專利名稱：：miR-451在制備治療非小細胞肺癌藥物的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于基因工程領域，特別涉及miR-451在制備治療非小細胞肺癌藥物的應用。
背景技術：
：RNA是生物體內最重要的物質基礎之一，它與DNA和蛋白質一起構成生命的框架。但長久以來，RNA一度被認為僅僅是DNA和蛋白質之間的“過渡”，它從DNA那兒獲得自己的順序，然后將遺傳信息轉化成蛋白質。然而，一系列的研究表明，這些小分子RNA事實上操縱著許多細胞功能，它可通過互補序列的結合反作用于DNA，從而關閉或調節基因的表達。最近發現的一類非蛋白編碼的RNA家族，microRNA(miRNA,即微小RNA)，可以通過與特定mRNA結合或調節特定mRNA的蛋白質翻譯過程來調控基因表達。目前人類基因組中已確認的miRNA有一千多種，可能參與調控人類30%蛋白編碼基因的表達。MicroRNA簡稱為miRNA，通常長度為1925個核苷酸，廣泛存在于各種動植物甚至單細胞真核生物中，是一類在進化上高度保守的小分子單鏈RNA。miRNA位于基因內含子區域，在細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成pri-microRNA(pri-miRNA)。Pri-miRNA在一種DroshaRNase的作用下，剪切為約70個核苷酸長度，具有莖環結構的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依賴的核質/細胞質轉運蛋白Exportin5的作用下，從核內運輸到胞質中。在Dicer酶的作用下，pre-miRNA被剪切成2125個核苷酸長度的雙鏈miRNA:miRNA*。隨后雙鏈miRNA:miRNA*解旋，成熟的miRNA進入到胞漿RISC(RNA誘導的沉默復合物)中發揮基因沉默功能。miRNA與下游特定基因的信使RNA(mRNA)的3’端非編碼區(3’UTR)產生堿基互補配對，引起該mRNA的降解或抑制其翻譯，導致蛋白表達失敗。我們將這些下游的基因稱作miRNA的靶基因，他們在細胞中通常具有重要的生物學功能，miRNA通過調節靶基因的表達在細胞中行使重要的功能，與胚胎的發育，生長發育、細胞的增殖、分化密切相關。科學家已證實，miRNA的核苷酸序列在不同物種間高度保守，突變率極低，其表達有基因簇集現象，時空及組織特異性。miRNA在轉錄后水平調控蛋白質基因的表達譜來決定細胞分化、胚胎發育等一系列重要生命活動的進程及多樣性。據發現，miRNA不僅是細胞增殖、分化和凋亡的重要調控因子，50%以上的miRNA定位在腫瘤相關基因組區域，包括L0H區、染色體擴增區及脆性位點等。經鑒定，miRNA在多種血液系統腫瘤和實體瘤中的表達譜發生改變，這為我們從RNA調控的角度揭示腫瘤發生機制提供理論基礎，并為腫瘤診斷和治療提供新的基因靶點和分子標記。在人類基因組序列中，miR-451為一種MicroRNA，位于17qll.2，大鼠和斑馬魚基因組中，分別位于11號和5號染色體。miR-451的序列為5’-aaaccguuaccauuacugaguu-3’(GeneBank:GeneID=574411)。miR-451在進化上高度保守，不同物種間存在同源性。根據世界衛生組織(WHO)公布的資料顯示，肺癌的發病率和死亡率在世界各國均呈明顯上升的趨勢，尤其是工業發達的國家。在發達國家，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，列男性常見惡性腫瘤的第一位，列女性常見惡性腫瘤的第2、3位。20世紀末肺癌已占惡性腫瘤死亡的首位。非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%，可分為鱗癌、腺癌、大細胞肺癌等。許多肺癌患者在診斷時已發生轉移，往往失去手術機會，而針對肺癌的化療方案效果亦欠佳，患者容易產生耐藥，五年生存率低于5%，亟需尋找新的、有效的治療肺癌的方法。隨著基因工程研究的深入，科學家對運用基因工程研制腫瘤藥表現出濃厚的興趣。發明人發現miR-451在治療非小細胞肺癌方面具有很好應用前景。
