本發明涉及生物治療領域，特別涉及一種治療糖尿病的制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
：糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起的。為了有效控制血糖、防止糖尿病并發癥的發生和提高糖尿病患者的生存質量，替代被患者自身免疫系統破壞的胰島素分泌細胞—胰島細胞移植蓬勃興起。遺憾的是胰島細胞的移植仍面臨著兩大難題：①、供體來源不足；②、免疫抑制藥物的長期使用。糖尿病的原因在于就是胰島功能受損，胰島B細胞的數量減少或分泌胰島素的能力下降，以致不足以維持血糖的平衡。胰島B細胞是胰島細胞的一種，屬內分泌細胞，約占胰島細胞總數的70％，主要位于胰島中央部，且胰島B細胞只能由胰島分化而來。胰島功能的受損會導致胰島B細胞越來越少，藥物治療的效果越來越差，所以糖尿病治療的關鍵還是在于胰島B細胞。胰高血糖素樣肽一1(glucagon-likepeptide1，GLP-1)是由人胰高血糖素基因編碼，由腸道L細胞分泌的一種肽類激素，具有以下生理作用：以葡萄糖依賴方式作用于胰島β細胞，促進胰島素基因的轉錄，增加胰島素的生物合成和分泌；刺激β細胞的增殖和分化，抑制β細胞凋亡，從而增加胰島β細胞數量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及攝食，延緩胃內容物排空等。這些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖維持在恒定水平。DPP-Ⅳ是一種細胞表面的絲氨酸蛋白酶。DPP-Ⅳ是一種體內的酶，它主要的作用是在分解體內的蛋白質，其中一種被DPP-Ⅳ分解的蛋白質就是GLP-1。人體自身產生的GLP-1極易被體內的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，其血漿半衰期不足2分鐘，必須持續靜脈滴注或持續皮下注射才能產生療效，這大大限制了GLP-1的臨床應用。然后人們研發了GLP-1類似物，與天然GLP-1分子結構相比有一個氨基酸差異，并增加了一個16碳棕櫚酰脂肪酸側鏈，與天然人GLP-1有95％同源性。由于脂肪酸側鏈的存在，其分子不易被DPP-IV降解，并能與白蛋白結合因而有較高的代謝穩定性，t1/2長達12-14小時。但是GLP-1類似物所作用的時間還是太短了，限制了臨床的使用。因此，研發一種對糖尿病有良好療效且藥效持久的糖尿病治療制劑是本領域技術人員需要解決的技術問題。技術實現要素：有鑒于此，本發明公開了一種治療糖尿病的制劑及其制備方法和應用，所述制劑對糖尿病的治療有效且持久。本發明提供的治療糖尿病的制劑中，按濃度計，包括如下組分：胰島樣細胞0.05×106個/ml～0.5×106個/ml；胰高血糖素樣肽-1類似物0.1mg/ml～0.5mg/ml；二肽基肽酶-4抑制劑0.25mg/ml～0.75mg/ml。一些實施例中，按濃度計，包括如下組分：胰島樣細胞0.25×106個/ml；胰高血糖素樣肽-1類似物0.125mg/ml～0.375mg/ml；二肽基肽酶-4抑制劑0.375mg/ml～0.625mg/ml。一些實施例中，按濃度計，包括如下組分：胰島樣細胞0.25×106個/ml；胰高血糖素樣肽-1類似物0.25mg/ml；二肽基肽酶-4抑制劑0.5mg/ml。一些實施例中，按濃度計，包括如下組分：胰島樣細胞0.25×106個/ml；胰高血糖素樣肽-1類似物0.125mg/ml；二肽基肽酶-4抑制劑0.375mg/ml。一些實施例中，按濃度計，包括如下組分：胰島樣細胞0.25×106個/ml；胰高血糖素樣肽-1類似物0.375mg/ml；二肽基肽酶-4抑制劑0.625mg/ml。優選地，胰高血糖素樣肽-1類似物為利拉魯肽。優選地，二肽基肽酶-4抑制劑為沙格列汀。優選地，所述制劑還包括溶劑，所述溶劑為生理鹽水。本發明還公開了所述制劑的制備方法，包括以下步驟：將所述胰島樣細胞、胰高血糖素樣肽-1類似物和二肽基肽酶-4抑制劑與溶劑混合，制得所述制劑。本發明還公開了所述制劑和所述制備方法制得的制劑在制備治療糖尿病的藥物制劑中的應用。本發明所述制劑中的胰島樣細胞是由臍帶間充質干細胞經高血糖培養基誘導分化制得，所述高血糖培養基中血糖的濃度為25mmol/L。