專利名稱：：一種防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑及其制備方法，屬于獸藥領域。
背景技術：
：痢疾和腹瀉是獸醫臨床上常見的消化道疾病，多數是由大腸桿菌、沙門氏菌、球菌等引起的，在畜禽各種疾病中發病率很高，一年四季均可發病。獸醫臨床上對畜禽腹瀉的治療主要采用抗生素或化學藥物，治療效果不佳，致病菌的耐藥性越來越嚴重。治療此病的中藥有止痢散、雛痢凈、白頭翁散、烏梅散等，這些藥物劑型主要是傳統散劑，技術含量低，質量粗糙，用量大，適口性差，見效慢，生物利用度低，因此防治畜禽腹瀉性疾病效果不理想，同時造成了中藥資源的極大浪費。現代中藥發酵制藥技術是在繼承傳統中藥炮制學發酵法的基礎上，吸取了微生態學研究成果，結合現代生物工程發酵技術而形成的高科技中藥制藥新技術，是從中藥(天然藥物)制藥方面尋找藥物的新療效，具有很大的研究價值和市場開發意義。研究表明，微生物生長代謝過程中可以產生豐富而強大的酶系，可以將中藥的藥物成分分解轉化，將不能被人體或動物體吸收的有效組分降解成小分子活性物質，而被機體直接吸收利用，或產生新的活性組分，改變藥性，降低毒副作用，從而大大提高藥物療效和治療范圍。由白頭翁、黃柏、黃連、秦皮組成的中藥方劑，為古代藥學名著《傷寒論》中的治痢名方，組方嚴謹，被稱為"白頭翁湯"，主要功能為清熱解毒，涼血止痢。后世常變通應用于多種病證。《中國獸藥典》中收錄了白頭翁散，用來治療畜禽腹瀉性疾病。目前，國內外未見將白頭翁散全方進行微生物轉化并制成相應制劑的研究報道
發明內容本發明的目的是提供一種見效快、效果明確的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑。本發明的另一個目的是提供該防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的制備方法。本發明還提供了包含該防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的飼料。本發明的中藥生物制劑是利用微生物對白頭翁散進行發酵代謝后制備而成，實現了傳統中藥方劑與現代生物技術的有機結合。本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供一種防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑，此制劑是將微生物接種到包含白頭翁散的培養基中進行發酵制備而成。本發明所述的白頭翁散包括如下組分和重量份數白頭翁2080份、黃柏3060份、秦皮2080份、黃連1050份。其中，所述的微生物為酵母菌。所述的酵母菌為產朊假絲酵母和/或釀酒酵母。本發明的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑可為口服液、粉劑、片劑、顆粒劑、緩釋制劑、丸劑、微囊劑、注射劑或其他藥劑學上可接受的劑型。本發明還提供了該防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備菌種培養液將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，2832°C，150200rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0Xl(TVfu/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為38%，培養溫度2832'C，攪拌轉速180220rpm，二級種子液活菌含量在1.0Xl(T9cfu/ml時，停止培養，備用；(2)培養基的制備取配方量的中藥材，粉碎成80120目的藥材細粉，裝入發酵罐中，加入占中藥重量510%的麩皮、15%葡萄糖、0.11.0%尿素、0.52.0%K2HPO4，加水至含水量在4060%，調節pH至45，滅菌2025min;(3)冷卻后，按發酵物總重量的510%將(1)中的菌種發酵液接入到(2)的培養基中，于2837。C恒溫培養2472h，攪拌轉速150250rpm，當活菌含量達到1.OX108~9cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮至相對密度為1.01.2，加入藥學上常用輔料制成相應劑型。進一步，本發明的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的制備方法還可包括如下步驟步驟(4)得到的濃縮發酵液經過噴霧干燥或冷凍干燥后，加入輔料制成預混劑。