專利名稱：一種提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)效率的病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高在動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和 表達(dá)外源基因效率的病毒載體及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
桿狀病毒是自然界存在的一類天然宿主主要為鱗翅目和鞘翅目昆蟲的 病毒，長期以來被用作生物農(nóng)藥來防治農(nóng)林害蟲，也廣泛地用于在昆蟲細(xì)胞 中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因工程表達(dá)載體。其模式種為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病 毒"w/^grop/za ca/z/o簡'ca附w/"ct/戶W wwc/eopo/y/^(irav77"ws，簡禾爾AcMNPV)。
近年來，人們發(fā)現(xiàn)桿狀病毒同樣是一類優(yōu)良的在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)蛋 白質(zhì)的基因工程表達(dá)載體和基因治療及疫苗載體。目前已經(jīng)證實該載體可以 有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)數(shù)十種各類來源的哺乳動物細(xì)胞，并讓目的基因在哺乳動物細(xì)胞 中高效地表達(dá)(Cheng T， XuCY， Wang YB, Chen M, Wu T， Zhang J, XiaNS. 2004. A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus， World J Gastroenterol. 10(11): 1612-1618 ; Hu YC 2006. Baculovirus vectors for gene therapy. Adv Virus Res.;68:287-320.)。
桿狀病毒載體介導(dǎo)目的基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的基本原理是利用 能被哺乳動物細(xì)胞識別的啟動子——如巨細(xì)胞病毒的IE啟動子(CMV)和 勞氏瘤病毒的LTR啟動子等一一控制目的基因，構(gòu)成表達(dá)框。再將該表達(dá)框 的DNA整合到病毒DNA骨架上，構(gòu)建得到重組桿狀病毒；利用重組桿狀病 毒可以進(jìn)入多種哺乳動物細(xì)胞的特點將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入目的細(xì)胞系并表達(dá)。 桿狀病毒-哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的主要優(yōu)點包括病毒遺傳背景清晰，基因 容量大；能承載較大的目的基因；生物安全性好，天然情況下不感染人類， 不在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制；容易擴(kuò)大規(guī)模，達(dá)到生產(chǎn)要求；能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)多種哺 孚L細(xì)胞等等(Hu YC 2006. Baculovirus vectors for gene therapy. Adv VirusRes,;68:287-320.; Kost T.A., Condreay J,P. and Jarvis D丄.,2005. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 ,567-575 )。但是，這一載體系統(tǒng)的缺點也比較明顯，如對 不同細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率不同，尤其是在常用的基因工程細(xì)胞株中國倉鼠卵 巢細(xì)胞CHO中，基因轉(zhuǎn)移效率不理想，影響了其廣泛的應(yīng)用。
細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是一類能夠攜帶生物大分子，包括蛋白質(zhì)，DNA，甚至顆粒 物進(jìn)入細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多肽序列，又叫蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein transduction domain, PTD)。其中最為著名的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是1988年Green和 Frankel各自獨立發(fā)現(xiàn)的人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白(Green M, Loeweastein PM. 1988. Autonomous functional domain of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat transactivator protein. Cell, 55:1179-1188; Frankel AD, Pabo CO. 1988. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 55: 1189-1193)。 進(jìn)一歩的研究發(fā) 現(xiàn)，TAT蛋白47 57位氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)即具有細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 功能(VivesE， BrodinP， Lebieu B. 1997. A truncated HIV-1 Tat basic domain rapidly tanslocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem， 272: 16010-16017)。目前細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽被廣泛應(yīng)用于幫 助生物大分子進(jìn)入細(xì)胞，但是通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽展示在病毒核衣殼上以提高 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率的技術(shù)尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)效率的病毒載體。 本發(fā)明目的之二是提供一種可提高病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)目的基因效率 的方法。
