專利名稱：：具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種蘇木提取物的制備方法，具體為一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法。
背景技術：
：蘇木簡介，蘇木為豆科小喬木或灌木蘇木的干燥心材，味甘、咸、微辛，入心、肝、脾，能活血化瘀、消腫之痛。近年來的研究表明，蘇木除具有傳統的功效之外，尚具有免疫抑制、抗移植排斥反應、降低血糖等多種作用。20世紀70年代日本學者發現蘇木水提取液在體外對腫瘤細胞具有較強的抑制作用，國內也有這方面報道。例如蘇木精對人類膀胱癌T24細胞的殺傷及誘導凋亡作用，《腫瘤研究與臨床》，2008年12月第20巻第12期，P799-801。蘇木精與順鉑、羥喜樹堿等藥物腹腔化療對小鼠肝癌HepA細胞抑制作用的比較，《腫瘤研究與臨床》，2009年2月第21巻第2期，P84-86。在上述論文中，對蘇木提取得到的灌注液進行了相關的動物實驗，并且得到了該灌注液對小鼠移植性肝癌具有顯著的抑制作用，以及對人體膀胱癌細胞具有殺傷及誘導調亡的作用的實驗結論。但是該灌注液并沒有經過人體臨床試驗，還不具有應用價值，也并沒有公開其具體的提取工藝。
發明內容本發明為了解決現有技術中存在的具有特定效果的蘇木提取的問題而提供了一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法。本發明是由以下技術方案實現的，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，2、加入3-5倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的12-16%,4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20。C下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20。C下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀并加熱濃縮最后得到加水總量10%的蘇木提取濃縮液。該提取液可以制成注射液或者粉針劑以供臨床使用。經過小鼠的不同藥物實驗證實，本提取液對小鼠肝癌株HEPA具有顯著的抑制作用，具體結果為對照組動物的平均生存天數為15.99-16.33天，順鉑組為32.98-41.89天，羥喜組為20.79-38.47天，絲裂霉素組為35.77-40.06天，本灌注液組為36.35-39.81天，該灌注液對人體膀胱癌T24細胞具有誘導凋亡和直接殺傷作用。具體實驗過程在
背景技術：
中所述的論文中已經詳細地做出說明。經過臨床53例病人使用證實，本發明所得到的灌注液的近期有效率達到100%,<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發明(代號為PGF)與現有常用的抗癌藥物體外對臨床病歷膀胱癌患者細胞的藥敏對比實驗見附圖7所示意，在研究中申請人還發現，本發明所述的灌注液對卵巢癌細胞也具有顯著的生長抑制及誘導凋亡作用。本實驗以人卵巢癌細胞株SK0V3為靶細胞，采用細胞培養法，流式細胞儀檢測技術，電子顯微鏡技術分析得出本發明所述的灌注液對腫瘤細胞的生長抑制及誘導凋亡作用機制。以下為實驗結果分析1、材料主要試劑卵巢癌細胞株SKOV3由中國醫學科學院腫瘤研究所免疫室惠贈。1640培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司，RNasin與PI購自美國sigma公司，蘇木購自山西省藥材公司。儀器美國B-D公司的流式細胞檢測儀型號FACSCalibur，日本投射式電子顯微鏡。所使用的藥物為本發明所述的提取物灌注液。以人卵巢癌細胞株SKOV3作為耙細胞，通過繪制生長曲線觀察PGF對細胞增殖的影響，電鏡觀察細胞顯微結構差異，流式檢測細胞的凋亡作用及周期阻滯。方法1、稱取1000克粉碎后的蘇木，2、加入4000克的純化水，室溫下浸泡12-24小時，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液;合并三次得到的提取液,減壓濃縮至1500克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到最后的蘇木提取濃縮液1000克。結果及結論結果(1):將SKOV3細胞培養，選兩瓶SKOV3細胞分對照組和實驗組，實驗組的藥物濃度為50ng/ml，藥物作用16小時后，消化收集于EP管中，離心1000轉/5分，棄上清。放入戊二醛固定液中4。C固定1小時，將團塊取出，整塊再放入固定液中1小時，之后將團塊放入緩沖液中，常規電鏡包埋，切片，觀察細胞顯微結構。如圖3左側圖所示意，經臺盼蘭染色后，光鏡下見細胞胞質減少，核固縮、深染，電鏡下見染色質凝集成新月形緊貼與核膜周邊，核膜結構不清，細胞核碎裂，呈團塊狀或顆粒狀，可見凋亡小體形成。結果(2)細胞計數，繪制細胞生長曲線取對數生長期SKOV3細胞，消化、加入RPMI-1640培養液調整細胞濃度為1X10Vml,分別接種于9個25ml培養瓶，每瓶3ml。培養24小時使細胞貼壁。24小時后，其中一瓶為對照不加PGF，其余每瓶加入0.6mlPGF，從上午九點開始每小時消化一瓶細胞、離心1000轉/5分、臺盼蘭染色，計數活細胞數，每瓶細胞計數三次，取三次的平均值，繪制生長曲線。