專利名稱：一種復合脂肪顆粒及其制備方法
技術領域：
本發明屬于移植材料技術領域，特別涉及一種用于移植的復合脂肪顆粒及其制備 方法。
背景技術：
1893年Neuber完成了第一例采用多個自體游離的小脂肪塊充填軟組織缺損的脂 肪移植手術并取得滿意的療效，此后脂肪移植手術逐漸流行。尤其是液態硅膠注射由于眾 多并發癥被禁止后，人們在移植材料領域又進行了大量的探索，到20世紀80年代初，隨著 脂肪抽吸技術的成熟和發展，再次掀起了自體游離脂肪移植的熱潮。因自體脂肪來源豐富、 取材方便、安全可靠、無免疫排斥反應等優點，極易被患者所接受。并且對于全身脂肪堆積 明顯者，可在自體脂肪移植的同時達到瘦身豐胸、完美身形、形體雕塑的良好效果。目前廣泛應用于臨床的脂肪移植技術，一般采用單純的脂肪顆粒移植，即通過吸 脂獲取脂肪細胞，稍微處理去除水分血液油脂等成分后，直接注射到受區。然而，由于部分 移植脂肪細胞在移植前已經被損壞或者發生壞死；移植后局部的無菌性炎癥反應導致脂肪 細胞壞死、外漏脂質纖維化引起組織收縮；繼發于脂肪細胞脂質丟失或去分化的非壞死性 容積縮小等等，都可引起移植脂肪細胞成活率低、吸收率較高，一年內吸收率可高達60 %以 上，并且如果移植的脂肪體積過大，重建的血供難以達到移植物中心，也將導致移植脂肪顆 粒中心壞死液化，增加吸收率，甚至發生纖維化，導致受植區域變硬。目前也有學者為了提高移植脂肪的成活率，而在移植的單純脂肪顆粒中添加一定 量的脂肪干細胞，來減少移植的吸收率，取得了一定的效果；但個別卻出現異位纖維化結節 形成的情況，導致受植區出現硬的團塊。

發明內容
本發明的主要目的是針對上述現有技術單純的脂肪顆粒移植后脂肪成活率低、遠 期吸收率高，以及直接在移植的單純脂肪顆粒中添加脂肪干細胞可能出現異位纖維化結節 形成等問題，提供一種新的復合脂肪顆粒，可提高移植后脂肪的成活率、并減少遠期吸收 率，且不會出現異位纖維化結節形成等情況。本發明的另一個目的是提供一種上述復合脂肪顆粒的制備方法。為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種復合脂肪顆粒，由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細胞、脂肪顆粒按 照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細胞^il 脂肪顆粒。其中富含血小板血漿(PRP，platelet rich plasma)是將全血經過濃集、分離得到的成 分血液制品，其中血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L。目前富含血小板血漿的制備方法已較為成熟，已有專用儀器(如多功能醫用血成分的自動分離設備)可以快速、便捷、 有效的制備得到。人凝血酶溶液是采用氯化鈣溶液溶解的人凝血酶，在本發明中作為激活PRP凝 結及釋放多量生長因子的催化劑。其制備方法較為固定簡單，其組分比例為1ml蒸餾 水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉(人凝血酶的比例參照常規配比方法， 其小范圍的波動對產品的質量及效果無特殊影響)。脂肪干細胞(ASCs，adipose-derived stem cells)是脂肪組織中含有的大量 具有多向分化潛能的細胞群，由國際脂肪應用技術協會(International Fat Applied Technology Society)將其統一命名為脂肪來源的干細胞(adipose-derived stem cells, ASCs)，簡稱脂肪干細胞。目前對于脂肪干細胞的研究已經較為普遍，對于其培養主要采用 組織塊培養法和消化培養法。脂肪顆粒是通過吸脂獲取的脂肪細胞。目前對于脂肪細胞獲取公認的方法是采用 手動針吸法獲取，并采用低于50g的離心力離心2分鐘，去盡上層的油脂和水分，制備好后 可以置于4°C下保存3天。本發明復合脂肪顆粒可通過包括下述主要步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法可如下用預先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4.5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細胞(棕黃層)、最下層為紅細胞層。 棄去最下層的紅細胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程應嚴格無菌。(2)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將 人凝血酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液，用于激活血漿中血小 板及促進血漿凝結；(3)、分離培養脂肪干細胞(ASCs)由于人脂肪中成熟脂肪細胞和油脂較多，不利于組織塊培養，油脂和多余的脂肪 細胞容易損耗大量培養基，本發明中優選采用消化培養法，通過此法可以盡量去除脂肪細 胞和油脂對于干細胞的生長和貼壁的影響。在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS-T)沖洗至少3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積 的1 % I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫搖床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除 表面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質接種于25cm2培養瓶中，加入α -MEM 培養基(含10 %胎牛血清，1 %雙抗)，置入37 °C、飽和濕度、5 % (X)2的孵箱中培養，3天后加 2ml液(即培養基，下同)，7天后換液，清除未貼壁的細胞及組織塊。原代細胞培養15 20d即可融合。細胞長滿80% (指培養瓶底面積的80%，下同)時，以0.25%胰酶消化、傳 代。傳代細胞繼續加入α -MEM培養基，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養，倒置相CN 102058905 A