本發(fā)明提供了一種提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)效率的病毒載體，包括病毒的 核衣殼蛋白啟動子序列、核衣殼蛋白編碼序列、帶啟動子的目的基因序列，該載 體中還包含細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列，并且該細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽由病毒的核衣殼蛋白啟動 子控制轉(zhuǎn)錄翻譯。本發(fā)明所述的病毒載體中，該細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列緊鄰核衣殼蛋白編碼序 列之前或者之后。
本發(fā)明所述的病毒載體中，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列位于病毒的核衣殼蛋 白啟動子序列之后，可以位于核衣殼蛋白編碼序列之前。
本發(fā)明所述的病毒載體可以是桿狀病毒，家蠶核型多角體病毒(萬OW^X ,"',/"'ca戸W "wc/eo/ o(y/7et^頻yiw,簡稱BmMNPV)， 棉鈴蟲單核衣殼核 型 多 角 體 病 毒(//Wcoverpa"rmfgeraw'"g7e "wc/eoca戸W "wc/e印o(y/^AcmVi^ ，簡稱HaSNPV)等。也可包括濃核癥病毒(Densoviruses )， 虹彩病毒(Iridoviruses)等昆蟲病毒和植物病毒，噬菌體等。。
本發(fā)明所述的病毒載體中，所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是人免疫缺陷病毒I型的TAT 蛋白第47 57位氨基酸序列，如單皰疹病毒(HSV)的VP22 (Eliott G, O，Hare P.1997. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 88: 223—233)、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp( Derossi D, Joliot AH， Chassaing G, Prochiantz A .1994. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem, 269: 10444—10450) 、 H BV的preS抗 原(Peter V, Freya VH, Benedikte S, Geert L-R. 2005. The arginine-rich carboxy-terminal domain of the hepatitis B virus core protein mediates attachment of nucleocapsids to cell-surface-expressed heparan sulfate. J Gen Virol, 86:75-84)等。
本發(fā)明還提供了上述病毒載體的制備方法，即將細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列插 入帶有目的基因序列的病毒核衣殼蛋白載體中，并使細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽置于病毒的核衣
殼蛋白啟動子控制下。
例如，將細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的核苷酸編碼序列與病毒核衣殼蛋白的編碼序列連 接，插入細(xì)菌-病毒穿梭質(zhì)粒。然后將病毒核衣殼蛋白的啟動子序列和目的基 因的編碼序列分別插入前述含有細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的核苷酸編碼序列與病毒核衣 殼蛋白的編碼序列的細(xì)菌-病毒穿梭質(zhì)粒，從而構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒。
本發(fā)明中，所述的重組病毒的構(gòu)建方法包括但不局限于Bac-to-Bac法。 Bac—to—Bac是Invitrogen公司(Carlsbad, California, USA)提供的一禾中 利用穿梭質(zhì)粒和細(xì)菌轉(zhuǎn)座技術(shù)構(gòu)建重組桿狀病毒的商業(yè)化系統(tǒng)，可以在細(xì)菌 中將外源基因插入桿狀病毒基因組。本發(fā)明中，相關(guān)編碼序列包括由于密碼子的簡并性產(chǎn)生的簡并序列。該簡并 序列是指，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生 的序列。由于密碼子的簡并性，所以同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出相 同的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種可提高病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)目的基因效率的方法， 即在病毒核衣殼上展示細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽。
上述方法中，可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與病毒核衣殼蛋白融合表達(dá)。 本發(fā)明中，所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽展示位置是病毒核衣殼，展示方法包括但 不限于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和病毒天然核衣殼蛋白融合表達(dá)。也可將細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與病 毒的其他次要核衣殼蛋白融合表達(dá)，或使細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過分子間作用和病毒 核衣殼結(jié)合或交聯(lián)等。
本發(fā)明中，所述的病毒包括但不局限于桿狀病毒，例如其標(biāo)準(zhǔn)株苜蓿銀 紋夜蛾核型多角體病毒 (Jw,ogra/ /2" CCZ/(/b環(huán)'Cfl 附w/Z"/CO/XS7W "wc/eopo(y/jet/rov/ "W5:， f茍禾爾AcMNPV),家蠶t亥型多角j本病毒(5ow6_y;c ww/"copwW 2Wc/eo;w/;;/ze&oWn^,簡稱BmMNPV)，棉鈴蟲單核衣殼核型多 角體病毒 (ar附/gem w.wg/e wwc/eoca/757W"wc/eopo(y/ze<irov7>i "， 簡 稱HaSNPV)等，也可包括濃核癥病毒(Densoviruses)，虹彩病毒(Iridoviruses) 等昆蟲病毒和植物病毒，噬菌體等。