發明內容技術目的本發明的目的是提供miR-451在制備治療非小細胞肺癌藥物中的應用。本發明的目的是通過下列步驟來實現的1、擴增Pre-miR-451:Pre_miR-451，即編碼miR-451前體pre-miR-451的基因序列，其RT及PCR引物由invitrogen公司合成，引物序列見具體實施例中RT-PCR。RT-PCR擴增Pre-miR-451，純化產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，約72bp處擴增出一條與預期大小相一致的條帶。2、連接pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體(購自上海吉瑪公司，載體見圖1，其中EmGFP為綠色熒光蛋白報告基因，用以檢測轉染效率)，經BamHI和XhoI酶切后得到線性載體，將PCR產物連接至載體上構成pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。10ul連接體系2ulPCR產物，lul線性載體，lul10*T4ligasebuffer,1u1T4DNAligase，5ulddH20。3、轉化A、制備新鮮大腸桿菌感受態細胞(JM109)，混勻感受態細胞。B、取20ul感受態細胞于新的離心管中，加入lul連接體系，靜置30min冰浴。C、感受態細胞于42°C加熱42秒，取出后迅速4°C冰水中放置2min。D、加入400ul空白LB培養液，37°C振搖，恒溫培養30min，重懸后用消毒玻棒涂于瓊脂板上，待板干燥后，倒置平皿，37°C孵育1216h。4、擴增根據該質粒載體上攜帶殺稻瘟菌素抗性的特性，挑選陽性克隆于5mlLB培養液中37°C恒溫振搖1216h，大量擴增pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。重組體提取、純化參照BI0MIGA無內毒質粒小提試劑盒(PD1214)說明書。5、載體pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451經BamHI和XhoI酶切得到兩個片段，分別為72bp的Pre-miR-451片段和5.7kb的線性pcDNA6.2-GW載體，結果與預期結果相符，pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451測序結果與GenBank中序列完全一致。6、測序正確的重組體轉染腫瘤細胞使用脂質體法，轉染步驟參照LipofectamineTiGOOO說明書。轉染成功的細胞有綠色熒光蛋白表達，轉染效率用流式細胞儀分析，不同的細胞系轉染效率均可達到60%。7、Pre-miR-451隨質粒轉染入腫瘤細胞后，CMV啟動子在腫瘤細胞中快速、高效、持續表達Pre-miR-451，經過Drosha(RNaselll)作用形成具有莖環結構的pre_miR-451(約72nt)，再經過Dicer作用形成成熟的miR-451(22nt)，發揮基因沉默功能。一、miR-451抗非小細胞肺癌的基礎驗證試驗(一):miR-451在非小細胞肺癌組織與癌旁正常組織中的表達譜1.樣本準備收集60例非小細胞肺癌(NSCLC)手術切除標本，經臨床病理分析均屬于Illb和IV期，標本由南京醫科大學第二附屬醫院病理科提供。2.芯片制備及分析按照美國的LCSciences公司的要求準備肺癌組織標本，交由LCSciences公司進行芯片制備，SangermiRBaseV10.0版本完成芯片分析。3.芯片結果實驗數據來自LCSciences公司，結果如圖2及表格1所示。4.結果分析miR-451在正常組織(SampleA)中信號為26，894.73，在腫瘤組織(SampleB)中信號為157.30，log2(SampleB/SampleA)為_7.41，表示miR-451在正常組織中高表達，在腫瘤組織中顯著低表達，二者差異達150倍，提示miR-451在肺癌中可能作為一個抑癌基因發揮重要的抗腫瘤作用。表1顯著性差異列表(p值<0.01的顯著性差異表達轉錄子，其中hsa為檢測人標本的探針)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(二)RT_PCR分析miR-451在非小細胞肺癌組織與癌旁正常組織中的表達譜1.方法Trizol試劑提取組織總RNA，RT-PCR運用Ambion公司SuperTaq聚合酶系統和mirVana檢測盒，人TO作為內參。