說明書
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差顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3天換一次液。待細胞生長至60%時，以0. 25%胰酶消 化、離心、收集底部沉積的脂肪干細胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗至少3次，以去除血液、水 分、油脂等，通過1000轉/分鐘低速離心2分鐘，進一步去除血液、水分、油脂等成分，得到 純凈的脂肪顆粒；(5)、混合、制得復合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得到本發明 所述的復合脂肪顆粒。與現有技術相比，本發明的有益效果是本發明通過在純凈脂肪顆粒中添加適當比例的富含血小板血漿、人凝血酶溶液和 脂肪干細胞，通過人凝血酶溶液對PRP中血小板的激活，釋放大量生長因子，可以促進細胞 增殖及移植物周邊毛細血管的增殖，從而保證移植脂肪早期血供，防止脂肪細胞壞死液化。 同時PRP凝結后形成豐富的纖維網絡對促進細胞粘附和防止細胞流式均具有一定的作用。 而脂肪干細胞其不僅自身能分化為脂肪細胞促進脂肪組織再生，而且可以分化為血管內皮 細胞促進血管生成，并且在移植后的缺氧的急性狀態下可以改善局部組織缺血的情況。這 些作用都可以促進移植物早期迅速建立血供，為移植細胞的成活提供必要的條件，從而提 高脂肪細胞成活率，減少遠期吸收率；并且不會出現異位纖維化結節形成等情況。


圖1是在裸鼠的左右肩部和臀部皮下分的AB⑶四組。圖2是采用精確到0. Iml的2. 5ml空針對移植物體積進行測量的操作圖。采用此 法可以將移植物體積的測量精確到0. 1ml，估計到0. 01ml。圖3是移植7天后見到A組移植物表面有大量血管生成，B組移植物吸收較多，⑶ 組移植物表面有部分血管生成。圖4是移植7天時本發明的復合脂肪顆粒組移植物表面有大量血管(小箭頭所 示)生成，細胞形態較好，細胞間質正常(X100)。圖5是移植7天時純凈脂肪顆粒組移植物內毛細血管較少，脂肪細胞變形，細胞間 未見明顯纖維增生。圖6是移植90天時本發明的復合脂肪顆粒組中脂肪細胞大部分形態可，少數細胞 變大出現了空泡，大部分區域細胞間隙保持較好，少數區域出現細胞間隙變大，纖維增生。圖7是移植90天時純凈脂肪顆粒組移植物內大部分脂肪細胞已經完全失去細胞 形態，細胞間隙增大，纖維增生。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發明上 述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發明的范圍內。實施例1本實施例復合脂肪顆粒(簡稱PA脂肪)由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪 干細胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細胞^il 脂肪顆粒；其中富含血小板血漿中的血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L ；人凝血酶溶液的組分比例為1ml蒸餾水0. Ig氯化鈣1000單位人凝血酶凍干粉。本實施例PA脂肪通過包括下述步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法如下用預先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細胞(棕黃層)、最下層為紅細胞層。 棄去最下層的紅細胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程嚴格無菌。O)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣1000單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血 酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；(3)、分離培養脂肪干細胞(ASCs)在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS-T)沖洗3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的 1% I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫搖床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表 面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質接種于25cm2培養瓶中，加入α -MEM培 養基(含10%胎牛血清，雙抗)，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養，3天后加 2ml液，7天后換液，清除未貼壁的細胞及組織塊。原代細胞培養15 20d即可融合。細胞 長滿80%時，0. 25%胰酶消化、傳代。傳代細胞繼續加入α -MEM培養基，置入37°C、飽和濕 度、5% CO2的孵箱中培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3天換一次液。待細胞 生長至60%時，可以0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗3次，以去除血液、水分、油 脂等，通過1000轉/分鐘低速離心2分鐘，進一步去除血液、油脂等成分，得到純凈的脂肪 顆粒；(5)、混合、制得復合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得所述的復合脂肪顆粒。實施例2本實施例復合脂肪顆粒(簡稱PA脂肪)由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪 干細胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細胞^il 脂肪顆粒；其中富含血小板血漿中的血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L ；人凝血酶溶液的組分比例為1ml蒸餾水0. Ig氯化鈣800單位人凝血酶凍干粉。