臍帶一直是作為醫療廢物被棄之不用，由羊膜被覆上皮、臍血管和位于兩者之間被稱為華氏膠(Wharton’sJelly)的黏液結締組織組成。主要由肌纖維母細胞樣基質細胞、膠原細胞和蛋白聚糖組成，華氏膠對臍血管起支撐和保護作用，華氏膠中存在著一種成纖維樣細胞，該細胞具有自我更新、增殖和多向分化潛能，被稱之為人臍帶間充質干細胞(Humanumbilicalcordmesenchymalstemcell，hUCMSc)。在體外同樣具有誘導成為骨細胞、脂肪細胞、胰島樣細胞等分化的潛能。其中臍帶來源的間充質干細胞細胞純度高、數量多。具有明顯的優勢：1、成本較低，臍帶是醫學廢棄物；2、來源豐富，全世界每年都有數億新生兒出生；3、不會給捐獻者造成新的創傷和痛苦；4、不涉及倫理問題；5、hUCMSCs是一種較為原始的干細胞，表達某些胚胎干細胞的特異標志，具有極強的可塑性；6、無致瘤活性和低免疫原性；7、與骨髓間充質干細胞相比，不會隨著傳代次數增加和機體年齡增長導致增殖能力和分化能力降低。這些優勢使hUCMSC可能成為一種更具潛力的種子細胞。為體外培養制備胰島細胞和調節免疫排斥治療糖尿病帶來了新希望。臍帶間充質干細胞的分離和培養包括：將臍帶剪成1mm3大小的碎片，加入DMEM/F12培養液，在5％CO2和95％飽和濕度的37℃培養箱中培養；5天后第1次換液，待細胞貼壁生長以后每3天換1次液；當細胞長至70％～80％融合，傳代。臍帶間充質干細胞的分話方法包括：取第3代hU-MSCs，以1×104個/孔密度接種24孔細胞培養板；當細胞長至70％～80％，使用含1％DMSO的無血清DMEM培養基培養3天。更換培養基為不含DMSO但含有10％FBS的高血糖培養基(血糖濃度25mmol/L)，繼續培養7天，可見球狀體的細胞簇形成。繼續培養4天左右，這些球狀體細胞的數目出現顯著增加。這些細胞形態學上類似于胰島細胞，整個誘導周期約需14天。綜上所述，本發明公開了一種治療糖尿病的新型制劑及其制備方法和應用。在該新型制劑中，胰島樣細胞的優選濃度范圍為0.05×106個/ml～0.5×106個/ml，過高或過低的胰島樣細胞濃度都會影響制劑的有效性；二肽基肽酶-4(DPP-Ⅳ)抑制劑可以保護胰高血糖素樣肽一1(GLP-1)類似物的長效作用，在特定比例范圍內，治療效果達到最大。二肽基肽酶-4抑制劑(DPP-Ⅳ抑制劑)具有抑制DPP-Ⅳ的作用。通過抑制人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)在血液中分解，從而提高血液中胰高血糖素樣肽一1(GLP-1)的濃度而發揮作用。本發明還提供了一種治療糖尿病的方法，該方法具體為靜脈滴注本發明提供的治療糖尿病的制劑。本發明公開的新型制劑與現有技術相比，具有如下優點：1、制劑中的胰島樣細胞是由臍帶間充質干細胞誘導分化而成，可以增加機體內胰島B細胞的含量，從而提高內源性胰島素分泌；2、GLP-1類似物能刺激胰島素分泌，能夠保護胰島β細胞，使得外注射的胰島細胞能夠發揮更長的時間的作用效果。而且GLP-1不僅能使患者的體重降低，還能降低患者對胰島素的依賴。同時，GLP-1類似物外加胰島素樣細胞使用方法可以讓GLP-1在人體內的作用持續時間更加延長，可以達到3個月只需注射一次，患者自身的免疫系統就能實現自我調節的效果；3、DPP-Ⅳ抑制劑可以抑制DPP-Ⅳ的作用。由于DPP-Ⅳ的主要作用是分解體內的蛋白質，包括GLP-1，因此，加入DPP-Ⅳ抑制劑可以抑制人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及制劑中的GLP-1類似物在血液的中分解，從而提高血液中內源性GLP-1和外源性GLP-1類似物的濃度而發揮作用。具體實施方式本發明公開了一種治療糖尿病的新型制劑及其制備方法和應用，該制劑可以在有效的治療糖尿病。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。本發明實施例中使用到的成分均為市售或自制來源。實施例組分中的GLP-1類似物使用市售的利拉魯肽，DDP-IV抑制劑使用市售的沙格列汀。實施例1臍帶間充質干細胞誘導分化成胰島樣細胞1、臍帶間充質干細胞的分離和培養選擇足月分娩的臍帶，剪成1mm3大小的碎片，接種于T75培養瓶中，加入DMEM/F12培養液，在5％CO2和95％飽和濕度的37℃培養箱中培養。