上述方法中，所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽包括但不局限于人免疫缺陷病毒I型的TAT 蛋白第47 57位氨基酸序列，如單皰疹病毒(HSV)的VP22、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp、 HBV的preS抗原等。
本發(fā)明中以mCherry (櫻桃紅熒光蛋白)為目的基因，結(jié)果證明本發(fā)明 的病毒載體可以顯著提高目的基因在動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率。本發(fā)明 還以綠色熒光蛋白GFP、蟲熒光素酶luciferase、分泌性堿性磷酸酶SEAP等 為外源目的基因，結(jié)果同樣表明本發(fā)明的病毒載體可以顯著提高目的基因在 動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率。
本發(fā)明的提高在動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)外源基因效率的方法，可應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞，組織培養(yǎng)和體內(nèi)，如在體外培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)，在體 內(nèi)用作基因治療和疫苗免疫的載體等。所述的動物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)
胞CHO，人肝癌細(xì)胞HepG2，鼻咽癌細(xì)胞CNE，非洲綠猴腎細(xì)胞VERO等 哺乳動物細(xì)胞來源的體外培養(yǎng)細(xì)胞系，哺乳動物原代培養(yǎng)細(xì)胞，和哺乳動物 活體組織的細(xì)胞等。
本發(fā)明在病毒上展示一種正電荷氨基酸富集的肽鏈，該肽鏈能夠有效提 高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。與未經(jīng)改造的病毒載體比較，改造后的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì) 胞效率是對照病毒的2倍，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后12小時到96小時，目的基因表達(dá)水平 上升。本發(fā)明適用于生產(chǎn)具有天然活性的蛋白質(zhì)，及利用病毒載體進(jìn)行疾病 基因治療和疫苗免疫。


圖1.經(jīng)改造的桿狀病毒和對照病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖。Acptv為改造 后病毒，Acpv為對照病毒。
圖2.經(jīng)改造的桿狀病毒和對照病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO效率 的比較圖。目的基因為櫻桃紅熒光蛋白mCherry，測定方法為轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時 在熒光顯微鏡下統(tǒng)計產(chǎn)生紅色熒光的細(xì)胞的比例。
圖3.經(jīng)改造的桿狀病毒和對照病毒在中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO中表達(dá) 目的水平的比較圖。目的基因為櫻桃紅熒光蛋白mCherry，測定方法為轉(zhuǎn)導(dǎo) 后48小時以熒光測定儀檢測紅色熒光的平均強(qiáng)度。
具體實施例方式
本發(fā)明中相關(guān)實驗可參考如下步驟
1.展示有細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的病毒載體的構(gòu)建利用分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼
細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的DNA序列(如TAT， VP22， Antp， preS抗原等)與病毒的核 衣殼蛋白(如桿狀病毒主要核衣殼蛋白VP39)基因融合，并置于適當(dāng)?shù)膯?動子控制下，得到融合蛋白表達(dá)序列。利用轉(zhuǎn)座(如Bac-to-Bac系統(tǒng))、重 組(如同源重組，Red重組)等辦法將融合蛋白表達(dá)序列整合到病毒基因組
7骨架的適當(dāng)位點(如桿狀病毒多角體蛋白位點、p10蛋白位點或其他不影響 病毒復(fù)制的位點)，得到重組病毒DNA。
2. 目標(biāo)病毒的獲得提取改造后重組病毒DNA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,電轉(zhuǎn) 化，CaCl2轉(zhuǎn)化等方法將病毒DNA轉(zhuǎn)入合適的細(xì)胞(如Sf9， Sf21等)中，在 合適的溫度(如27攝氏度)培養(yǎng)細(xì)胞(通常為2-6天)，收取細(xì)胞培養(yǎng)液或 細(xì)胞裂解液，即得到目標(biāo)病毒。該病毒作為原代病毒液，在合適的條件下妥 善保存。用合適的細(xì)胞(如Sf9， Sf21等)擴(kuò)增病毒。用終點稀釋法，或者 其它合適方法測定病毒效價。對于其他種類的病毒，可以用相應(yīng)的方法獲得 重組病毒。
3. 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)取CHO細(xì)胞等目標(biāo)哺乳動物細(xì)胞，根據(jù)病毒液的 效價，按細(xì)胞數(shù)病毒數(shù)=1: 50 200的比例將病毒與細(xì)胞混合，37攝氏度 溫育4-6小時后，移除病毒液，并添加合適的新鮮培養(yǎng)基，37攝氏度繼續(xù)培 養(yǎng)48-96小時，檢測基因表達(dá)情況，或收取蛋白。
實施例1獲得目的病毒DNA
化學(xué)合成Tat (47-57aa)肽鏈對應(yīng)的DNA序列，并與編碼桿狀病毒核衣 殼蛋白VP39的DNA序列融合，插入Bac-to-Bac系統(tǒng)的pFastBac-l質(zhì)粒 (Invitrogen公司)EcoR I-Kpn I位點，得到pFB-tv。 PCR擴(kuò)增得到vp39啟 動子DNA序列并插入到pFB-tv質(zhì)粒EcoR I位點，得到pFB-ptv。在Sal I位 點插入CM「wC/^o;DNA序列，得到質(zhì)粒pFB-ptvc。利用類似的方法得到 對照質(zhì)粒pFB-pvc，在這個質(zhì)粒中，天然的vp39代替融合了 Tat的tat-v; 39。 利用Bac-to-Bac系統(tǒng)得到重組病毒DNA。 實施例2獲得目的病毒
將獲得的目的重組病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得原代病毒并擴(kuò)增病毒， 測定效價。目標(biāo)病毒被命名為Acptv和Acpv (圖1)。.
