專利名稱：一種新型神經保護劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于神經保護藥物技術領域，尤其是涉及一種抗缺血性中風損傷的新型復合神經保護劑。
背景技術：
隨著平均壽命的延長和生活方式的變更，中風的發病率近年呈現上升趨勢，尤其是缺血性中風；目前，缺血性中風是中國高致死率的疾病之一。其中80%的中風是由于栓子或者血栓阻塞腦血管導致腦血流暫時性或者永久性的降低，繼而導致腦梗死的形成。在幸存者中，30%的患者由于腦梗死可引起嚴重的后遺癥，如血管性癡呆和相應的肢體障礙。研究發現，在腦缺血的急性期(72小時內)，對腦缺血的病理過程進行有效干預，可以減少腦梗死的形成，提高患者的存活率與其后的生活質量。近年來，中風急性期的神經生物化學研究取得了重大進展，形成了氧自由基損傷，興奮性氨基酸毒性，凋亡與炎癥損傷等病因學說，相應形成了興奮性氨基酸受體阻斷劑，抗氧化劑等幾大類神經保護劑。然而目前經臨床上證實，對于中風的有效神經保護劑非常少，其中一個原因是任何一個損傷都不是獨立存在的，氧自由基損傷往往與興奮性氨基酸毒性，凋亡與炎癥反應相互關聯，信號通路密不可分。而現有的保護劑主要作用于單一靶點，對該靶點下游信號或者是其他的的級 聯反應無直接作用；并且，單一靶點的過度阻斷，往往影響該靶點的正常生理功能而引起無法耐受的副反應。

發明內容
本發明的目的在于提供一種神經保護劑，即抗氧自由基-抗細胞內鈣離子超載-PARP抑制劑中的一種或幾種組合，通過使用分子信號抑制劑來減輕中風病人的神經損傷，從而實現治療急性缺血性中風引起的神經損傷的目的，解決了現有技術存在的缺陷。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案一種新型神經保護劑，包括其中包括至少一種如下組份(1)抗氧化劑，(2)細胞內鈣離子的螯合劑和(3)PARP(Poly ADP-ribosePolymerase，二磷酸腺苷核糖多聚酶)抑制劑。優選的方案是所述的抗氧化劑為PG (Progyl gallate,沒食子酸丙脂)、PG類似物、PG衍生物，及其藥學上可接受的鹽或其它化合物；劑量2. 0 200mg/kg。優選的方案是所述的細胞內鈣離子的螯合劑為BAPTA及其衍生物，其衍生物優選為BAPTA-AM((1,2-bis(2-amino phenoxy)ethane-N,N,N' ,N' -tetraaceticacid-tetr akis (acetoxymethyl) ester)、BAPTA-AM衍生物、BAPTA-AM衍生物類似物，及其藥學上可接受的鹽或其它化合物；劑量1. 0 400mg/kg。優選的方案是所述的PARP 抑制劑為 DPQ(3，4-Dihydro-5[4-(Ipiperindinyl) butoxy]-l (2H)-isoquinoline)、DPQ類似物、DPQ衍生物及其藥學上可接受的鹽或其它化合物；劑量2. 0 300mg/kg。
更為優選的方案是所述的新型神經保護劑包括PG、BAPTA-AM、DPQ中的任意兩 種，其中PG劑量為2. 0 200mg/kg、BAPTA-AM劑量為1. 0 400mg/kg、DPQ劑量為2. 0 300mg/kgo更為優選的方案是所述的新型神經保護劑包括PG、BAPTA-AM、DPQ三種，其中PG 劑量為 2. 0 200mg/kg、BAPTA-AM 劑量為 1. 0 400mg/kg、DPQ 劑量為 2. 0 300mg/kg。更為優選的方案是所述的新型神經保護劑與溶栓劑聯合應用。優選的方案是所述的溶栓劑為組織型纖溶酶原激活劑，組織型纖溶酶原激活劑 的類似物及衍生物，劑量10 IOOmg ；或者為尿激酶或尿激酶類食物及衍生物，劑量25 250單位；或者為鏈激酶或鏈激酶的類似物及衍生物，劑量15 150萬單位。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明發現，細胞內鈣離子超載和PRAP信號途徑的激活是過氧化氫誘導的凋亡的兩個重要信號通路。