5天后第1次換液，待細胞貼壁生長以后每3天換1次液。培養期間倒置顯微鏡觀察細胞形態。取第4代臍帶間充質干細胞，PBS洗滌3遍后0.25％胰酶消化30s，鏡下觀察開始細胞脫落并且變圓，加入培養液終止消化，輕柔吹打，制成細胞懸浮液。以800g/min離心5min，調整細胞密度為106/100μl后分裝在8個檢測管中。往8個檢測管中分別加入鼠抗人單克隆抗體CD14-FITC、CD45-FITC、CD79a-APC、CD90-APC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-PE和HLA-DR-PE各10μl，用流式細胞儀檢測細胞表面的抗體表型。結果如下表格1：表12、臍帶間充質干細胞的誘導分化按2×104個/孔的細胞密度接種24孔板，待細胞長至85％，更換成骨/成脂誘導培養液，每3天換液1次。誘導后進行茜素紅染色/油紅O染色以確定其擁有誘導分化的潛能。取第3代hU-MSCs，以1×104個/孔密度接種24孔細胞培養板；當細胞長至70％-80％，使用下述誘導方案進行臍帶間充質干細胞向胰島樣細胞分化的誘導。誘導方案：使用含1％DMSO的無血清DMEM培養基培養3天。更換培養基為不含DMSO但含有10％FBS的高血糖培養基(血糖濃度25mmol/L)，繼續培養7天，可見球狀體的細胞簇形成。繼續培養4天左右，這些球狀體細胞的數目出現顯著增加。這些細胞形態學上類似于胰島細胞，整個誘導周期約需14天。實施例2～5制備制劑表2實施例2～4實施例2實施例3實施例4胰島樣細胞0.25×106個/ml0.25×106個/ml0.25×106個/ml利拉魯肽0.25mg/ml0.125mg/ml0.375mg/ml沙格列汀0.5mg/ml0.375mg/ml0.625mg/ml按照表2處方，將利拉魯肽、沙格列汀在室溫下與20ml生理鹽水混合，制得混合劑，以混合劑重懸實施例1制得的胰島樣細胞，調整細胞密度。充分混勻后置于4℃環境中保存備用。對比例1～4制備制劑表3對比例1～4按照表3處方，將利拉魯肽、沙格列汀在室溫下與20ml生理鹽水混合，制得混合劑，以混合劑重懸實施例1制得的胰島樣細胞，調整細胞密度。充分混勻后置于4℃環境中保存備用。實施例6動物試驗1、建立SD大鼠糖尿病動物模型選擇180～220g的雌雄性健康SD大鼠90只，隨機分組后，對照組80和模型組10只。動物飼養在清潔級環境中，室溫18～22℃，相對濕度為40％～70％。標準配合飼料飼養，每籠5只，自由采食和飲水，勤換墊料，保持飼養環境通風和干燥。SD大鼠經適應性飼養1周后進行造模。造模前測定空腹血糖，禁食12h，模型組按體重給予65mg/kg的鏈脲佐菌素(鏈脲佐菌素以1.1mol/L、pH4.0的檸檬酸緩沖液溶解，臨時配制成4mg/ml濃度)腹腔一次性注射，對照組注射檸檬酸緩沖液。7天后尾靜脈采血測外周血血糖，若注射前血糖水平8mmol/1，注射后血糖維持在16mmol/L以上達兩周的,即可認為造模成功。造模成功后的大鼠表現為多食、多飲、多尿、體重減輕、活動減少、反應遲鈍，且伴有傷口易感染、消瘦、被毛雜亂無光澤、脫毛等癥狀。模型組大鼠在注射鏈脲佐菌素溶液后，前期呈緩慢生長趨勢，隨著血糖的升高，體重逐漸呈現下降趨勢。而對照組的大鼠體重持續增長，隨著時間的延長，對照組和實驗組大鼠的體重差異越來越大。病理觀察發現糖尿病大鼠的胰島明顯萎縮。2、對照試驗模型組SD大鼠80只，隨機分8組，每組均為10只，按照表3制劑方案對大鼠進行靜脈給藥，實驗共進行8周，觀察每組大鼠的血糖水平，記錄在冊，統計如表3表4：實驗分組及每組SD大鼠血糖水平正常大鼠的血糖為：2.8～6.5mmol/L，根據表4的數據可以看出，實驗表明陽性對照組的血糖濃度一直處于高血糖的狀態；給予對比例1的制劑在開始的三周血糖恢復到正常的水平，但三周后又血糖又升高了；給予對比例2的制劑開始的前一周處于高血糖水平，然后從第二周開始，血糖慢慢降到正常的水平，到第七周又有升高的趨勢；給予對比例3的制劑的血糖濃度在4周后開始升高；給予對比例4的制劑的血糖濃度在3周開始升高；給予實施例2的制劑血糖濃度在第7周開始升高；給予實施例3的制劑血糖濃度在第5周開始升高；給予實施例4的的血糖濃度在第10周開始升高。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3