本發明的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑還可以直接添加到飼料中，制成包含該中藥生物制劑的伺料。本發明的原料含有白頭翁、黃柏、秦皮、黃連四味藥，現代研究表明，白頭翁含有原白頭翁素、白頭翁皂苷；黃連、黃柏含有小檗堿、藥根堿；秦皮含有七葉苷、七葉內酯等活性成分，通過微生物發酵后使藥物更容易吸收，藥效更充分。本發明的中藥生物制劑與傳統中獸藥比較有如下優點1、傳統中獸藥散劑適口性差、內服后有效成分不易從植物細胞中游離出來被機體充分吸收，生物利用度低，而煎劑在制備過程中對中藥有效成分破壞性大，降低了藥物應有的療效。微生物發酵轉化中藥，反應條件溫和，可以最大限度的保護中藥有效成分免遭破壞，同時，可使某些有效成分含量增加及產生新的藥物成分，從而提高藥物療效、擴大適應癥、減少服用劑量；2、白頭翁散經過微生物代謝后制備的中藥生物制劑，在畜禽腹瀉性疾病的治療效果上大大優于傳統的白頭翁散及其煎劑。通過以下實施例將更具體的說明本發明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發明，而不是以任何方式限制本發明的范圍。具體實施例方式實施例l本發明中藥生物制劑的制備白頭翁散組成白頭翁60份、黃柏50份、秦皮60份、黃連30份制備方法(1)將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，30°C，180rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0X108~9cfu/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為6%，培養溫度30'C,攪拌轉速220rpm，二級種子液活菌含量達到1.0Xl(T9cfu/ml時，停止培養，備用；(2)取上述配方量的中藥材，粉碎成120目的藥材細粉，加入占中藥重量10%的麩皮、2%葡萄糖、0.5%尿素、1.0%K2HP04，加水至含水量為50%，調節pH至4，滅菌20min;(3)冷卻后，按發酵物總重量的10%將(1)中的菌種培養液接入到(2)的培養基中，于30'C恒溫培養72h，攪拌轉速250rpm，當活菌含量達到1.0X109cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮相對密度為1.0;(5)濃縮后的發酵液加水至200份，過濾，分裝，滅菌，即制成口服液，lml溶液相當于原生藥lg。實施例2本發明中藥生物制劑的制備白頭翁散組成白頭翁80份、黃柏60份、秦皮80份、黃連50份制備方法(1)將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，3CTC，180rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0Xl(TVfu/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為8%，培養溫度30。C，攪拌轉速220rpm，二級種子液活菌含量達到1.0Xl(T9cfu/ml時，停止培養，備用；(2)取上述配方量的中藥材，粉碎成IOO目的藥材細粉，加入占中藥重量8%的麩皮、3%葡萄糖、0.7%尿素、1.5%&朋04加水至含水量為60%，調節pH至4.5,滅菌25min;(3)冷卻后，按發酵物總重量的8%將(1)中的菌種培養液接入到(2)的培養基中，于32'C恒溫培養48h，攪拌轉速180rpm，當活菌含量達到1.0X109cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮至相對密度為l.l，再加入適量蔗糖、糊精，制軟材并過篩制粒；濕顆粒干燥、整粒，檢測，分裝，即制備成顆粒劑，每lg相當于原生藥lg。實施例3本發明中藥生物制劑的制備白頭翁散組成白頭翁50份、黃柏45份、秦皮50份、黃連45份制備方法-(1)將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，29°C，190rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0Xl(T9CfU/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為5%，培養溫度29'C，攪拌轉速200rpm，二級種子液活菌含量達到1.0Xl(T9cfu/ml時，停止培養，備用；(2)取上述配方量的中藥材，粉碎成90目的藥材細粉，加入占中藥重量9%的麩皮、4%葡萄糖、0.8%尿素、0.7%K2HP04,加水至含水量為55%，調節pH至5，滅菌25min;(3)冷卻后，按發酵物總質量的9%將(1)中的菌種培養液接入到(2)的培養基中，于29'C恒溫培養60h，攪拌轉速200rpm，當活菌含量達到1.0X109cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮至相對密度為1.2,再噴霧干燥得到固體粉末，加入適量乙醇作潤濕劑制軟材，制粒，干燥，再加入硬脂酸鎂混合均勻，壓片，即制成片劑，每片相當于原生藥0.5g。