在這一基礎上，我們發明了一種神經保護劑，包括(1)抗氧化劑PG， (2)細胞內鈣離子的螯合劑BAPTA-AM和(3) PARP抑制劑DPQ，三種組分中的至少一種，尤其 是對三者結合使用時，對缺血性腦損傷的急性期的自由基誘導的神經損傷進行多重阻斷。 結果表明在體外的過氧化氫誘導的的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的細胞模型與 大腦中動脈阻塞的動物模型中，這種復合保護劑都顯示了有效的神經保護作用。因此，該復 合保護劑及其類似物可能為中風患者提供保護作用。本發明所述的新型神經保護劑，尤其是抗氧自由基一抗細胞內鈣離子超載一 PARP 抑制劑三種聯合使用時，從多層次多靶點對缺血性中風的急性期損傷提供保護作用，與單 一保護劑相比，復合保護劑對過氧化氫誘導的氧化損傷有更強的保護作用。這一結果在大 腦中動脈阻塞的大鼠中風模型上也得到了證實。在短暫性大鼠大腦中動脈阻塞模型上，復 合保護劑顯著降低了阻塞后24小時神經學損傷，顯著降低了腦梗死體積，而單一保護劑在 相同條件下未顯示保護作用。這項結果為本發明所述的新型復合神經保護劑進一步成為臨 床治療中風的藥物提供了科學的依據。并且可能會與溶栓劑組織纖溶酶原激活劑(t-PA) 和尿激酶(UK)聯用，對腦梗塞患者提供更好的腦保護作用。


圖1氧化應激誘導的神經損傷機制。圖2阻斷劑單獨應用對過氧化氫誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的保 護作用。圖3阻斷劑聯合應用對過氧化氫誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的保 護作用。 圖4鈣離子螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ聯合應用對過氧化氫誘導的原代 培養的大鼠小腦顆粒細胞的凋亡的保護作用。圖5抗氧化劑PG，細胞內鈣離子的螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ聯合應用 對大鼠大腦中動脈阻塞模型的保護作用。圖6抗氧化劑PG對大鼠大腦中動脈阻塞模型的作用。
具體實施例方式實施例1抗氧化劑PG，鈣離子螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ對過氧化氫誘導的凋亡的保護作用。人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞以MEM培養基培養，過氧化氫(終濃度0. 5mmol/L) 孵育1小時，然后以新鮮MEM培養基替代含過氧化氫的培養基，繼而洗去過氧化氫。抗氧化 劑PG，鈣離子螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ在過氧化氫損傷前1小時預先給藥，在去 除過氧化氧后繼續給藥至實驗測定，實驗中以Hoechst 33342染色計算細胞發生凋亡的數目。(1)過氧化氫誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的過程中鈣離子與PARP 的變化。如圖1所示(A)過氧化氫損傷下人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞單細胞內鈣離子 濃度變化示意圖。檢測手段共聚焦顯微鏡。紅色箭頭顯示過氧化氫開始孵育的時間。(B) 鈣離子螯合劑BAPTA-AM對過氧化氫誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的保護作 用。過氧化氫0.5mmol/L孵育1小時后，MEM新鮮培養基替代含有過氧化氫的培養液。細 胞凋亡率在過氧化氫洗去后4小時，6小時，8小時通過Hoechst 33342染色檢測。