專利名稱：細菌感染中鐵載體介導的鐵攝取的制作方法
技術領域：
本發明涉及傳染性細菌中的鐵攝取途徑，具體而言，涉及利用鐵載體介導的鐵攝取途徑來抑制這類細菌的方法。
背景技術：
幾乎無例外地，鐵是所有微生物的必需營養素。在生理條件下，鐵主要以不溶性氫氧化鐵(Fe3+)的形式存在，并且一般與蛋白質絡合以通過動物體液轉運和儲存。細胞內的鐵由鐵蛋白(系統發育普遍存在的一類球狀儲鐵蛋白)和血紅素相關蛋白攜帶，而血清鐵與糖蛋白特別是轉鐵蛋白結合。鐵沉積增加(稱為血鐵過少癥)是進一步限制侵入病原體獲得鐵的先天免疫反應的一個方面。這是由于含鐵糖蛋白的內吞作用(位于肝臟的鐵蛋白的增加)以及對通過網狀內皮系統向細胞外環境中的鐵釋放的限制。由于鐵的低溶解度和嚴格的沉積作用，人體組織中的游離鐵估計為約ΙΟ,Μ，遠遠低于維持微生物生命所需要的閾值，使得鐵獲取成為全身性感染物所面臨的一個主要挑戰。許多細菌、真菌和植物通過分泌鐵載體克服鐵限制，鐵載體是低分子量、高親和性的鐵螯合劑。它們可在哺乳動物血清中與轉鐵蛋白競爭宿主的鐵。含鐵的鐵載體可被同源細胞表面受體蛋白識別，并且由ATP結合盒(ABC)轉運蛋白運輸通過細胞質膜。鐵載體介導的鐵攝取對許多革蘭氏陽性菌病原體和革蘭氏陰性菌病原體的發病有顯著貢獻，所述病原體包括鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)、 綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、敗血病大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄王求胃(Staphylococcus aureus)。金黃色葡萄球菌(S. aureus)是一種共生生物，并且是包括人和家畜在內的多種哺乳動物物種的病原體。在奶牛、馬、山羊、綿羊和駱駝中引起感染的金黃色葡萄球菌分離物已有報道。感染從人傳遞至其他動物及從其他動物傳染至人的動物傳染性金黃色葡萄球菌的分離物也已有報道。金黃色葡萄球菌定殖于人粘膜和表皮表面，并且是外科傷口和植入的醫療裝置的常發致病菌。金黃色葡萄球菌表達多種毒性因子，包括粘附素、蛋白酶、裂解素(Iysin)和超抗原，它們中的許多用于通過例如紅細胞溶解的過程來提高鐵的獲得。通過血液和軟組織進行的全身性傳播的特征在于快速細菌增殖和組織破壞，出現包括敗血病、心內膜炎和壞死性肺炎的癥狀。大量葡萄球菌毒性因子的協同表達受制于鐵限制，鐵限制是由鐵攝取調節蛋白Fur介導的現象。此DNA結合蛋白可作為抑制性輔因子識別Fe2+。可溶性鐵的水平下降可導致其從所述鐵反應調節子的操縱基因區中的同源Fur盒脫離，并抑制轉錄。金黃色葡萄球菌是一種可導致大范圍感染的流行性人病原體，感染范圍從小的皮膚病損、小膿皰疹和食物中毒，到更嚴重的疾病例如敗血癥、心內膜炎、骨髓炎、肺炎、細菌血癥和中毒性休克綜合征。最初，青霉素可用于治療甚至最嚴重的金黃色葡萄球菌感染。然而，金黃色葡萄球菌的青霉素抗性菌株的出現降低了青霉素在治療金黃色葡萄球菌感染時的效力，并且目前在醫院感染中遇到的大多數金黃色葡萄球菌菌株對青霉素無反應。
20世紀60年代引入的甲氧西林(methicillin)極大地克服了金黃色葡萄球菌的青霉素抗性問題。然而，金黃色葡萄球菌中已經出現了甲氧西林抗性，以及對可有效對抗該生物的許多其他抗生素的抗性，所述抗生素包括萬古霉素、氨基糖苷類、四環素、氯霉素、大環內酯類和林可酰胺類(lincosamide)。事實上，金黃色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株通常具有多種藥物抗性。甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)已經成為全世界范圍內最重要的醫院原發病原體之一，并且產生了嚴重的感染防控問題。金黃色葡萄球菌感染的藥物抗性造成嚴重的治療困難，除非開發新的治療劑，否則這些治療困難可能變得更加糟糕。因此，需要基于對金黃色葡萄球菌中主要鐵攝取途徑的更加全面的理解來開發治療金黃色葡萄球菌感染的新方法。

發明內容