2.RT-PCR結果如圖3所示。3.結果分析miR-451在正常組織中表達量增高，腫瘤組織中表達下降，與基因芯片結果一致。二、miR-451對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡、遷移、耐藥的影響(一)細胞增殖實驗1.MTT法測細胞增殖選擇四株NSCLC細胞系，其中肺腺癌細胞系A549，H3255，肺鱗癌細胞系H157，肺大細胞癌細胞系H1299，四株細胞系轉染Pre-miR-451為實驗組，空載體序列(negativecontrol,NC)設為對照組。將這些細胞株種在96孔板上，2500個細胞/孔。轉染3天后MTT染色法監測細胞增殖情況。2.結果測定如圖4所示。3.結果分析MTT法顯示，與對照組相比，轉染了Pre-miR-451的A549細胞增殖數明顯減少。H157，H1299，H3255三個細胞系中也觀察到此現象，提示miR-451可以抑制腫瘤細胞的生長。實驗二細胞凋亡實驗1.Caspase3/7活性法測細胞凋亡在NSCLC細胞系A549,HI57，HI299，H3255中分別轉染Pre-miR-451和空載體序列，后者設為對照組。轉染72h后將這些細胞株分放于OilMDDP(順鉬，化療藥)和2iiMDDP的培養基中培養，運用ApoONEHomogeneousCaspase3/7Assay測定細胞中caspase3/7活性。2.caspase3/7活性測定如圖5所示。3.結果分析與對照組相比，轉染Pre-miR-451后，四個細胞系中均出現caspase3/7活性上升，提示miR-451可促進腫瘤細胞的凋亡。盡管單用Pre-miR-451引起的caSpaSe3/7活性增加沒有單用DDP效果明顯，但聯合使用DDP和Pre-miR-451后，caspase3/7活性顯著上升，高于單用Pre-miR-451和DDP提示miR-451能夠增加腫瘤細胞對化療藥的敏感性，可作為腫瘤治療的干預靶點。實驗三細胞侵襲實驗1.Transwell遷移實驗A549細胞系分別轉染Pre-miR-451和空載體序列，后者設為對照，接種到Transwell上室中，選擇接種后24h，48h，72h時間點觀察A549細胞侵襲情況。2.細胞計數用直接計數法測定Transwell下室中腫瘤細胞的數目。實驗組明顯低于對照組。計數結果如圖6所示。3.結果分析與對照組相比，轉染Pre-miR-451后A549細胞的侵襲能力下降，miR-451可以抑制腫瘤細胞的侵襲，轉移。實驗四活體水平觀察miR-451的抗癌作用(一)、皮下瘤實驗1.活體模型我們選取四只5-6周齡大小的雌性裸鼠，將轉染了Pre-miR-451和空載體(NC)的A549細胞分別接種到同一只小鼠兩側肋背部的皮下組織中，每側接種細胞數為1*105或5*104個，觀察腫瘤細胞的生長情況。2.腫瘤生長情況評估每天觀察一次，持續至少五周。測量腫瘤灶的長度L和寬度W，按照公式(L*W~2)*0.5計算腫瘤灶的體積來判斷miR-451在活體水平對腫瘤細胞生長的影響。3.測量結果到觀察結束為止，4只小鼠轉染了Pre-miR-451的一側未見明顯腫瘤灶的形成，而4只小鼠中有3只在觀察的22-27天時，接種NC—側可觸摸到腫瘤灶的形成，觀察結束時，這些腫瘤灶體積為35-145cm2大小。腫瘤體積如圖7所示。4.結果分析從活體實驗結果可以看出，miR-451在小鼠體內可抑制肺癌細胞生長，與我們之前在細胞系水平得到的結果一致，證實了miR-451具有抑癌作用。(二)肺原位癌實驗1、肺癌模型的建立的材料4只Lox-stop-loxK-RasG12D(LSLK-RasG12D)轉基因小鼠由人類癌癥協會小鼠模型庫(MouseModelsofHumanCancerConsortium,MMHCC)饋贈，HEK293(AmericanTypeCultureCollection,cat#CRL.1573)腺病毒的包裝細胞由第三軍醫大學生物化學與分子生物學教研室饋贈，ADCre,AdPre-miR-451重組腺病毒由Microbix公司提供。Ad腺病毒載體上帶有0半乳糖苷酶操縱子，用以檢測轉染效率。利用Cre重組酶在轉基因小鼠體內誘導K-Ras基因表達，促進肺部腫瘤發生的原理建立肺腺癌的模型°參照文獻⑴Thelet_7microRNAreducestumorgrowthinmousemodelsoflungcancer.CellCycle7:6，759-764.2008(2)小鼠肺腺癌動物模型的建立。