顯示數 據是三次獨立實驗的均值士標準差。與過氧化氫組相比，在不同時間點以*P < 0. 05作為 顯著性差異，*P < 0. 01作為極其顯著性差異。(C)O. 5mmol/l過氧化氫損傷下人神經母細 胞瘤SK-N-SH細胞中PAR免疫熒光染色陽性細胞數。PAR陽性提示在其所在的細胞內PARP 被激活。顯示數據是PAR免疫熒光染色在所示時間計數結果。(D)PARP抑制劑DPQ對過氧 化氫(0. 5mmol/L)誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的保護作用的時間依賴性曲 線。細胞凋亡率在過氧化氫洗去后4小時，6小時，8小時，10小時通過Hoechst 33342染色 檢測。顯示數值是三次獨立實驗的均值士標準差。與過氧化氫組相比與過氧化氫組相比， 在不同時間點以乍< 0. 05作為顯著性差異，*P < 0. 01作為極其顯著性差異。(E)氧化應
激引起的細胞死亡信號轉導途徑示意圖。激動劑以“一”表示，阻斷劑“"|”表示。在過氧化氫損傷早期，即可見細胞內鈣離子濃度的顯著變化與PARP表達的顯著 增高。在過氧化氫(0.5mmol/L)損傷SK-N-SH細胞5分鐘后，細胞內鈣離子濃度即可見顯 著升高(圖1A)。在過氧化氫(0. 5mmol/L)損傷SK-N-SH細胞40分鐘，PARP被顯著激活 (圖1C)。而在過氧化氫(0. 5mmol/L)損傷SK-N-SH細胞1小時，去除過氧化氫損傷后，人 神經母細胞瘤SK-N-SH細胞發生了以凋亡形式介導的死亡，并且凋亡在去除過氧化氫8小 時后大到了最高值。細胞內鈣離子的螯合劑BAPTA-AM與PARP阻斷劑DPQ可顯著減少過氧 化氫誘導的細胞凋亡(圖IB與圖1C)。這一結果提示鈣離子介導的線粒體依賴性信號通路 與PARP介導的線粒體非依賴性通路共同參與了氧化應激引起的神經元損傷(圖1E)。實施例2 抗氧化劑PG，鈣離子螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ對過氧化氫誘導的凋亡 的劑量依賴性保護作用。 如圖2所示鈣離子螯合劑BAPTA-AM (圖2A)，抗氧化劑PG (圖2B)和PARP抑制 劑DPQ(圖2C)對過氧化氫誘導的凋亡的分別呈現劑量依賴性保護作用。各藥物在過氧化 氫損傷前1小時開始孵育，去除過氧化氫損傷后繼續孵育8小時，以Hoechst 33342染色計 算細胞發生凋亡的數目。各組值除以過氧化氫組凋亡值，得到標準化的凋亡率。顯示數值以三次獨立實驗的均值士標準差表示。各藥物在過氧化氫損傷前1小時開始孵育，去除過氧化氫損傷后繼續孵育8小時， 以Hoechst33342染色計算細胞發生凋亡的數目。各組值除以過氧化氫組凋亡值，得到標準 化的凋亡率。結果顯示，鈣離子螯合劑BAPTA-AM劑量在0. 1 20μ mol/L(圖2A)，抗氧化 劑PG劑量在0. 5 10ymol/L(圖2B)和PARP抑制劑DPQ劑量在0. 7 16ymol/L(圖 2C)時，劑量的用量和標準化凋亡率呈明顯負相關，表明其對過氧化氫誘導的凋亡的劑量依 賴性保護作用。實施例3抗氧化劑PG，鈣離子螯合劑BAPTA-AM(附圖中簡寫為BA)和PARP抑制劑DPQ聯合應用對過氧化氫誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的凋亡的保護作用。如圖3所示過氧化氫0. 5mmol/L孵育1小時后，MEM新鮮培養基替代含有過氧化氫的培養液。細胞凋亡率在過氧化氫洗去后8小時通過Hoechst 33342染色檢測。各組值 除以過氧化氫組凋亡值，得到標準化的凋亡率。(圖3A)鈣離子螯合劑BAPTA-AM和PARP抑 制劑DPQ聯用對過氧化氫引起的凋亡的保護作用。(圖3B)鈣離子螯合劑BAPTA-AM和抗氧 化劑PG聯用對過氧化氫引起的凋亡的保護作用。(圖3C)抗氧化劑PG和PARP抑制劑DPQ 聯用對過氧化氫引起的凋亡的保護作用。