見圖4細胞計數，繪制細胞生長曲線從九點至十七點計數細胞數結果見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>SKOV3細胞在同一藥物濃度下隨作用時間的延長死亡率明顯升高。結果(3),如圖5所示意，電鏡觀察顯微結構左側對照組細胞體積較大，核大，核仁明顯，染色質粗細不一，部分核呈空泡，核分裂多見，核膜結構清晰。右側實驗組部分細胞核染色質濃縮成塊狀，有些染色質聚集在核膜邊緣或貼近核膜，染色質逐漸發生斷裂，部分核膜逐漸崩解，有些染色質呈分葉狀或形成粗細不均勻的碎塊并相互分離，不均勻的分散于細胞質中，有些細胞質中出現空泡，呈現出凋亡的典型變化。結果(4)，流式細胞技術檢測細胞凋亡和細胞周期分布情況選用生長良好的細胞加入PGF液，使濃度分別達到0，25ug/ml,50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml加藥后培養19小時，消化收集細胞，離心(1000轉/4分)PBS洗兩次，尼龍篩過濾成單細胞懸液，加入凋亡試劑AnnexinV-FITC避光十五分后上機檢測細胞凋亡情況。另選一組細胞，分別加入PGF,使藥物濃度分別達到0，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml。加藥后培養16h，胰酶消化收集細胞，冰預冷PBS洗滌兩次，2ml70。/。冷乙醇固定過夜。PBS洗滌，過濾，10ug/mlRNAase室溫孵育15分，加入濃度為50ug/ml的PI避光染色15分，流式細胞儀檢測細胞周期分布。細胞凋亡和細胞周期分布流式分析結果顯示PGF能使細胞發生凋亡和阻止，25ug/ml,50ug/ml，100ug/ml,200ug/ml的PGF處理SKOV3細胞后隨著藥物濃度的升高，細胞的生長逐漸受到抑制，凋亡率明顯增加；^期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少，與對照組相比，差異顯著。不同濃度PGF作用于SKOV3細胞后，均有細胞凋亡現象，且隨藥物濃度的增加凋亡率增加平行對照組早期凋亡率0.93%，晚期凋亡率2.73%，總凋亡率為3.66%。25ug/ml組早期凋亡率2.97%，晚期凋亡率6.55%，總凋亡率為9.52°/。。50ug/ml早期凋亡率1.69°/。，晚期凋亡率8.71%，總凋亡率為10.40%。100ug/ml早期凋亡率7.57%，晚期凋亡率30.93%，總凋亡率為38.50%。200ug/ml早期凋亡率10.35%,晚期凋亡率60.73%，總凋亡率為71.08%。體外培養的細胞經不同濃度的PGF處理后，細胞生長明顯受到抑制。流式細胞儀分析證實細胞凋亡率隨PGF濃度的增高而增加。結果見下表及附圖6:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>體外培養的細胞經不同濃度的PGF處理后，細胞生長明顯受到抑制。流式細胞儀分析證實細胞周期的G1期隨PGF濃度的增高而增加。見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>期實驗結果表明未加PGF的對照組，卵巢癌細胞生長良好，加入不同劑量PGF對SK0V3細胞的生長都具有明顯的抑制作用，PGF具有顯著抑制SK0V3細胞增殖及誘導細胞發生凋亡作用。流式檢測細胞凋亡率其對卵巢癌細胞的殺傷作用是通過誘導細胞凋亡途徑實現的。并且隨著藥物濃度的增加細胞的早及中晚期凋亡率都明顯升高，以中晚期凋亡最為明顯，在低劑量濃度下早期凋亡率的改變不明顯，只有中晚期凋亡率變化較大，在高劑量濃度下早期凋亡增加，但其幅度遠小于中晚期凋亡。對照組凋亡率與實驗組凋亡率差異有統計學意義。細胞周期的檢測顯示卵巢癌細胞SK-OV-3對蘇木素具有藥物敏感性，其對卵巢癌細胞的殺傷作用可能和抑制細胞的DNA合成有關。Gl期即為DNA合成前期，為進入S期準備必要的基本條件，其中最主要的是RNA和蛋白質的合成。Gl期隨著藥物濃度的增加而增加，說明PGF對細胞的作用主要在于抑制細胞的DAN合成前期。圖1為本提取液的紫外光燈(365nm)下薄層檢視圖象(從左到右依次為l樣品l、2蘇木對照藥材、3樣品2、4陰性、5樣品3、6陰性、7樣品1、8蘇木對照藥材、9樣品2、10樣品3)圖2為日光下檢視圖譜象圖3為實驗組PGF培養30分和對照組PBS培養30分對比照片圖4生長曲線圖5左為正常生長的卵巢癌細胞照片，右為經過本發明提取物處理后的卵巢癌細胞照片圖6a為對照組，圖6b為25ug/ml組，圖6c為50ug/ml組，圖6d為100ug/ml組，圖6e為200ug/ml組圖7為本發明藥物與各類抗癌藥物體外對臨床病例膀胱癌患者細胞的藥敏對比實驗具體實施例方式實施例l，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，1、稱取1000克粉碎后的蘇木，原料藥物必須確定品種及來源，干燥，粉碎成直徑1-2毫米長1-3厘米碎塊，2、加入3000克的純化水，室溫下浸泡12-24小時，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至1000克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到蘇木提取濃縮液700克。7、再減壓濃縮得到固體干燥物，可以作為藥物成品用注射用水稀釋后作為臨床使用。