山西醫科大學學報。1007-6611(2009)05-0408-03。2、建模步驟及miR-451的干預以戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉3周齡小鼠，再以Ad腺病毒CaPi(Ad腺病毒CaPi:滴度為2.5X10，pfu的Ad腺病毒50ul加入到69ul的MEM中，再加入6ul的2.5mol/L的氯化鈣)的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔，共滴入約125ul，分2次滴人，隔5天后重復，共兩次。實驗組AdCre+AdPre-miR-451，n=2，對照組AdCre+AdNC,n=2。3、結果測定鼻腔滴注7周后處死小鼠，取小鼠肺部組織稱重，石蠟包埋，切片，HE染色。實驗組(Cre/Pre-miR-451)較對照組(Cre/NC)相比腫瘤體積顯著縮小，肺腫瘤全肺組織比值如圖8所示。4、結果分析該實驗運用轉基因小鼠LSLK-RasG12D建立肺腺癌模型，再次證明，miR-451可抑制肺腺癌的發生，抑制腫瘤細胞的生長。所述miR-451的表達載體，這些表達載體包括但不限于質粒、細菌、宿主細胞。含有治療有效量的所述miR-451或其表達載體和藥學上允許的輔料組成的藥物組合物。所述的藥物組合物，其制劑采用藥學上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、口服液或脂質體。上述miR-451序列或它們的表達載體在制備腫瘤靶向藥物中的應用。本發明中的統計學分析采用SPSS11.0軟件(Release11.0，SPSSInc.)進行數據處理，數據表示以均值士標準差。進行方差分析和t檢驗，結果以P<0.05為差異有顯著性意義有益效果1、目前較為常用的制備miRNAs的方法，有體外制備miRNAs和以DNA為模板轉染到細胞并在體內轉錄得到miRNAs。本發明采用了后一種方法，本法簡便，已有大量文獻報道可成功制備miRNAs，不需要直接操作RNA，克服了人工合成miRNA容易降解，成本昂貴的缺點。而且由于含表達載體的菌株可長期保存并大量擴增，為今后的研究提供了極大的方便。2、由于miR-451在體內一般以前體形式(pre_miR-451)存在，并且Pri_miR-451在一種DroshaRNase的作用下，剪切為約72個核苷酸長度，具有莖環結構的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miR-451在Ran-GTP依賴的核質/細胞質轉運蛋白Exportin5的作用下，從核內運輸到胞質中。在Dicer酶的作用下，pre-miR-451被剪切成22個核苷酸長度的雙鏈miRNA:miRNA*o隨后雙鏈miRNA:miRNA*解旋，成熟的miR-451進入到胞漿RISC(RNA誘導的沉默復合物)中發揮基因沉默功能。由于Pre-miR-451在體內可以成功地加工成為成熟體miR-451，本發明也采用Pre-miR-451代替miR-451。試驗中通過重組體轉染大腸桿菌JM109細胞獲得大量的Pre-miR-451，為進行相應的藥理試驗做好準備。同時為了避免載體對本實驗影響，采用空載體做對照試驗，結果表明空載體對本發明沒有影響。3、通過miR-451對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡、遷移、耐藥的影響，說miR-451對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、耐藥皆有抑制作用，且促進非小細胞肺癌細胞的凋亡，同時活體水平也表明miR-451具有抗癌作用。圖1為表達miR-451的質粒載體。圖2為基因芯片分析肺癌組織與癌旁正常組織中miRNA表達譜的情況(左邊的SampleA是癌旁正常組織，信號值為Cy3；中間的SampleB是肺癌組織，信號值為Cy5，右邊的是癌旁/癌的信號比值Cy3/Cy5；在Cy3/Cy5信號比值圖中，當Cy3信號高于Cy5信號時，色彩顯示為綠色；當Cy3信號與Cy5信號相當時，色彩顯示為黃色；當Cy5信號高于Cy3信號時，色彩顯示為紅色)。