(圖3C)抗氧化劑PG和PARP抑制劑DPQ聯用對 過氧化氫引起的凋亡的保護作用。(圖3D)抗氧化劑PG，鈣離子螯合劑BAPTA-AM和PARP 抑制劑DPQ兩兩聯用與三者聯用對過氧化氫引起的凋亡的保護作用。PG終濃度5μπι01/ L，BA =BAPTA-AM,終濃度13 μ mol/L ；DPQ終濃度6. 4 μ mol/L。顯示數值以三次獨立實驗 的均值士標準差表示。乍< 0. 05作為顯著性差異，*P < 0. 01作為極其顯著性差異。過氧化氫0. 5mmol/L孵育1小時后，細胞凋亡率在過氧化氫洗去后8小時通過Hoechst 33342染色檢測。各組值除以過氧化氫組凋亡值，得到標準化的凋亡率。與三種 阻斷劑單獨應用相比，兩種阻斷劑之間的聯用都顯示出更強的保護作用，BAPTA-AM單獨使 用，其標準化凋亡率大約為70%，DPQ單獨使用，其標準化凋亡率大約為55%，而兩者聯合 使用，其標準化凋亡率只有大約25% (圖3A) ；PG單獨使用時，其標準化凋亡率在60%左 右，但是與BAPTA-AM聯合使用時，其標準化凋亡率下降到40%左右(圖3B) ；DPQ與PG聯 合使用時，其標準化凋亡率僅為30%左右(圖3B)。三種阻斷劑聯合應用，與兩種阻斷劑 BAPTA-AM與PG聯用，或者PG與DPQ聯用相比較，有更強的保護作用，其標準化凋亡率不到20% (圖 3D)。實施例4離子螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ聯合應用對過氧化氫誘導的原代培養的大鼠小腦顆粒細胞的凋亡的保護作用。如圖4所示鈣離子螯合劑BAPTA-AM (圖4A)與PARP抑制劑DPQ (圖4B)對過氧化氫誘導的凋亡分別呈現時間依賴性保護作用。鈣離子螯合劑BAPTA-AM與PARP抑制劑 DPQ(圖4C)聯合應用與單獨應用對過氧化氫誘導的原代培養的大鼠小腦顆粒細胞的凋亡 的作用比較。細胞凋亡在過氧化氫洗去后8小時通過Hoechst 33342染色檢測，所得數值 除以過氧化氫組凋亡值，得到標準化凋亡值。BAPTA-AM終濃度10ymol/L ；DPQ終濃度 8 μ mol/L。各藥物在過氧化氫處理前1小時開始孵育。顯示數值為三次獨立實驗的均值士 標準差表示。卞< 0. 01作為極其顯著性差異。
過氧化氫0. 5mmol/L孵育1小時，細胞凋亡率通過Hoechst33342染色檢測。各組值除以過氧化氫組凋亡值，得到標準化的凋亡率。鈣離子螯合劑BAPTA-AM(圖4A)在除 去過氧化氫2小時，其標準化凋亡率僅為10%左右，在除去過氧化氫4小時后，其標準化凋 亡率上升到大約25%，在除去過氧化氫6小時后，其標準化凋亡率接近40% ；PARP抑制劑 DPQ在除去過氧化氫2小時，其標準化凋亡率僅為16%左右，在除去過氧化氫4小時后，其 標準化凋亡率上升到大約50 %，在除去過氧化氫6小時后，其標準化凋亡率接近65 % (圖 4B)，結果顯示其對過氧化氫誘導的凋亡分別呈現顯著保護作用。鈣離子螯合劑BAPTA-AM 與PARP抑制劑DPQ聯合應用時，在除去過氧化氫2 6小時內，顯示更強保護作用，由65% 降至25%左右(圖4C)。實施例5(1)抗氧化劑PG，細胞內鈣離子的螯合劑BAPTA-AM和PARP抑制劑DPQ聯合應用 對大鼠大腦中動脈阻塞及再灌注損傷的保護作用。如圖5所示PG，BAPTA-AM和DPQ在缺血后1小時給藥，顯著降低了缺血后24小 時的神經學損傷(圖5A)和腦梗死體積(圖5C)但是對腦水腫無顯著保護作用(圖5B)。 PG :20mg/kg，腹腔注射；BAPTA-AM :20mg/kg，靜脈注射；DPQ :20mg/kg，腹腔注射。圖 5A-C 顯 示數值為均值士標準誤。圖5D為TTC染色后腦梗死照片。上行為對照組，下行為三藥聯 合應用組。紅色為正常組織，白色為梗死組織。乍< 0.05作為顯著性差異。PGjBAPTA-AM和DPQ在缺血后1小時給藥，顯著降低了缺血后24小時的神經學損 傷(圖5A)和腦梗死體積(圖5C)但是對腦水腫無顯著保護作用(圖5B)。