實施例4本發明中藥生物制劑的制備白頭翁散組成白頭翁70份、黃柏40份、秦皮40份、黃連40份制備方法(1)將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，30°C,200rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0X108~9cfu/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為4%，培養溫度3(TC，攪拌轉速220rpm，二級種子液活菌含量達到1.0Xl(T9cfu/ml時，停止培養，備用；(2)取上述配方量的中藥材，粉碎成IOO目的藥材細粉，加入占中藥重量7%的麩皮、5%葡萄糖、0.6%尿素、0.5%K2HP04，加水至含水量為45%，調節pH至4，滅菌20rain;(3)冷卻后，按發酵物總重量的7%將(1)中的菌種培養液接入到(2)的培養基中，于28'C恒溫培養36h，攪拌轉速150rpm,當活菌含量達到1.0X109Cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮至相對密度為1.2，噴霧干燥，再加入適量輔料玉米芯粉后混合均勻，8即制備成預混劑。實施例5本發明中藥生物制劑的制備白頭翁散組成白頭翁20份、黃柏30份、秦皮20份、黃連10份制備方法-(1)將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，29°C，200rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0Xl(T9cfu/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為7%，培養溫度29'C,攪拌轉速200rpm，二級種子液活菌含量達到1.0Xl(T9cfu/tnl時，停止培養，備用；(2)取上述配方量的中藥材，粉碎成IOO目的藥材細粉，加入占中藥重量5%的麩皮、1%葡萄糖、0.4%尿素、1.2%K2HP04，加水至含水量為40%，調節pH至4，滅菌20min;(3)冷卻后，按發酵物總重量的5%將(1)中的菌種培養液接入到(2)的培養基中，于3rC恒溫培養24h，攪拌轉速220rpm，當活菌含量達到1.0X109cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮至相對密度為1.2，再加入適量可溶性淀粉、糊精后混合均勻，烘干，粉碎，過篩，即制成粉劑，每lg相當于原生藥5g。以下通過具體試驗例來說明本發明的中藥生物制劑的有益效果。試驗例1本試驗例是按實施例1的方法制備的口服液對人工發病仔豬白痢的臨床治療試驗。1、材料與方法1.1供試藥物白頭翁散煎劑(生藥含量為lg/ml)、本發明的口服液。1.2菌種大腸桿菌0139，中國獸藥監察所提供。1.3受試動物200頭體重約為22土lkg左右的健康斷奶仔豬。1.4試驗方法1.4.1動物分組將200頭仔豬隨機分成5組，每組40頭，其中1，2，3,4組為藥物治療組，5組為陽性對照組。91.4.2人工發病先將保存菌種接種于普通營養平板，37"C恒溫培養18小時，然后挑取典型菌落接種于普通肉湯中，37'C恒溫培養18小時取出，以生理鹽水稀釋至濃度為5X108cfu/ml，經預試驗后，除空白對照組外，其它各組攻毒量為每頭豬肌注5ml菌液。待仔豬出現腹瀉、排白色粥樣糞便、食欲減退等典型癥狀時開始用藥。1.4.3用藥方法l組為白頭翁散煎劑(lg/ml)治療組，灌服給藥，每頭豬35ml/次，一天2次，連用3天；2組為本發明口服液高劑量組(lg/ml)，灌服給藥，每頭豬35ml/次，一天2次，連用3天；3組為本發明口服液中劑量組(0，5g/ml)，灌服給藥，每頭豬35ml/次，一天2次，連用3天；4組為本發明口服液低劑量組(0.25g/ml)，灌服給藥，每頭豬35ml/次，一天2次，連用3天；5組為陽性對照組，感染發病后不給藥。