圖3RT-PCR測肺癌組織⑴與癌旁正常組織(N)中miR-451水平，GAPDH設為內參。圖4為MTT法測miR-451對肺癌細胞系A549，H1299，H3255，H157細胞增殖的作用。圖5為miR-451前體對肺癌細胞系A549，H1299，H3255，H157凋亡的檢測圖6為Transwell法測miR-451前體對肺癌細胞系A549細胞遷移的作用圖7為活體實驗測miR-451對A549細胞增殖的作用，縱坐標為皮下瘤體積，橫坐標為小鼠代號圖8為LSLK-RasG12D轉基因小鼠模型上觀察miR-451對肺腺癌生長的作用，其中縱坐標為肺腫瘤(Tumor)全肺組織(TotalLungArea)的比值；橫坐標為轉基因小鼠代號，#1，#2為實驗組(Cre/Pre-miR-451)，#3，#4為對照組(Cre/NC)。具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述，但不限制本發明。一般性說明實施例中末注明具體條件的的實驗方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的8《分子克隆實驗指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黃培堂等譯，科學出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進行，其它沒有詳細描述的技術相應于本領域人員來說是熟知的標準方法。本發明的材料本申請中提及的微生物、細胞系、質粒或其他表達載體以及培養基均有商品供應或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。實施例11、擴增Pre-miR-451:Pre_miR-451，其RT及PCR引物由invitrogen公司合成，引物序列見如下的RT-PCR。RT-PCR擴增Pre-miR-451，純化產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，約72bp處擴增出一條與預期大小相一致的條帶。RT-PCR分別設計miR-451和TO(作為內參)引物，由Invitrogen公司合成。1)引物序列及反應條件MiR-451的RT引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAACTCAG-3，GAPDH的RT引物為Oligo(dT)15表1.PCR引物序列及反應條件GenesymbolPrimersCDNATacyclesPre-miR-451Forv/ard:5'-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAcr-yReverse:5'-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'72bp60°C30GAPDHforword:5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3'lOlbp55°C35Reverse:5'-GG6TGGAATCATATTGGAACATGT-3'2)cDNA的合成5XRTBufferdNTPInhibitorPrimerRNARTaceH20(RNaseFree)4u12u11u11u1lU1(質量小于1Ug)1u110u1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>3)RT-PCR反應體系(50u1體系)以cDNA為模板，PCR反應體系10XExTaqBuffer(Mg2+Free)5u1MgC12(25mM)5u1dNTP(2.5mM)5u1上游引物(20pM/iil)2u1下游引物(20pM/iil)2u1Template2u1ExTaq(5U/u1)0.5u1ddH2028.5ill_總體積50ill采用以下反應條件94°C2min預變性，后接35個循環(18SRNA25個循環)，每一次循環的條件是94°C30s變性，54°C45s退火，72°C2分鐘延伸。4)PCR產物的鑒定50\了六￡|￡存液配制撲1860.5g，冰醋酸14.3ml，0.5mol/LEDTA25ml，加ddH20至250ml。