金黃色葡萄球菌的鐵載體介導的鐵攝取中涉及的基因和蛋白已經被確定，并且可用于提供治療金黃色葡萄球菌感染的新方法。因此，在本發明的一個方面，提供了一種抑制金黃色葡萄球菌的方法，該方法包括抑制葡萄球菌鐵載體(Staphyloferrin)介導的鐵攝取。在本發明的另一個方面，提供了制備葡萄球菌鐵載體——包括葡萄球菌鐵載體A 和葡萄球菌鐵載體B—一的方法，所述方法包括以產生葡萄球菌鐵載體的底物孵育Sbn/Sbt 多肽，以得到功能性葡萄球菌鐵載體。參照以下附圖在下面的具體實施方式
中描述本發明的這些和其他方面。


圖1圖示說明了金黃色葡萄球菌sbn操縱子缺失菌株在血清中的受損生長，插示說明了所述缺失菌株在補充有FeCl3的血清中的生長。圖2的柱狀圖比較了在存在和不存在鐵的情況下野生型金黃色葡萄球菌(黑色柱)與金黃色葡萄球菌sbn操縱子缺失菌株(灰色柱)的鐵載體產生。圖3圖示了金黃色葡萄球菌染色體的sbt-hts區，包括經測序的Newman菌株染色體的基因座編號。圖4提供了 sbtA和sbtBCD編碼區之間的基因間區域(A)以及sbtD和htsABC編碼區之間的基因間區域(B)，標識了推定的Fur盒序列；sbtA、sbtB和htsA基因的起始密碼子(粗體字)；以及Shine-Dalgarno序列(S. D.)。圖5的柱狀圖顯示，sbt-hts基因座——即sbtA(白色柱)、sbtB(灰色柱)和 htsA(黑色柱)——的轉錄受鐵和Fur調節。圖6圖示比較了野生型金黃色葡萄球菌(·)、金黃色葡萄球菌sbt操縱子缺失菌株(Δ sbtAB⑶:Tet) ( Δ )和金黃色葡萄球菌串聯sbn/sbt基因座突變體(Δ sbnAB⑶Ei7G HI =TetAsbtAB⑶Kan)(〇)在血清中的生長，插入示了所述串聯缺失菌株在補充有!^eCl3的血清中的生長。圖7的柱狀圖比較了在存在和不存在鐵的情況下野生型金黃色葡萄球菌(黑色柱)與金黃色葡萄球菌sbt操縱子缺失菌株(灰色柱)和金黃色葡萄球菌串聯sbn/sbt基因座突變體(白色柱)的鐵載體產生。
圖8圖示說明了 ABC轉運蛋白基因失活對野生型(·)、sirA: :Km( □)、 AhtsABC(Δ )和串聯sirA/htsABC(〇)金黃色葡萄球菌生長的效應。圖 9 圖示比較了野生型(· )、Δ sbnABCDEFGHI Tet ( □ )、AsbtABCD: :Km( Δ ) 和串聯Asbn/Asbt(〇)金黃色葡萄球菌在血清中的生長，上述金黃色葡萄球菌被空克隆載體(pLI50) (A)、攜帶金黃色葡萄球菌的sbtABCD的質粒(pEV90) (B)和攜帶表皮葡萄球菌 (S. epidermidis)的 sbtABCD 的質粒(pEV95) (C)所轉化。圖10示出了在不存在血紅素的情況下(A)以及在暴露于血紅素時(B)純化的 IsdE, HtsA和SirA蛋白的吸收譜。圖11的柱狀圖比較了在不存在和存在脯氨酸和鐵的情況下野生型和sbnB突變體金黃色葡萄球菌的細菌生長。圖12的柱狀圖比較了在不存在和存在二氨基丙酸(DAPA)、Fe和Sb的情況下野生型、sbnB突變體和包含攜帶sbnB的質粒的sbnB突變體金黃色葡萄球菌的細菌生長。圖13示出了金黃色葡萄球菌sir-sbn基因座的物理圖，標識了 A型(斜線)、B型
(黑色)和C型(豎線)NIS合成酶和脫羧酶(斑點)，并示出了葡萄球菌鐵載體B的結構 ⑶。圖14圖示說明了在存在其量不斷增加的體外合成的葡萄球菌鐵載體B(SB)的情況下，鐵饑餓的金黃色葡萄球菌Δ sbn/Δ sbt突變體的細菌生長(A)，水平達到與鐵存在下的生長相當；并且圖示比較了在存在和不存在鐵以及在存在葡萄球菌鐵載體B但無鐵的情況下Δ sfa Δ sbn突變體的細菌生長(B)。圖15提供的柱狀示出了 Sbn酶對于以下羧酸底物的底物特異性檸檬酸(A)、檸檬酰-Dap (B)、檸檬酰-Dae (C)和 α -KG (D)。圖16示出了所提出的葡萄球菌鐵載體B的生物合成方案。圖17示出葡萄球菌鐵載體A的結構；圖18提供的柱狀圖示出了在存在體外合成的葡萄球菌鐵載體A的情況下，野生型金黃色葡萄球菌㈧、SirA突變⑶的生長，以及Hts(C)和HtsSir突變體⑶無生長。圖19示出了所提出的葡萄球菌鐵載體A的生物合成方案。圖20提供了標識了葡萄球菌鐵載體A結合區(框4)的HtsA晶體結構(A)(包括所述結合區中的殘基(B))的圖，以及標識了葡萄球菌鐵載體B結合區(框)的SirA晶體結構的圖(C)0
