽，反應(yīng)時間為45 240min；所得殼聚糖季胺鹽以Cl_型陰離子 交換樹脂純化，冷凍干燥；其中反應(yīng)45、120、180和240min所得殼聚糖季胺鹽的季胺化度分 別為 15%、30%、60%和 80% ；(2)殼聚糖季胺鹽和巰基化修飾物溶于水中，殼聚糖季胺鹽和巰基化修飾物的質(zhì)量比 為32 1 1 10，加入終濃度分別為50 500mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳 二亞胺鹽酸鹽(EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，調(diào)節(jié)pH至3. 0 5. 0，室溫反應(yīng)2 8h，透析，冷凍干燥，得巰基化殼聚糖季胺鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的巰 基化殼聚糖季胺鹽制備方法步驟(2)中所述的殼聚糖季胺鹽和巰基化修飾物的質(zhì)量比為 1 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的巰 基化殼聚糖季胺鹽制備方法步驟(2)中所述的EDAC和NHS的終濃度分別為300mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的巰 基化殼聚糖季胺鹽制備方法步驟(2)中所述的反應(yīng)時間為5h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的巰 基化殼聚糖季胺鹽/蛋白質(zhì)多肽藥物自組裝納米粒由荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽和荷 負(fù)電的蛋白質(zhì)多肽藥物組成。
7.如權(quán)利要求6所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述蛋白質(zhì) 多肽藥物選自胰島素、降鈣素、干擾素、抗利尿激素、奧曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、依諾肝 素、紅細(xì)胞生長素、血紅蛋白、白蛋白、細(xì)胞色素、各種生長因子白介素、集落刺激因子、抗原 或抗體中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述巰基 化殼聚糖季胺鹽/核酸藥物自組裝納米粒由荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽和荷負(fù)電的核 酸藥物組成。
9.如權(quán)利要求8所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的核酸 藥物選自DNA、RNA、低聚核苷酸或多核苷酸中的一種。
10.如權(quán)利要求9所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的DNA 為質(zhì)粒DNA。
11.如權(quán)利要求10所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述的質(zhì) 粒DNA可以表達(dá)蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄成小分子干擾RNA。
12.如權(quán)利要求6或8所述巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述納米粒的平均粒徑為50 500nm。
13.如權(quán)利要求6或8所述巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述納米 粒的平均粒徑為80 150nm。
14.如權(quán)利要求6或8所述巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述納米 粒Zeta電勢為-20 50mV。
15.如權(quán)利要求6或8所述巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述納米 粒Zeta電勢為10 30mV。
16.如權(quán)利要求6或8所述巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述納米 粒的包封率為20 95%。
17.如權(quán)利要求6或8所述巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒，其特征在于，所述納米 粒的包封率為80 90%。
18.一種制備如權(quán)利要求6所述巰基化殼聚糖季胺鹽/蛋白質(zhì)多肽藥物自組裝納米粒 的方法，其特征在于按如下步驟制備(1)巰基化殼聚糖季胺鹽溶于水，蛋白質(zhì)多肽藥物溶于酸性溶液中并調(diào)節(jié)pH至7.0 9. 0 ；(2)攪拌下將蛋白質(zhì)多肽藥物溶液滴加至巰基化殼聚糖季胺鹽溶液中，巰基化殼聚糖 季胺鹽與蛋白質(zhì)多肽藥物的質(zhì)量比為1 5 5 1;(3)室溫攪拌15 60min，荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽與荷負(fù)電的蛋白質(zhì)、多肽藥物 經(jīng)聚電解質(zhì)作用自組裝形成納米粒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的巰基化殼聚糖季 胺鹽與蛋白質(zhì)多肽藥物的質(zhì)量比為1 2 2 1。
20.一種制備如權(quán)利要求8所述巰基化殼聚糖季胺鹽/核酸藥物自組裝納米粒的方法， 其特征在于按如下步驟制備(1)巰基化殼聚糖季胺鹽和和核酸藥物分別溶于PH6.0磷酸緩沖液(PBS，20mM)中；(2)攪拌下將核酸藥物溶液滴加至巰基化殼聚糖季胺鹽溶液中，巰基化殼聚糖季胺鹽 與核酸藥物的質(zhì)量比為1 1 30 1 ；(3)室溫攪拌15 60min，荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽與荷負(fù)電的核酸藥物經(jīng)聚電 解質(zhì)作用自組裝形成納米粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的巰基化殼聚糖季 胺鹽與核酸藥物的質(zhì)量比為15 1 25 1。
22.權(quán)利要求6所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒在口服給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求8所述的巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒在基因傳釋系統(tǒng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米粒技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的巰基化殼聚糖季胺鹽由殼聚糖依次經(jīng)季胺化和巰基化修飾而成。本發(fā)明的納米粒由荷正電的巰基化殼聚糖季胺鹽和荷負(fù)電的蛋白質(zhì)多肽藥物或核酸藥物經(jīng)聚電解質(zhì)作用生成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該納米粒的制備過程簡單易控，無需使用有機(jī)溶劑，可有效提高藥物穩(wěn)定性。該納米粒促蛋白質(zhì)藥物小腸吸收和促核酸藥物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的功效顯著優(yōu)于現(xiàn)有的殼聚糖季胺鹽納米粒。
文檔編號A61K47/48GK101940551SQ20091005453
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者印春華, 唐翠, 殷黎晨, 毛裕民, 趙鑫, 顧少華 申請人:復(fù)旦大學(xué)