1.0%瓊脂糖凝膠配制瓊脂糖1.0g，1XTAE溶液100ml，加熱至瓊脂糖融解，冷卻至50°C左右時加入溴乙錠至0.g/ml，鋪板凝固后使用。瓊脂糖凝膠電泳電泳槽中注入IXTAE溶液至高于凝膠面，取10illPCR產物，加1yl的10XDNA上樣緩沖液，混勻上樣，用DL2000DNAMarker作為參照，80V電泳，捷達凝膠成像系統觀察并采集圖象，實驗重復三次。2、連接pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體購自上海吉瑪公司，(載體見圖1，其中EmGFP為綠色熒光蛋白報告基因，用以檢測轉染效率)，經BamHI和Xhol酶切后得到線性載體，將PCR產物連接至載體上構成pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。10ul連接體系2ulPCR產物，lul線性載體，lul10*T41igasebuffer,lulT4DNAligase，5ulddH20。3、轉化1.制備新鮮大腸桿菌感受態(JM109)細胞，混勻感受態細胞2.取20ul感受態細胞于新的離心管中，加入lul連接體系，靜置30min冰浴。3.于42°C加熱42秒，取出后迅速4°C冰水中放置2min。4.加入400ul空白LB培養液，37°C振搖，恒溫培養30min，重懸后用消毒玻棒涂于瓊脂板上，待板干燥后，倒置平皿，37°C孵育1216h。4、擴增根據該質粒載體上攜帶殺稻瘟菌素抗性的特性，挑選陽性克隆于5mlLB培養液中37°C恒溫振搖1216h，大量擴增pcDNATM6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。重組體提取、純化參照BI0MIGA無內毒質粒小提試劑盒(PD1214)說明書。5、真核表達載體pcDNATM6.2-Gff-Pre-miR-451經BamHI和XhoI酶切得到兩個片段，分別為72bp的Pre-miR-451片段和5.7kb的線性pcDNA6.2-GW載體，結果與預期結果相符，pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451測序結果與GenBank中序列完全一致。6、測序正確的重組體轉染腫瘤細胞使用脂質體法，轉染步驟參照LipofectamineTiGOOO說明書。轉染成功的細胞有綠色熒光蛋白表達，轉染效率用流式細胞儀分析，不同的細胞系轉染效率均可達到60%。實施例2MTT法測細胞增殖1)接種細胞用0.25%胰蛋白酶消化單層培養細胞，用含10%胎牛血清的RPMIt604培養液配成單個細胞懸液，以每孔100-1000個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200ul。分成四個實驗組空載體組、Pre-miR-451組，DDP組，Pre-miR-451+DDP組。2)培養細胞；將培養板移入COz孵箱中，在37°C、5%C02及濕度條件下，培養3_5天。3)呈色培養第2-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37°C，繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。加入150illDMS0(二甲基亞砜)振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。4)比色490nm波長處測定光密度值(0D)，每組3個復孔，重復三次實驗。以空載體感染對照組作為對照，計算生存率。生存率=實驗組0D值/對照組0D值X100%。按如上方法選擇四株非小細胞肺癌細胞(NSCLC系，其中肺腺癌細胞系A549，H3255，肺鱗癌細胞系H157，肺大細胞癌細胞系H1299，四株細胞系轉染miR-451前體序列(Pre-miR-451)，空載體序列(negativecontrol)設為對照組。將這些細胞株種在96孔板上，2500個細胞/孔。轉染3天后MTT染色法監測細胞增殖情況。MTT法顯示與對照組相比，轉染了Pre-miR-451的A549細胞增殖數明顯減少。H157，H1299，H3255三個細胞系中也觀察到此現象，提示miR-451可以抑制腫瘤細胞的生長。實施例3細胞凋亡實驗(蛋白免疫印跡法測定)1.