具體實施例方式本發明提供了一種抑制金黃色葡萄球菌的方法，包括抑制鐵載體介導的鐵攝取， 例如葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取。鐵載體介導的鐵攝取包括鐵載體生物合成以及/或者鐵載體攝取或轉運。現在已經確定了兩種鐵載體生物合成和攝取的途徑。在一個途徑中，所述鐵載體即葡萄球菌鐵載體A由Sbt多肽產生，并且由Hts多肽轉運以進行細胞攝取。在另一個途徑中，所述鐵載體即葡萄球菌鐵載體B由Sbn多肽產生，并且由Sir多肽轉運以進行細胞攝取。術語“葡萄球菌鐵載體A”和“葡萄球菌鐵載體B”是指高親和性的α _羥基羧酸 (hydroxycarboxylate)鐵螯合化合物或結合鐵(通常是三價鐵0 3+)離子的形式)的金黃色葡萄球菌鐵載體。圖17提供了葡萄球菌鐵載體A的結構，而圖16提供了葡萄球菌鐵載體B的結構。葡萄球菌鐵載體A由從在本文中被稱為“sbt”或“sfa”基因簇的基因簇表達的 Sbt多肽產生，并被從hts基因表達的HtsABC多肽轉運至細胞中。“sbt”或“sfa”基因簇是指一組金黃色葡萄球菌基因，即sbtA、sbtB、sbtC和sbtD， 所述基因已從正常染色體基因座分離出，并且分別編碼參與葡萄球菌鐵載體A生物合成的多肽SbtA、SbtB、SbtC和SbtD。在一個實施方案中，SbtB和SbtD是NIS (不依賴于NRPS 的鐵載體)合成酶，SbtC是氨基酸消旋酶，SbtA是嵌膜鐵載體流出蛋白。Sbt基因的示例性性核苷酸序列及對應的所編碼的Sbt多肽可見于GenBank登記號AP009351，或者RefSeq 登記號 NC_009641 的基因座 NWMN_2079、NWMN_2080、NWMN_2081 和 NWMN_2082。Sbt 多肽的示例性氨基酸序列還可見于GenBank Protein ID登記號BAF68351、BAF68;352、BAF68353和 BAF683540還已經確定，葡萄球菌鐵載體A可以在其天然環境之外合成，例如在其中不內源性表達葡萄球菌鐵載體A的細菌中重組表達以及在無細胞條件下合成。因此，在一個實施方案中，可以將sbt基因使用現有的技術轉染至選擇的細菌細胞中，并孵育在包含Sbt底物例如(例如檸檬酸、D-鳥氨酸)和輔助因子(ATP和Mg2+)的培養基中以表達得到功能性葡萄球菌鐵載體A。在另一個實施方案中，Sbt多肽(包括SbtA、SbtB、SbtC和SbtD)可以在設計用于模仿細胞的基本功能性生物化學的條件(例如包括羧酸底物，如檸檬酸和D-鳥氨酸)下于無細胞環境中孵育，以得到功能性葡萄球菌鐵載體A。在又一個實施方案中，可以在存在羧酸底物例如檸檬酸和D鳥氨酸的情況下孵育Sbt合成酶例如僅SbtB和SbtD，以得到功能性葡萄球菌鐵載體A。如果將D-鳥氨酸替換為L-鳥氨酸，那么可以加入SbtC以將其轉化為D-外消旋化合物。在這點上，所述sbt基因或Sbt肽可源自金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)的任一種，或者源自這些來源的組合。HtsABC轉運蛋白由“hts操縱子”編碼，該操縱子包含一組細菌基因，包括共享共同啟動子的htsA、htsB和htsC。該操縱子編碼用于將含鐵的鐵載體——即葡萄球菌鐵載體A——轉運至金黃色葡萄球菌細胞中的蛋白系統，也被稱為ABC轉運蛋白。其啟動子元件——位于htsA編碼區的上游——通過所述Fur蛋白受鐵調控。htsA基因編碼血紅素或鐵載體結合蛋白(HtsA)，而htsB和htsC編碼ABC-轉運蛋白的跨膜部分(HtsB/C)。hts基因的示例性核苷酸序列及對應的所編碼的Hts多肽可見于GenBank登記號AP009351，或者 RefSeq 登記號 NC 009641 的基因座 NWMN_2076、NWMN_2077 和 NWMN_2078。Hts 多肽的示例性氨基酸序列還可見于GenBank Protein ID登記號BAF68348、BAF68349和BAF68;350。如下面將進行描述的，hts編碼的鐵載體轉運系統與!^huC ATP酶相互作用。鐵載體葡萄球菌鐵載體B——以前也被稱為葡萄球菌細菌素(staphylcAactin)， 是一種由L-2，3_ 二氨基丙酸、檸檬酸、乙二胺和α-酮戊二酸組成的α-羥基羧酸鐵載體——由被稱為“sbn”基因簇的基因簇產生。含鐵的葡萄球菌鐵載體B經SirABC轉運蛋白系統轉運至生物體中。