實施例3表達(dá)蛋白
將CHO細(xì)胞37攝氏度培養(yǎng)過夜，移除培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，按照細(xì)
8胞數(shù)病毒數(shù)=1: 50加入病毒液，37攝氏度溫育6小時，移除病毒液，并
用PBS洗滌細(xì)胞兩次，37攝氏度靜置培養(yǎng)48h，檢測產(chǎn)生熒光的細(xì)胞比率(圖 2)和細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(圖3)。
實施例4采用綠色熒光蛋白gfp為外源目的基因
按照實施例1-3的方法，用綠色熒光蛋白gfp的dna序列代替wC/j^o; dna序列，構(gòu)建重組病毒；然后，轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞擴(kuò)增病毒；隨后，在cho
細(xì)胞中按照細(xì)胞數(shù)病毒數(shù)=1: 25的比例加入病毒液；最后檢測，產(chǎn)生綠色 熒光的細(xì)胞比率和細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度均是對照的2倍多。
權(quán)利要求
1、一種提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)效率的病毒載體，包括病毒的核衣殼蛋白啟動子序列、核衣殼蛋白編碼序列、帶啟動子的目的基因序列，其特征在于，該載體中還包含細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列，并且該細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列緊鄰核衣殼蛋白編碼序列之前或者之后。
2、 如權(quán)利要求1所述的病毒載體，其特征在于，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼 序列位于病毒的核衣殼蛋白啟動子序列之后并且位于核衣殼蛋白編碼序列之前。
3、 如權(quán)利要求1或者2所述的病毒載體，其特征在于，所述的病毒為桿 狀病毒、家蠶核型多角體病毒或者棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒。
4、 如權(quán)利要求1或者2所述的病毒載體，其特征在于，所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 肽是人免疫缺陷病毒I型的TAT蛋白第47 57位氨基酸序列、單皰疹病毒的 VP22、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp或者HBV的preS抗原。
5、 如權(quán)利要求1或者2所述病毒載體的制備方法，其特征在于，將細(xì)胞 轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列插入帶有目的基因序列的病毒核衣殼蛋白載體中，并使細(xì)胞轉(zhuǎn) 導(dǎo)肽置于病毒的核衣殼蛋白啟動子控制下。
6、 一種提高病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)基因效率的方法，其特征在于，在病毒 核衣殼上展示細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與病毒核衣殼蛋白 融合表達(dá)。
8、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的病毒為桿狀病毒、家 蠶核型多角體病毒、棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒、濃核癥病毒、虹彩病毒或 者噬菌體。
9、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是人免疫 缺陷病毒I型的TAT蛋白第47 57位氨基酸序列、單皰疹病毒的VP22、果蠅 轉(zhuǎn)錄因子Antp或者HBV的preS抗原。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高在動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)外源基因效率的病毒載體及其應(yīng)用方法。本發(fā)明提供了一種提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)效率的病毒載體，包括病毒的核衣殼蛋白啟動子序列、核衣殼蛋白編碼序列、帶啟動子的目的基因序列，該載體中還包含細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的編碼序列，并且該細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽由病毒的核衣殼蛋白啟動子控制轉(zhuǎn)錄翻譯。改造后的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞效率是對照病毒的2倍，目的基因表達(dá)水平明顯上升。本發(fā)明適用于生產(chǎn)具有天然活性的蛋白質(zhì)，及利用病毒載體進(jìn)行疾病基因治療和疫苗免疫。
文檔編號C12N15/67GK101429524SQ20081020720
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者雋 尹, 儷 李, 鑫 王, 江 鐘 申請人:復(fù)旦大學(xué)