提取細胞總蛋白2.SDS-PAGE電泳1)清洗、安裝玻璃板，陶瓷片。2)配制灌注分離膠，37°C靜置25min。11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3)配制灌注濃縮膠，室溫靜置20min。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4)加蛋白樣品和分子量marker，每個時期蛋白上樣量均為40yg。5)恒壓電泳(濃縮膠80V，分離膠160V)。3.半干式轉膜1)電泳結束后，戴手套，根據目的蛋白分子量范圍參照分子量marker切膠(切角標記)，切相同大小硝酸纖維素膜(切角標記)一張和濾紙2張。2)轉膜緩沖液中浸泡膠、膜和濾紙lOmin。3)在轉膜儀上從下至上平鋪濾紙，膜，凝膠，濾紙，趕除氣泡，尤其注意膜和凝膠之間禁留氣泡。擦干多余液體，0.8mAX膜面積(cm2)電流轉膜1.5小時。4.免疫印跡1)轉膜結束，檢驗marker是否已轉至膜上(或麗春紅染色)以判定轉膜效果。TBST清洗膜后，5%脫脂奶粉(TBST配制)4°C封閉過夜。2)加一抗CaSpaSe-3/7(激活型)單克隆抗體(1500和1500)，室溫搖動2h。3)TBST漂洗3次，每次lOmin。4)加二抗(1200)，室溫搖動lh。5)TBST漂洗3次，每次lOmin。5.ECL檢測1)AB液混合，待膜不滴水后，平鋪其上。2)反應5min后，根據熒光強度暗室壓片5s30min。3)顯影1530s，水洗，定影13min。4)圖片掃描和定量分析。按如上方法，在NSCLC細胞系A549，H157，H1299，H3255中分別轉染Pre-miR-451和空載體序列，后者設為對照組。轉染72h后將這些細胞株分放于OyMDDP(順鉬，化療藥)和2iiMDDP的培養基中培養，運用ApoONEHomogeneousCaspase3/7Assay測定細胞中caspase3/7活性。caspase3/7活性測定如圖5所示。與對照組相比，轉染Pre-miR-451后，四個細胞系中均出現caSpaSe3/7活性上升，提示miR-451可促進腫瘤細胞的凋亡。盡管單用Pre-miR-451引起的caSpaSe3/7活性增加沒有單用DDP效果明顯，但聯合使用DDP和Pre-miR-451后，caspase3/7活性顯著上升，提示miR-451能夠增加腫瘤細胞對化療藥的敏感性，可作為腫瘤治療的干預靶點。實施例4Transwell(細胞侵襲實驗)1.Transwell小室準備①包被基底膜用50mg/LMatrigel18稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4°C風干。②水化基底膜吸出培養板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養液，37°C，30min。2.制備細胞懸液①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12_24h，進一步去除血清的影響。②消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至1-10X105。3.接種細胞①取細胞懸液100-200u1加入Transwell小室，②24孔板下室一般加入500ill含FBS或趨化因子的培養基，③培養細胞常規培養12_48h(主要依癌細胞侵襲能力而定)。4.結果統計“貼壁”細胞計數這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里。通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞①用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，有結晶紫染色。②細胞計數我們使用的是LeicaDC300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側附著的細胞。“非貼壁”細胞計數由于某些細胞自身的原因或某些膜的關系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。