“sbn”基因簇是指共享共同啟動子的一組金黃色葡萄球菌基因，即sbnA、sbnB、 sbnC、sbnD、sbnE、sbnF、sbnG、sbnH和sbn I。其啟動子元件——位于sbnA編碼區的上游——受鐵調控。sbn基因的示例性核苷酸序列可見于Genbank登記號AY251022。sbn基因分別編碼參與葡萄球菌鐵載體B合成的多肽“ ^nA”、“ SbnB ”、“ SbnC”、“ SbnD ”、“ SbnE ”、“ SbnF”、 “SbnG”、“SbnHm“SbnI”。這些多肽的序列信息可見于公布的PCT申請WO 06/043182。因此，在一個實施方案中，sbnA編碼半胱氨酸合酶，sbnB編碼鳥氨酸環化脫氨酶，sbnC編碼生物合成蛋白，sbnD編碼流出蛋白，sbnE編碼鐵載體生物合成蛋白，sbnF編碼鐵載體生物合成蛋白，sbnG編碼醛縮酶蛋白，sbnH編碼氨基酸脫羧酶。已經確定，葡萄球菌鐵載體B可以在其天然環境之外合成，例如在其中不內源性表達葡萄球菌鐵載體的細菌中重組表達以及在無細胞條件下合成。因此，在一個實施方案中，可以將sbn基因使用現有的技術轉染至選擇的細菌細胞中，并孵育在包含Sbn底物(例如檸檬酸、L-2，3- 二氨基丙酸、α -酮戊二酸、ATP、Mg2+)的培養基中以表達得到功能性葡萄球菌鐵載體B。在另一個實施方案中，Sbn多肽(包括SbnA、SbnB、SbnC、SbnD、SbnE、SbnF、 SbnG、SbnH和Sbnl)可以在設計用于模仿細胞的基本功能性生化化學的條件下于無細胞環境中與合適的Sbn底物孵育，以得到功能性葡萄球菌鐵載體。在又一個實施方案中，可以在存在例如L-2，3- 二氨基丙酸、檸檬酸和α -酮戊二酸的底物的情況下僅孵育Sbn合成酶 (例如SbnC、SbnE和SbnF)以及脫羧酶(例如SbnH)，以得到功能性葡萄球菌鐵載體B。SirABC轉運蛋白由“sirABC操縱子”編碼，該操縱子包含一組細菌基因，包括共享共同啟動子的sirA、sirB和sirC。該操縱子編碼用于將含鐵的鐵載體轉運至金黃色葡萄球菌細胞中的蛋白系統，也被稱為ABC轉運蛋白。sirABC操縱子以及它編碼的Sir蛋白的示例性核苷酸和多肽序列可見于GenBank登記號AY251022和GenBank登記號AF079518。 sirA基因編碼細胞外蛋白(SirA)，而sirB和sirC編碼ABC-轉運蛋白的跨膜區(SirB/ SirC)。術語“SirABC鐵-鐵載體轉運系統”是指由SirA、SirB、SirC和FhuC多肽組成的 SirABC轉運蛋白。FhuC 是“三價鐵氧肟酸鹽攝取系統(ferric hydroxamate uptake system) ” 或 "fhu系統”的多肽。該fhu系統由5個基因編碼fhuC、fhuB、fhuG、fhuDl和fhuD2。fhuC、 fhuB和fhuG在一個操縱子(fhuCBG操縱子)中，并且編碼ATP結合盒(ABC)轉運蛋白的組件。fhuC編碼與sir以及hts編碼的鐵載體轉運系統都相互作用的ATP酶。fhuDl和 fhuD2分別編碼，并編碼以高親和性結合三價鐵氧肟酸鹽復合體的脂蛋白。fhuCBG操縱子的示例性核苷酸和氨基酸序列可見于GenBank登記號AF251216、AAF98153、AAF98154和 AAF98155 ；對于 fhuDl，可見于登記號 AF3258M 和 AAK92085 ；對于 fhuD2 可見于 AF325855 和 AAK92086。術語“FhuC”、“FhuB”、“FhuG”、“FhuDl”和“FhuD2”分別指由 fhuC、fhuB、fhuG、 fhuDl和fhuD2編碼的蛋白。根據本發明的一個方面，可以通過以下方式抑制金黃色葡萄球菌抑制葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取，即葡萄球菌鐵載體A介導的鐵攝取和葡萄球菌鐵載體B介導的鐵攝取。本文使用的術語“抑制”對于金黃色葡萄球菌的抑制而言是指金黃色葡萄球菌的至少部分生長抑制，并且包括完全生長抑制。本文使用的術語“進行抑制”對于葡萄球菌鐵載體 A和B的鐵攝取而言是指金黃色葡萄球菌鐵攝取的至少部分抑制，包括完全抑制，并且包括對鐵載體合成、鐵載體的分泌和鐵載體的細胞攝取的抑制。對葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取的抑制可以通過以下方式實現抑制葡萄球菌鐵載體A產生所需要的至少一種Sbt多肽的表達或功能，例如SbtA、SbtB, SbtC和SbtD中的至少一種，如SbtB和SbtD ；以及抑制葡萄球菌鐵載體產生所B需要的至少一種Sbn多肽的表達或功能，例如 SbnA、SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF、SbnG、SbnH 和 SbnI 中的至少一種， 如SbnC、SbnE, SbnF和SbnH。在核酸水平上，可以使用現有技術中公知的方法例如反義和 RNA干擾技術(siRNA、shRNA和microRNA)阻斷釙t/Sbn表達，以阻止鐵載體合成。在蛋白水平上，可以抑制一種或多種Sbt多肽以及一種或多種Sbn多肽的功能，以阻止每種鐵載體的合成。本文使用的術語“反義寡核苷酸”是指與靶sbt/sbn核酸序列互補的核苷酸序列。 術語“寡核苷酸”是指由天然堿基、糖和糖間(骨架)鍵組成的核苷酸或核苷單體的寡聚物或多聚物。該術語還包括功能相似的，包含非天然單體或其部分的修飾或取代寡聚物。這類修飾或取代寡核苷酸由于諸如細胞攝取增加或者在核酸酶存在的情況下的穩定性提高等性質而優于天然形式。本發明的反義寡核苷酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，并且可包含天然堿基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。所述寡核苷酸還可以包含修飾的堿基例如黃嘌呤、次黃嘌呤和2-氨基腺嘌呤。本發明的其他反義寡核苷酸可包含磷酸骨架中的經修飾的亞磷酸、氧雜原子；短鏈烷基或環烷基糖間鍵；或者短鏈雜原子或雜環糖間鍵。例如，所述反義寡核苷酸可包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯和二硫代磷酸酯。本發明的反義寡核苷酸還可包含可更適合作為治療劑或實驗試劑的核苷酸類似物。 寡核苷酸類似物的一個實例是肽核酸(PNA)，其中DNA (或RNA)中的脫氧核糖(或核糖)磷酸主鏈被聚酰亞胺骨架代替，所述聚酰亞胺骨架與肽出現的聚酰胺(polymide)骨架類似。 合適的反義寡核苷酸的長度將至少是5個核苷酸，優選至少約15個核苷酸長，并且將足以阻止靶基因的轉錄以得到功能性蛋白。在另一個實施方案中，可應用RNA干擾技術(例如siRNA、shRNA和microRNA)來阻止Sbt/Sbn多肽的表達。與靶sbt/sbn基因的區域相符——至少達到結合至所述區域上時所需要的程度——的核酸片段例如siRNA片段的應用可用于阻斷表達，導致對鐵載體產生的抑制。這類阻斷在如下情況下發生，即當所述siRNA片段結合于所述靶基因，從而阻止所述基因翻譯得到功能性Sbt/Sbn多肽。合適的siRNA具有適合于抑制靶基因表達的長度， 例如長度為至少約10-15個核苷酸，并且包含與所述靶基因的足夠的互補性以在所需的條件下——例如在細胞中——與之雜交。可以使用本領域中的技術將所述反義和RNA寡核苷酸引入組織或細胞中，所述技術包括載體(逆轉錄病毒載體、腺病毒載體和DNA病毒載體) 或物理技術例如顯微注射。可以基于所提供的序列信息，使用本領域已知的步驟通過化學合成和酶連接反應構建反義和RNA寡核苷酸。可以使用天然核苷酸或多種經修飾的核苷酸來通過化學方法合成所述寡核苷酸，所述經修飾的核苷酸被設計以增加分子的生物穩定性或者增加與mRNA 或天然基因形成的雙鏈體的物理穩定性，所述經修飾的核苷酸例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。或者，可以使用本領域中公知的重組技術通過生物方法制備所述寡核苷酸。可以使用干擾所述多肽功能的一種或多種化合物來實現對Sbt/Sbn多肽的抑制。 因此，如果已知靶Sbt/Sbn多肽的功能，那么可以鑒定或開發合適的抑制性化合物。例如， 多肽SbnC、SbnE和SbnF已經被鑒定為葡萄球菌鐵載體B合成所必需的NIS合成酶。因此， 用于抑制這類合成酶的化合物應適合于抑制葡萄球菌鐵載體B合成。對SbnH的脫羧酶活性的抑制也會抑制葡萄球菌鐵載體B合成。在這方面，底物類似物可用于阻斷合成酶和/ 或脫羧酶的活性。或者，可以通過限制與葡萄球菌鐵載體生物合成所必需的一種或多種底物的接觸來抑制Sbt/Sbn多肽。