各組試驗豬均飼喂不含藥物的全價飼料。1.5療效評價指標治愈率經用藥治療后臨床癥狀完全消失，精神及飲食欲恢復正常為治愈，統計治愈數，計算治愈率。有效率經用藥治療后臨床癥狀明顯減輕，精神及飲食欲好轉者或治愈的，均視為有效，統計有效數，計算有效率。死亡率治療期間因用藥無效而死亡，統計死亡數，計算死亡率。1.6數據分析與處理生物統計用t檢驗和卡方檢驗進行數據分析。試驗結果見表1。2、結果表1對人工發病仔豬白痢的治療效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發明的中藥口服液高、中、低劑量組及白頭翁散煎劑組對人工發病的仔豬白痢的有效率與陽性對照組比較差異極顯著(P〈0.01);本發明的中藥口服液中劑量組的有效率與白頭翁散煎劑組相比較差異不顯著(PX).05);說明本發明的發酵制劑僅需要未發酵制劑50%的劑量就可以達到未發酵制劑的治療效果。試驗例2本試驗例是用本發明實施例4制備的預混劑預防仔豬黃白痢的試驗，取得了良好的試驗效果。選擇所產仔豬有黃白痢病史的31頭母豬，隨機分成3組。l組為本發明的預混劑組，產前5天開始用藥，在飼料中按0.5%添加本發明預混劑，連續用藥5天；2組為白頭翁散組，同樣產前5天開始用藥，在飼料中按1.0%添加白頭翁散，連續用藥5天；3組為對照組，飼料中不添加任何藥物；3個組的飼養條件相同。記錄出生仔豬發病頭數及死亡頭數，計算各組發病率及死亡率。試驗結果見表2。表2預防仔豬黃白痢的試驗結果組別母豬產仔仔豬發死亡發病率死亡率頭數頭數病頭數頭數(%)(%)111122604.92021011313411.503.54310111622755.8624.32試驗結果表明，懷孕母豬產前使用本發明的中藥生物制劑后，所產仔豬黃白痢的發病率、死亡率與普通散劑組和對照組相比較明顯下降，說明本發明的中藥生物制劑可通過母豬來有效預防出生仔豬黃白痢，降低其死亡率。試驗例3本試驗例是按實施例5制備的中藥粉劑對肉仔雞白痢治療效果的觀察試驗。試驗方法某養雞場提供20日齡肉仔雞，經臨床檢查病雞表現昏睡，怕冷，精神沉郁，食欲減少或不食，翅膀下垂，拉白色漿糊樣糞便，肛門周圍粘連石灰樣糞便等明顯的雞白痢癥狀。剖殺10只病雞，經實驗室檢測為沙門氏菌感染。將雞白痢全血平板凝集反應(用標準血清檢測未知抗原)陽性的肉仔雞750只，隨機分成5組，每組150只。其中l組為本發明的粉劑組；2組為慶大霉素組；3組為氟苯尼考組；4組為白頭翁散煎劑組(生藥含量lg/ml)，5組為對照組，不用藥物治療，4個用藥治療組的用藥劑量及使用方法見表3。各組雞的飼養條件相同，詞料中不添加任何藥物。連續用藥5天，觀察治療效果。試驗結果見表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述試驗結果表明，本發明的中藥生物制劑對雞白痢具有良好的治療效果，能夠有效降低死亡率，治療效果好于西藥組和白頭翁散煎劑組。試驗例4本試驗例是按實施例2的方法制備的中藥顆粒劑對出生羔羊腹瀉的防治效果的觀察試驗。1、材料與方法1.1試驗動物選擇甘肅某牧場4個月內母羊所產的320只羔羊進行試驗。1.2試驗藥物本發明的中藥顆粒劑、白頭翁散煎劑(生藥含量lg/ml)、土霉素。1.3試驗分組按羔羊的出生時間隨機分組，分為3組。試驗l組為本發明制劑組；試驗2組為白頭翁散煎劑組；試驗3組為土霉素對照組。1.4用藥方法出生羔羊吃初乳后馬上給藥，本發明的中藥顆粒劑，按每公斤體重0.51.0g給藥；白頭翁散煎劑組，按每公斤體重0.5lml給藥；對照組，按每公斤體重0.020.05g口服土霉素。各組均日用藥2次，連續用藥35天。每天觀察、記錄各組羔羊腹瀉和死亡情況等臨床癥狀，進行統計、分析。2、結果試驗結果見表5。表5對出生羔羊腹灣的預防效果組別羔羊數腹瀉數腹瀉率成活數成活率死亡數死亡率(只)(只)(%)(只)(只)(只)(%)111098.210797.332.721101210.910191.898.231001515.08888.01212.0注成活數、死亡數均為45日齡時的統計結果。從試驗結果可以看出，本發明的制劑及白頭翁散煎劑可以對出生羔羊的腹瀉起到很好的預防作用，與對照組相比腹瀉率分別降低了6.8%和4.1%,成活率分別提高9.3%和3.8%。本發明的制劑組與對照組之間差異極顯著(P〈O.Ol)o試驗例5本試驗例是按實施例3的方法制備的片劑對犬各種腹瀉治療效果的觀察。1、試驗動物從幾個養犬場中選擇患有急性腸炎、黏液性腸炎、出血性腸炎的病犬共112條供試驗用。