本實施例PA脂肪通過包括下述步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法如下用預先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細胞(棕黃層)、最下層為紅細胞層。 棄去最下層的紅細胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程嚴格無菌。(2)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血酶 凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；(3)、分離培養脂肪干細胞(ASCs)在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS-T)沖洗3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的 1% I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫搖床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表 面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質接種于25cm2培養瓶中，加入α -MEM培 養基(含10%胎牛血清，雙抗)，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養，3天后加 2ml液，7天后換液，清除未貼壁的細胞及組織塊。原代細胞培養15 20d即可融合。細胞 長滿80%時，以0. 25%胰酶消化、傳代。傳代細胞繼續加入α -MEM培養基，置入37°C、飽和 濕度、5% CO2的孵箱中培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3天換一次液。待細 胞生長至60%時，可以0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗3次，以去除血液、水分、油 脂等，通過1000轉/分鐘低速離心2分鐘，進一步去除血液、油脂等成分，得到純凈的脂肪 顆粒；(5)、混合、制得復合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得所述的復合脂肪顆粒。實施例3本實施例復合脂肪顆粒(簡稱PA脂肪)由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪 干細胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細胞^il 脂肪顆粒；其中富含血小板血漿中的血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L ；人凝血酶溶液的組分比例為1ml蒸餾水0. Ig氯化鈣1200單位人凝血酶凍干粉。本實施例PA脂肪通過包括下述步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法如下用預先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細胞(棕黃層)、最下層為紅細胞層。 棄去最下層的紅細胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程嚴格無菌。(2)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血 酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；(3)、分離培養脂肪干細胞(ASCs)在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS)沖洗3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的
I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫搖床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表面漂 浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質接種于25cm2培養瓶中，加入α -MEM培養基 (含10%胎牛血清，雙抗)，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養，3天后加2ml 液，7天后換液，清除未貼壁的細胞及組織塊。原代細胞培養15 20d即可融合。細胞長滿 80%時，0. 25%胰酶消化、傳代。傳代細胞繼續加入α -MEM培養基，置入37°C、飽和濕度、 5% CO2的孵箱中培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3天換一次液。待細胞生 長至60%時，可以0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗3次，以去除血液、水分、油 脂等，通過1000轉/分鐘低速離心2分鐘，進一步去除血液、油脂等成分，得到純凈的脂肪 顆粒；(5)、混合、制得復合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得所述的復合脂肪顆粒。實施例4將實施例1制得的復合脂肪顆粒用于動物脂肪移植試驗，同時設置對照組，以考 察本發明復合脂肪顆粒用于移植后的成活率、吸收率等情況。1.試驗方法設計1個試驗組(A組-實施例1復合脂肪顆粒組)、3個對照組(B組-脂肪干細 胞復合富含血小板血漿組、C組-脂肪顆粒復合脂肪干細胞組、D組-純凈脂肪顆粒組)，按 照下述方法分別將相應的移植物移植于動物體內，進行效果的對比分析動物實驗中，采用10只裸鼠，在其背部劃分出A、B、C、D四個區域(圖1)，分別植 入本發明復合脂肪顆粒(A組)、PRP+ASCs (B組)、脂肪顆粒+ASCs (C組)、純凈脂肪顆粒(D 組)。