在這方面，可以抑制產生葡萄球菌鐵載體合成所必需的底物的酶，例如對SbnA或SbnB的抑制會抑制葡萄球菌鐵載體B合成所必需的底物——二氨基丙酸的合成。在另一個實施方案中，對葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取的抑制可以通過抑制Hts 介導的和Sir介導的含鐵葡萄球菌鐵載體向細胞中的轉運實現。在這方面，可以抑制含鐵葡萄球菌鐵載體A向細胞中的轉運所需要的Hts多肽——例如HtsA、HtsB和HtsC——的至少一種的表達或功能，以及含鐵葡萄球菌鐵載體B向細胞中的轉運所需要的Sir多肽—— 例如SirA、SirB和SirC——的至少一種的表達或功能。或者，可以抑制!^huC的表達，以抑制葡萄球菌鐵載體A和葡萄球菌鐵載體B 二者向細胞中的轉運。本領域技術人員應了解，可以通過以下方式抑制葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取 抑制葡萄球菌鐵載體A和B的合成(如上文所述)、葡萄球菌鐵載體A和B向細胞中的轉運 (如上文所述)，以及抑制葡萄球菌鐵載體A的合成與抑制葡萄球菌鐵載體B向細胞中的轉運相結合，或者抑制葡萄球菌鐵載體A向細胞中的轉運與抑制葡萄球菌鐵載體B的合成相
纟口口。為了鑒定調節葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取的試劑，可以開發篩選測定法以篩選調節Sir或Hts多肽的鐵轉運活性的試劑。例如，可以通過本領域技術人員已知的任何方法確定用于調節Hts蛋白鐵轉運活性的測試試劑的合適濃度。在一個實施方案中，所述篩選測定法可包括表達野生型Hts和Sbt多肽的完整金黃色葡萄球菌細胞。可以通過分析所述細胞來檢測化合物改變Hts和/或Sbt多肽的鐵轉運活性的能力。例如，可以通過對富鐵培養基中的細胞生長或分化(表型)的改變進行評分而檢測鐵轉運的拮抗劑。可以將野生型金黃色葡萄球菌菌株在存在一種或多種測試試劑的情況下的生長與SbtA、SbtB, SbtC, SbtD, HtsA, HtsB或HtsC缺陷型金黃色葡萄球菌菌株的生長進行對較。可以用來自化合物或天然提取物庫的測試試劑處理每種培養物，并監測具體試劑對野生型菌株和Hts 缺陷型菌株生長的影響。可以使用Klett計監測細菌生長。以此方式，可以別特異性地干擾HtsABC/sbtABCD鐵-鐵載體轉運系統的化合物。作為另一個實例，可以培養金黃色葡萄球菌細胞并用測試試劑處理，然后使用原子吸收光譜技術篩查細胞中鐵的存在情況。或者，可以使用放射性標記的鐵測量對鐵轉運活性的抑制。干擾HtsABC鐵-鐵載體轉運系統的化合物會導致對放射性標記的鐵的攝取降低。還可以進行對照測定，以提供用于對比的基線。在所述對照測定中，可以在不存在所述測試化合物的情況下定量金黃色葡萄球菌細胞中放射性標記的鐵的攝取。放射性標記的鐵的實例包括5Ve或55Fe。還可以鑒定干擾參與鐵載體介導的鐵攝取的核酸或蛋白的表達的拮抗劑。為了鑒定這類拮抗劑，可以用一種或多種目的化合物處理金黃色葡萄球菌細胞，然后測定所述一種或多種化合物對參與鐵載體介導的鐵攝取的核酸和相應所編碼蛋白的核酸表達或蛋白產生的影響。例如，使用任何合適的技術如硫氰酸胍鹽-酚-氯仿一步法，可以從在存在或不存在測試試劑的情況下培養的金黃色葡萄球菌細胞中分離總RNA。然后可以通過任何合適的方法例如RNA印跡分析、聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄結合聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 和逆轉錄結合連接酶鏈式反應(RT-LCR)，測定核酸例如sir、sbn, hts、sbt或fhu核酸的表達。還可以例如使用RT-PCR方法來測定編碼Sir、Sbn、Hts、Sbt或Fhu多肽的mRNA的水平，從而測定與對照樣品相比所選擇的測試試劑的作用。還可以使用基于抗體的方法例如免疫測定，在用測試試劑處理金黃色葡萄球菌細胞后定量Sir、Sbn、Hts、Sbt或冊11多肽的表達。