2、動物分組及用藥將選定的112條犬分成2組，1組100條犬，為本發明制劑治療組，其中患急性腸炎的犬72條，黏液性腸炎犬8條，出血性腸炎犬20條，用藥量為每公斤體重l片，每日1次，連用35天；2組12條犬作為對照組，不給任何藥物。133、判定標準無效用藥治療5天，癥狀未見改變或病情變嚴重的視為無效。有效用藥治療5天，臨床癥狀減輕或痊愈的均視為有效。治愈用藥治療5天，臨床癥狀消失，患急性腸炎的犬精神正常，嘔吐完全停止，排便正常；患黏液性腸炎的犬精神、體溫、食欲、排便均恢復正常；患出血性腸炎的犬出血停止，排便正常，精神、食欲、體溫恢復正常，鼻鏡潤濕。4、結果試驗結果見表6。表6對犬腹瀉的治療效果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從試驗結果可知，本發明的藥物治療犬各種腹瀉的平均有效率在90%以上，平均治愈率在85%以上，效果較好。權利要求1、一種防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑，其特征在于是將微生物接種到包含白頭翁散的培養基中進行發酵制備而成。2、根據權利要求l所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑，其特征在于所述的白頭翁散包括如下組分和重量份數白頭翁2080份、黃柏3060份、秦皮2080份、黃連1050份。3、根據權利要求l所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑，其特征在于所述微生物為酵母菌。4、根據權利要求3所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑，其特征在于所述的酵母菌為產朊假絲酵母和/或釀酒酵母。5、根據權利要求l所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑，其特征在于所述的制劑為口服液、粉劑、片劑、顆粒劑、緩釋制劑、丸劑、微囊劑、注射劑或其他藥劑學上可接受的劑型。6、根據權利要求l一5任一項所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備菌種培養液將酵母菌菌種接種到YPD培養基中，2832°C，150200rpm搖床培養生產一級種子液，當活菌含量達到1.0X1089cfu/ml時轉接到二級種子液發酵罐擴大培養，接種量為38%,培養溫度2832'C,攪拌轉速180220rpm，二級種子液活菌含量在1.0Xl(T9cfu/ml時，停止培養，備用；(2)培養基的制備取配方量的中藥材，粉碎成80120目的藥材細粉，裝入發酵罐中，加入占中藥重量510%的麩皮、15%葡萄糖，0.11.0%尿素，0.52.0%K2HP04，加水至含水量在40~60%，調節pH至45,滅菌2025min;(3)冷卻后，按發酵物總重量的510%將(1)中的菌種培養液接入到(2)培養基中，于2837'C恒溫培養2472h，攪拌轉速150250rpm,當活菌含量達到1.OX1089cfu/ml時停止發酵；(4)將成熟的固態發酵物用乙醇進行浸提，分離，過濾，濾液精制，發酵液減壓濃縮至相對密度為1.01.2，加入藥學上常用輔料制成相應劑型。7、根據權利要求6所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的制備方法，其特征在于還可進一步包括如下步驟步驟(4)得到的濃縮發酵液經過噴霧干燥或冷凍干燥后，加入輔料制成預混劑。8、一種包含權利要求l一4任一項所述的防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑的飼料。全文摘要本發明公開了一種防治畜禽腹瀉的中藥生物制劑及其制備方法。本發明將傳統方劑與現代微生物轉化技術相結合，利用微生物的強大轉化能力，對傳統的白頭翁散進行發酵代謝制備了一種中藥生物制劑。它是將白頭翁散粉碎，加入麩皮、葡萄糖、尿素、無機鹽、水作為發酵培養基，調節pH值，滅菌后，加入一定比例的菌種培養液，進行發酵，成熟的固態發酵物加入乙醇進行浸提，分離，過濾，濃縮，制備成各種劑型。白頭翁散經酵母菌發酵代謝后所制備的中藥生物制劑，對畜禽腹瀉性疾病的治療效果大大優于白頭翁散及其煎劑。文檔編號A61K36/064GK101664421SQ200910093560公開日2010年3月10日申請日期2009年9月30日優先權日2009年9月30日發明者叢日剛,瀾劉,周德剛,張俊儒,玲田,云莫,冰葛,葛代興,鄧利斌,黃建茹申請人:北京大北農科技集團股份有限公司;北京大北農動物保健科技有限責任公司