按如上方法將A549細胞系分別轉染Pre-miR-451或空載體序列，后者設為對照，接種到Transwell上室中，選擇接種后24h，48h，72h時間點觀察A549細胞侵襲情況。細胞計數用直接計數法測定Transwell下室中腫瘤細胞的數目。實驗組明顯低于對照組。計數結果如圖6所示。與對照組相比，轉染Pre-miR-451后A549細胞的侵襲能力下降，miR-451可以抑制腫瘤細胞的侵襲，轉移。實施例5活體水平觀察miR-451的抗癌作用皮下瘤實驗1、活體模型我們選取四只5-6周齡大小的雌性裸鼠，將轉染了miR-451和空載體(NC)的A549細胞分別接種到同一只小鼠兩側肋背部的皮下組織中，每側接種細胞數為1*105或5*104個，觀察腫瘤細胞的生長情況。2、腫瘤生長情況評估每天觀察一次，持續至少五周。測量腫瘤灶的長度L和寬度W，按照公式(L*W~2)*0.5計算腫瘤灶的體積來判斷miR-451在活體水平對腫瘤細胞生長的影響。3、測量結果到觀察結束為止，轉染了miR-451前體的一側未見明顯腫瘤灶的形成，而4只小鼠中有3只在觀察的22-27天時，接種NC—側可觸摸到腫瘤灶的形成，觀察結束時，這些腫瘤灶體積為35-145cm2大小。腫瘤體積如圖7所示。4、結果分析從活體實驗結果可以看出，miR-451在小鼠體內可抑制肺癌細胞生長，與我們之前在細胞系水平得到的結果一致，證實了miR-451具有抑癌作用。肺原位癌實驗1、肺癌模型的建立的材料4只Lox-stop-loxK-RasG12D(LSLK-RasG12D)轉基因小鼠由鼠由人類癌癥協會小鼠模型庫(MouseModelsofHumanCancerConsortium,MMHCC)饋贈，HEK293(AmericanTypeCultureCollection,cat#CRL.1573)腺病毒的包裝細胞由第三軍醫大學生物化學與分子生物學教研室饋贈，ADCre,AdPre-miR-451重組腺病毒由Microbix公司提供。Ad腺病毒載體上帶有3半乳糖苷酶操縱子，用以檢測轉染效率。利用Cre重組酶在轉基因小鼠體內誘導K-Ras基因表達，促進肺部腫瘤發生的原理建立肺腺癌的模型°相關文獻⑴Thelet_7microRNAreducestumorgrowthinmousemodelsoflungcancerCellCycle7:6，759-764.2008(2)小鼠肺腺癌動物模型的建立。山西醫科大學學報。1007-6611(2009)05-0408-03。2、建模步驟及miR-451的干預以戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉3周齡小鼠，再以Ad腺病毒CaPi(Ad腺病毒CaPi:滴度為2.5X10，pfu的Ad腺病毒50ul加入到69ul的MEM中，再加入6ul的2.5mol/L的氯化鈣)的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔，共滴入約125ul，分2次滴人，隔5天后重復，共兩次。實驗組AdCre+AdPre-miR-451，n=2，對照組AdCre+AdNC,n=2。3、結果測定鼻腔滴注7周后處死小鼠，取小鼠肺部組織稱重，石蠟包埋，切片，HE染色。實驗組(Cre/Pre-miR-451)較對照組(Cre/NC)相比腫瘤體積顯著縮小，肺腫瘤全肺組織比值如圖8所示。4、結果分析該實驗運用轉基因小鼠LSLK-RasG12D建立肺腺癌模型，再次證明，miR-451可抑制肺腺癌的發生，抑制腫瘤細胞的生長。權利要求miR-451在制備治療非小細胞肺癌藥物的應用。全文摘要本發明屬于基因工程領域，特別涉及miR-451在制備治療非小細胞肺癌藥物的應用；通過對Pre-miR-451的重組體對非小細胞肺癌細胞的增殖、凋亡、遷移、耐藥的影響，說明miR-451對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、耐藥皆有抑制作用，對非小細胞肺癌細胞凋亡具有促進作用，同時活體水平也表明miR-451具有良好抗癌作用。文檔編號A61P11/00GK101804208SQ20101011455公開日2010年8月18日申請日期2010年2月26日優先權日2010年2月26日發明者德偉,楊勁松,潘旋,王朝霞,王銳,袁櫟,邊海波,陳龍邦申請人:南京醫科大學;南京醫科大學第二附屬醫院;中國人民解放軍南京軍區南京總醫院