專利名稱：甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于納米粒技術領域，具體涉及一種甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用。
背景技術：
納米粒是指粒徑為10-1000 nm之間的固態膠體粒子，其可提高藥物溶解性和穩定性，延長體內循環時間，且具有良好的緩控釋效果，已廣泛應用于蛋白質多肽藥物和核酸藥物給藥系統。現有技術公開了多種納米粒制備方法，包括溶劑揮發法、表面聚合法、乳液聚合法等方法制備納米粒，使用的有機溶劑、加熱和劇烈機械作用均可能造成生物大分子藥物活性降低甚至失活。荷正電的聚合物與荷負電的離子交聯劑通過靜電作用自組裝形成納米粒，同時包載荷負電的藥物，制備過程無需使用有機溶劑及加熱、劇烈震蕩等手段，可有效保持藥物活性，適于制備生物大分子納米給藥載體(Mao et al., J Pharm Sci 2006,95:1035-48)ο近年來，殼聚糖及其衍生物由于其無毒、生物可降解和生物相容，已被廣泛應用于工業、食品、醫藥和化妝品等領域。殼聚糖衍生物N，N, N-三甲基殼聚糖季胺鹽(Trimethyl chitosan, TMC)在中性條件下荷正電，溶解性好，用于口服給藥時，黏膜黏附性好且可促進親水性大分子藥物經細胞旁路轉運和吸收；用于基因傳釋系統時，可增強細胞黏附并促進細胞攝取和轉染。巰基化聚合物用于口服給藥時，可緊密結合于黏膜，延長所載藥物滯留時間，提高局部藥物濃度，促進藥物吸收，并發揮促滲作用；用于基因傳釋系統時，可通過與細胞膜糖蛋白形成二硫鍵促進細胞攝取，提高轉染效率。靶向給藥即運用載體將藥物選擇性地傳輸、濃集并釋放于病變的靶器官、靶組織或靶細胞，以降低其對正常組織的毒副作用，提高藥物利用率。納米粒表面偶聯特異性的靶向分子(特異性的配體、單克隆抗體等)，通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，可實現主動靶向治療。通過糖類識別機制實現細胞特異靶向給藥已經引起人們極大的興趣。其中甘露糖受體(MR)尤為重要。甘露糖修飾的殼聚糖(MC)可通過甘露糖受體介導的胞吞作用促進pDNA轉染樹突狀細胞，CT46荷瘤BALB/c小鼠瘤內注射MC/DNA復合物可引起腫瘤血管增生抑制、腫瘤細胞周期停滯和細胞凋亡，顯著抑制CT46腫瘤的生長和轉移(Kim et al., Mol Cancer Ther 2006，5 1723-32)。可是，上述甘露糖修飾的藥物載體無黏膜黏附性，限制其作為口服給藥載體的應用，且與殼聚糖相比，MC在巨噬細胞的轉染效率提高低于 1.5倍，并未有效發揮甘露糖的主動靶向作用。我們發明了一種巰基化殼聚糖季銨鹽自組裝納米粒(中國專利，200910(^4537.5，
公開日2011年1月12日)，其可有效促進胰島素的口服吸收和提高質粒的體內外轉染。但由于其不具有靶向特異性基團，無法更有效提高小腸上皮細胞、位于小腸Peyer’ s結中M細胞和巨噬細胞的攝取，降低吸收和轉染效率，從而限制其作為口服給藥載體的有效使用。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用。本發明第一方面，提供甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒。該納米粒由荷正電的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽和荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用生成，同時包載荷負電的蛋白質多肽藥物或核酸藥物。其中
所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽為殼聚糖的氨基依次經季銨化修飾、甘露糖修飾和巰基化修飾所得的共聚物，其中殼聚糖重均分子量為30-1,000 kDa，季銨化度為15-60% (摩爾百分數)(根據1H NMR計算而得，方法參見Eur J Pharm Biopharm 2004, 57:77-83)，甘露糖修飾物為甘露吡喃異硫氰酸苯酯，甘露糖修飾度為10-50%(根據 NMR計算而得，方法參見ht J Pharm 2009，375 133-9)，巰基化修飾物為半胱氨酸或巰基乙酸，游離巰基修飾率為40-200 μ mol/g, 二硫鍵修飾率為60-300 μ mol/g。在本發明的優選例中，所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽為甘露糖修飾殼聚糖季銨鹽-半胱氨酸，其具有下式結構
權利要求
1.一種甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于由荷正電的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽和離子交聯劑經聚電解質作用生成，同時包載蛋白質多肽藥物或核酸藥物；其中，所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽為殼聚糖的氨基依次經季銨化修飾、甘露糖修飾和巰基化修飾所得的共聚物，其中殼聚糖重均分子量為30-1，000 kDa ；所述季銨化度為15-60%，摩爾百分數；甘露糖修飾物為甘露吡喃異硫氰酸苯酯，所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽的甘露糖修飾度為10-50%，摩爾百分數；巰基化修飾物為半胱氨酸或巰基乙酸，所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽游離巰基修飾率為40-200 ymol/g，二硫鍵修飾率為60-300 μ mol/g0