實施例2，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，1、稱取1000克粉碎后的蘇木，原料藥物必須確定品種及來源，干燥，粉碎成直徑1-2毫米長1-3厘米碎塊，2、加入4000克的純化水，室溫下浸泡12-24小時，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至1500克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2crc下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20'C下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到濃蘇木提取濃縮液1000克。7、再加純化水4000ml，灌裝，每瓶裝40ml，充填氮氣熔封，115'C高壓滅菌60分鐘。實施例3，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，1、稱取1000克粉碎后的蘇木，原料藥物必須確定品種及來源，干燥，粉碎成直徑1-2毫米長1-3厘米碎塊，2、加入3500克的純化水，室溫下浸泡12-24小時，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2500克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2500克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至1200克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20。C下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到蘇木提取濃縮液850克。7、減壓濃縮，干燥，滅菌，分裝。使用時以4(TC注射用水配制成含量為0.2%的溶液使用。權利要求1、一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，其特征在于步驟包括，(1)、稱取一定量粉碎后的蘇木，(2)、加入3-5倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時，(3)、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的12-16％，(4)、將濃縮液在-20℃下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(5)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20℃下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(6)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20℃下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀并加熱濃縮最后得到加水總量10％的蘇木提取濃縮液。2、根據權利要求1所述的具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，其特征在于步驟包括，(1)、稱取一定量粉碎后的蘇木，(2)、加入4倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時，(3)、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的15%，(4)、將濃縮液在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(5)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(6)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀并加熱濃縮最后得到加水總量10%的蘇木提取濃縮液。全文摘要本發明涉及一種蘇木提取物的制備方法，具體為一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法。解決現有技術中存在的具有特定效果的蘇木提取的問題。步驟包括，稱取一定量粉碎后的蘇木，加入3-5倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時，煮沸30分鐘分離出提取液；再加入水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的12-16％，將濃縮液在-20℃下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20℃下冷凍結冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀。得到的產物具有顯著的抗腫瘤效果。文檔編號A61P35/00GK101683380SQ20091007434公開日2010年3月31日申請日期2009年5月11日優先權日2009年5月11日發明者任連生,蕻張,王國平申請人:山西省腫瘤醫院