可以使用任何合適的免疫測定，包括但不限于，使用諸如如下技術的競爭性和非競爭性測定系統蛋白質印跡、放射性免疫測定、ELlSA(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、 免疫沉淀測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體結合測定 (complement-fixation assay)、免疫放身寸狽Ij定(immunoradiometric assay)、焚光免疫狽Ij 定和蛋白A免疫測定。例如，可以借助兩步夾心測定，可在獲自經測試試劑處理的金黃色葡萄球菌細胞的樣品中檢測SbtA、SbtB, SbtC, SbtD, HtsA, HtsB或HtsC多肽。在第一步中， 使用捕獲劑(例如SbtA、SbtB、SbtC、SbtD、HtsA、HtsB或HtsC抗體)來捕獲特定多肽。所述捕獲劑可任選地固定于固相上。在第二步中，使用直接或間接標記的檢測試劑來檢測所捕獲的標記物。在一個實施方案中，所述檢測試劑是抗體。可以參考存在于未處理的金黃色葡萄球菌細胞中的SbtA、SbtB、SbtC、SbtD、HtsA、HtsB或HtsC多肽的量計算存在于以測試試劑處理的金黃色葡萄球菌細胞中的SbtA、SbtB、SbtC、SbtD、HtsA、HtsB或HtsC多肽的量，以確定所述測試試劑對多肽表達的作用。還可以通過干擾Hts和Sir多肽內的鐵載體結合區(例如HtsA和SirA內的鐵載體結合區)來抑制金黃色葡萄球菌的鐵載體介導的鐵攝取。如以下實施例中所述，這些多肽內的結合區已被確定，并且用作抑制用于攝取的Hts/Sir轉運系統與含鐵鐵載體之間相互作用的靶區。因此，基于這種對所述結合區的確定，可容易地設計拮抗劑來阻斷Hts/Sir 鐵載體結合，并且所述拮抗劑可包括鐵載體模擬物、免疫拮抗劑等。參照如下具體實施例來描述本發明的實施方案，所述實施例不構成限制。實施例實施例1 實施例2-10的材料和方法細菌菌株、質粒和生長培養基。在本研究中使用的細菌菌株和質粒記載于表1中。 除非另外指出，否則細菌在37°C下培養。表1.在本研究中使用的細菌菌株、質粒和寡核苷酸。細菌菌抹、 質粒和寡核苷酸
.減；
泰 或 I考文獻
細菌
夫腸桿S DHSa
F.R2566
RP523
金黃色葡萄球菌
Ris|6390 Newman
H1324 H1331 H1661 H1665 H1649 H1666 H306
H803
H1448 H1262 111480 H1497 H706
表皮葡萄球菌 846-1 1457-MlO
Φ80<1 3εΖΛΜ15 recAl endAl gyrA96 thiA hsdRl 7{rK' m^) supE44 relA 1 deoR ^IacZYA-argF)Om F" λ" ftivA2 [Ion] omp'f IacZsTT gcnel ga/swM// \(mcrC-mrr)\ 14::18/0 R(wcf-73::miniTn/( )2 R(rg6-210::Tn/<})l (Tcts) e ti4/ [dcm]
thr-1 leuB6 M-I IacYl tonA21 supE44 Γ λ" hemB
rK"mK+;可接受外源DNA
原噬菌體消除的野生型菌林(Prcphiige-cureilwild type strain) 野生型臨床分離群
RM6390 AshnABCDEFGHI::Tet; TetR Newman Asbtvi BCDEFGHJ::Tet; Tetft RN6390 AsbtABCD::K.m; KmR Newman AsbtABCD::Km: KmR
RM6390 AsbnABCDEFGHI::Tet AsbiABCD::Km: Tetfc KmR Newman AsbnAIiCDEFGHI::Tct AsbtABCD::Km; TetR KmR RN6390 , >/}::Km; KmR
Newtnan sir A/Km; KmR
RN6390 AhtsABC:: let； TetR Newinan AhtsA BCv.Tei; TetR RN6390AhtsABCyJeVi TetR KmR
Newman sir A: :Km AhtsABC::Tet; TetR K.mR Nevvman Jfe'-::Km;KmR
腐生葡萄球菌 ATCC 15305
質粒消除型菌林(Plasmid-cured type strain) 生物被膜缺陷(/ O型突變體;Em8-