2.根據權利要求1所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述離子交聯劑選自三聚磷酸鈉、硫酸鎂、Y-聚谷氨酸、透明質酸、丙烯酸樹脂的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述蛋白質多肽藥物選自胰島素、降鈣素、干擾素、抗利尿激素、奧曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、依諾肝素、紅細胞生長素、血紅蛋白、白蛋白、細胞色素、各種生長因子、白介素、集落刺激因子、 抗原或抗體中的一種；所述核酸藥物選自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一種。
4.根據權利要求3所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述的 DNA為質粒DNA ；所述的RNA為siRNA、shRNA或microRNA中的一種。
5.根據權利要求1一4之一所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述納米粒的平均粒徑為50-1000 nm。
6.根據權利要求1-4之一所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述納米粒的kta電勢為10-40 mV。
7.根據權利要求1-4之一所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述納米粒對蛋白質多肽藥物或核酸藥物的包封率為60-100%。
8.—種如權利要求1一7之一所述甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽，離子交聯劑，蛋白質多肽藥物核酸藥物溶于水；(2)將甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和蛋白質多肽藥物的混合溶液中，其中甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與離子交聯劑的質量比為2:1-15:1，離子交聯劑與蛋白質多肽藥物的質量比1:5-15:1 ；(3)室溫靜置，荷正電的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑、蛋白質多肽藥物經聚電解質作用形成納米粒。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽按如下步驟制備(1)合成殼聚糖季銨鹽，反應時間為45-180min ；所得殼聚糖季銨鹽以Cl_型陰離子交換樹脂純化、冷凍干燥；其中反應45、120和180 min所得的殼聚糖季銨鹽的季銨化度分別為 15%、30% 和 60% ；(2)殼聚糖季銨鹽和甘露吡喃異硫氰酸苯酯分別溶于水和二甲基亞砜中，殼聚糖季銨鹽和甘露吡喃異硫氰酸苯酯的質量比為1 1-25 1，調節pH至8. 5-9. 5，室溫反應6- h，超濾，冷凍干燥，得甘露糖修飾的殼聚糖季銨鹽；(3)甘露糖修飾殼聚糖季銨鹽和半胱氨酸溶于水中，甘露糖修飾殼聚糖季銨鹽和巰基化修飾物的質量比為32:1-1:5，加入終濃度為50-500 mM的1-乙基_3_(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，調節pH至3. 0-5. 0,室溫反應2-8 h，透析，冷凍干燥，得甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽。
10.權利要求1一7之一所述的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備口服給藥系統或者基因傳釋系統中的應用。 全文摘要
本發明屬于納米粒技術領域，具體為一種甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用。本發明的納米粒由荷正電的甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽和荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用生成，同時包載荷負電的蛋白質多肽類藥物或核酸藥物。其中甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽由殼聚糖的氨基依次經季銨化、甘露糖配體和巰基化修飾而成。該納米粒的制備過程無需使用有機溶劑，可有效提高藥物穩定性。該納米粒可主動靶向小腸上皮細胞、M細胞和巨噬細胞，有效提高口服藥物的小腸吸收并改善核酸藥物的轉染效率，效果顯著優于現有殼聚糖類納米粒。
文檔編號A61K47/36GK102380103SQ20111033304
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者何春柏, 印春華, 唐翠, 殷黎晨 申請人:復旦大學