圖5D為TTC染 色后腦梗死照片。上行為對照組，下行為三藥聯合應用組。紅色為正常組織，白色為梗死組織。(2)抗氧化劑PG對大鼠大腦中動脈阻塞模型的作用。PG在缺血后1小時給藥對缺血后24小時的神經學損傷(圖6Α)，腦水腫(圖6Β) 和腦梗死體積(圖6C)無顯著保護作用。PG :20mg/kg，腹腔注射。顯示數值為均值士標準 誤。圖6D為TTC染色后腦梗死照片。上行為對照組，下行為PG組。首先，我們在人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞建立了過氧化氫損傷的細胞凋亡模 型，模擬腦缺血時氧化應激狀態，探討了鈣離子介導的信號通路與PARP介導的信號通路的 變化。結果表明，在過氧化氫損傷早期，即可見細胞內鈣離子濃度的顯著變化與PARP表達 的顯著增高。在過氧化氫(0.5mmol/L)損傷SK-N-SH細胞5分鐘后，細胞內鈣離子濃度即 可見顯著升高。在過氧化氫(0. 5mmol/L)損傷SK-N-SH細胞40分鐘，PARP被顯著激活。而 在過氧化氫(0. 5mmol/L)損傷SK-N-SH細胞1小時，去除過氧化氫損傷后，人神經母細胞瘤 SK-N-SH細胞發生了以凋亡形式介導的死亡，并且凋亡在去除過氧化氫8小時后大到了最 高值。細胞內鈣離子的螯合劑BAPTA-AM與PARP阻斷劑DPQ可顯著減少過氧化氫誘導的細 胞凋亡。這一結果提示鈣離子介導的線粒體依賴性信號通路與PARP介導的線粒體非依賴 性通路共同參與了氧化應激弓I起的神經元損傷。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于發明的保 護范圍。
權利要求
一種新型神經保護劑，其特征是包括如下列組份中的一種、兩種或者三種組份(1)抗氧化劑；(2)鈣離子拮抗劑；(3)二磷酸腺苷核糖多聚酶抑制劑。
2.如權利要求1所述的新型神經保護劑，其特征是所述的抗氧化劑為PG、PG類似物、 PG衍生物，及其藥學上可接受的鹽或其它化合物；劑量2. O 200mg/kg。
3.如權利要求1所述的新型神經保護劑，其特征是所述的鈣離子拮抗劑為BAPTA、 BAPTA衍生物BAPTA-AM，BAPTA-AM衍生物，BAPTA-AM衍生物類似物，及其藥學上可接受的鹽 或其它化合物；劑量1. O 400mg/kg。
4.如權利要求1所述的新型神經保護劑，其特征是所述的二磷酸腺苷核糖多聚酶 抑制劑為DPQ、DPQ類似物、DPQ衍生物及其藥學上可接受的鹽或其它化合物；劑量2. O 300mg/kgo
5.如權利要求1-4任一項所述的新型神經保護劑，和溶栓劑聯合應用。
6.如權利要求5所述的新型神經保護劑，其特征是所述的溶栓劑為組織型纖溶酶原 激活劑，組織型纖溶酶原激活劑的類似物及衍生物，劑量10 IOOmg ；或者為尿激酶或尿激 酶類食物及衍生物，劑量25 250單位；或者為鏈激酶或鏈激酶的類似物及衍生物，劑量 15 150萬單位。
全文摘要
本發明公開了一種新型神經保護劑，屬于神經保護藥物技術領域，包括如下列組份中的一種、兩種或者三種組份及其含量(1)抗氧化劑(劑量2.0～200mg/kg)；(2)鈣離子拮抗劑(劑量1.0～400mg/kg)；(3)二磷酸腺苷核糖多聚酶抑制劑(劑量2.0～300mg/kg)。本發明對缺血性腦損傷的急性期的自由基誘導的神經損傷進行多重阻斷，尤其是抗氧自由基-抗細胞內鈣離子超載-PARP抑制劑三種聯合使用時，從多層次多靶點對缺血性中風的急性期損傷提供保護作用。與單一保護劑相比，復合保護劑對缺血性中風的體內與體外氧化應激損傷，均有更強的保護作用，對缺血性中風能起到很好的治療作用。
文檔編號A61K45/06GK101797386SQ20091010992
公開日2010年8月11日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者張東才, 李文明, 肇玉明, 郭靜, 韓怡凡 申請人:張東才