臨束塑菌株(Clinical type strain)
Promega
New Iingland Biotabs
(Uetai, 1988)
(Kreis\M'rth ei α/., 1983)
(Peng etal, 1988) (Duthie and Lorenz. 1952)
f究 .f究本研究本研究
f究 ■
(Dalee/ al., 2004b) (Dale β ο/., 2004b) f究 f究 f究本研究 (Dale et α , 2004b)
W. Kloos (Dobinsky et α!， 2002)
(Kurod^eieL 1θθ5)
權利要求
1.一種抑制金黃色葡萄球菌的方法，包括抑制金黃色葡萄球菌中葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取的步驟。
2.權利要求1的方法，其中葡萄球菌鐵載體A介導的鐵攝取和葡萄球菌鐵載體B介導的鐵攝取受到抑制。
3.權利要求2的方法，其中葡萄球菌鐵載體A的產生受到抑制并且葡萄球菌鐵載體B 的產生受到抑制。
4.權利要求3的方法，其中葡萄球菌鐵載體A產生所需的Sbt多肽的表達或活性受到抑制，并且葡萄球菌鐵載體B產生所需的Sbn多肽的表達或活性受到抑制。
5.權利要求4的方法，其中SbtA、SbtB、SbtC和SbtD的至少一種的表達或活性受到抑制，并且 SbnA、SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 和 SbnI 的至少一種的表達或活性受到抑制。
6.權利要求2的方法，其中葡萄球菌鐵載體A的轉運受到抑制，并且葡萄球菌鐵載體B 的轉運受到抑制。
7.權利要求6的方法，其中所述Hts轉運系統受到抑制并且所述Sir轉運系統受到抑制。
8.權利要求7的方法，其中葡萄球菌鐵載體A的轉運所需要的Hts多肽的表達或活性受到抑制，并且葡萄球菌鐵載體B的轉運所需要的Sir多肽的表達或活性受到抑制。
9.權利要求8的方法，其中HtsA、HtsB和HtsC的至少一種的表達或活性受到抑制，并且SirA、SirB和SirC的至少一種的表達或活性受到抑制。
10.權利要求6的方法，其中!^huC受到抑制。
11.一種制備葡萄球菌鐵載體B的方法，包括在適合于產生葡萄球菌鐵載體產物的條件下將Sbt多肽與所述多肽的底物混合。
12.權利要求11的方法，其中所述Sbt多肽為合成酶。
13.權利要求12的方法，其中所述Sbt多肽為SbtB和SbtD，并且所述底物為檸檬酸和D-鳥氨酸。
14.一種制備葡萄球菌鐵載體B的方法，包括在適合于產生葡萄球菌鐵載體產物的條件下將Sbn多肽與所述多肽的底物混合。
15.權利要求14的方法，其中所述Sbn多肽為合成酶和脫羧酶。
16.權利要求15的方法，其中所述Sbn多肽為SbnC、SbnE、SbnF和SbnH，并且所述底物為L-2，3-二氨基丙酸、檸檬酸和α-酮戊二酸。
17.—種抑制金黃色葡萄球菌中葡萄球菌鐵載體A介導的鐵攝取的方法，包括抑制 SbtA, SbtB, SbtC和SbtD中的至少一種的表達或活性。
18.—種抑制金黃色葡萄球菌中葡萄球菌鐵載體A介導的鐵攝取的方法，包括抑制 HtsA, HtsB和HtsC中的至少一種的表達或活性。
19.權利要求2的方法，包括以下步驟抑制葡萄球菌鐵載體A所需要的Sbt多肽的表達或活性或者抑制葡萄球菌鐵載體A的轉運所需要的Hts多肽的表達或活性，并且抑制葡萄球菌鐵載體B產生所需要的Sbn多肽的表達或活性或者抑制葡萄球菌鐵載體B的轉運所需要的Sir多肽的表達或活性。
20.一種抑制葡萄球菌鐵載體A介導的鐵攝取的方法，包括破壞HtsA的配體結合區。
全文摘要
本發明涉及抑制金黃色葡萄球菌的方法，包括抑制鐵載體介導的鐵攝取，例如葡萄球菌鐵載體介導的鐵攝取。這類抑制金黃色葡萄球菌的方法包括，通過抑制葡萄球菌鐵載體A和B的表達或活性或者通過抑制葡萄球菌鐵載體A和B的轉運來抑制葡萄球菌鐵載體A和葡萄球菌鐵載體B介導的攝取。所提供的方法可用于治療金黃色葡萄球菌感染。
文檔編號A61K45/00GK102203268SQ200980141621
公開日2011年9月28日 申請日期2009年8月14日 優先權日2008年8月19日
發明者D·E·海因里希斯, E·維奈斯, F·比斯利, J·張 申請人:西安大略大學