每只裸鼠每個部位的移植量為0.細1。將10只裸鼠隨機分為5組，分別于移植后7、 15、30、60、90天時分別各處死2只，進行移植物成活及血管生成的大體觀察(圖幻，并游離 后測量體積(圖幻，最后固定常規HE切片觀察，對記錄的移植物體積行統計學分析。2.試驗結果結果顯示復合脂肪顆粒移植后可以在早期迅速建立血供，并在移植后期保持移植 物的一定體積和移植脂肪細胞及細胞間質的形態正常。結果顯示，移植7天時可以在發明的復合脂肪顆粒組見到明顯的血管生成(圖 4)。在對照純凈脂肪顆粒組僅能見到較少且纖細的血管(圖幻。對移植物體積(ml)的記 錄顯示沒有脂肪細胞的B組吸收接近100%，而發明的復合脂肪顆粒組在90天時吸收率為 21.3%，在四組中吸收最少(見下表)。移植物體積的變化表
權利要求
1.一種復合脂肪顆粒，由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細胞、脂肪顆粒按照 下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X 107個脂肪干細胞脂肪顆粒。
2.根據權利要求1所述的復合脂肪顆粒，其特征在于所述的富含血小板血中，血小板 濃度為(1300. 00 士400. 00) X 109/L。
3.根據權利要求1所述的復合脂肪顆粒，其特征在于所述的人凝血酶溶液的組分比 例為Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉。
4.權利要求1-3中任一項所述的復合脂肪顆粒的制備方法，包括下述主要步驟 (1)、制備富含血小板血漿抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿； O)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝 血酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液； (3)、分離培養脂肪干細胞在無菌條件下抽取脂肪，采用組織塊培養法或消化培養法分離培養脂肪干細胞； G)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，去除血液、水分、油脂，得到純凈的脂肪顆粒； (5)、混合、制得復合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細胞、脂肪顆粒按照 2ml Iml O±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得到本發明所述的復合脂肪顆粒。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)制備富含血小板血 漿的方法如下用預先裝有0. 5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻，移入 離心管中，進行兩次離心第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘，離心后血液分為 三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細胞、最下層為紅細胞層；棄去最下層的紅 細胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進行二次離心，速度為2000r/min，時間為15分鐘， 棄去最上層的大部分血漿，將剩余液體搖勻，即得。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)分離培養脂肪干細 胞的方法如下在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內在超凈工作臺中，用2倍體 積的PBS緩沖液沖洗至少3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的I型 膠原酶，混勻后于37°C恒溫搖床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表面漂浮 油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質接種于25cm2培養瓶中，加入α -MEM培養基， 置入37oC、飽和濕度、5% C02的孵箱中培養，3天后加2ml培養基，7天后換培養基，清除未 貼壁的細胞及組織塊，原代細胞培養15 20d即可融合；細胞長滿80%時，用0. 25%胰酶 消化、傳代；傳代細胞繼續加入α -MEM培養基，置入37oC、飽和濕度、5% C02的孵箱中培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3天換一次培養基。待細胞生長至60%時，以 0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細胞，即得。
7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)制備脂肪顆粒的方 法如下在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗至少3次，去除血液、水分、油 脂，通過1000轉/分鐘低速離心2分鐘，進一步去除血液、水分、油脂，即得。
全文摘要
本發明公開了一種復合脂肪顆粒及其制備方法，該復合脂肪顆粒由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107個脂肪干細胞∶4ml脂肪顆粒。該復合脂肪顆?？商岣咭浦埠笾镜某苫盥?、并減少遠期吸收率，且不會出現異位纖維化結節形成等情況。
文檔編號A61L27/54GK102058905SQ200910309940
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月18日 優先權日2009年11月18日
發明者劉磊, 湯煒, 王杭, 田衛東, 郭麗娟, 龍潔 申請人:四川大學