強心苷化合物在非小細胞肺癌治療中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及強心苷化合物在非小細胞肺癌治療中的應用。具體地，本發明涉及強心苷化合物在在制備用于治療非小細胞肺癌的藥物中的用途，所述非小細胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細胞肺癌。
【專利說明】強心苷化合物在非小細胞肺癌治療中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及強心苷化合物在非小細胞肺癌治療中的應用的【技術領域】。具體地，本發明涉及強心苷化合物在制備用于治療酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細胞肺癌的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]肺癌是肺組織內細胞生長失去控制而導致的一種疾病。在過去的半個多世紀中，肺癌的發病率和死亡率逐年增加，已經從20世紀初的一種罕見疾病發展為當今的全球頭號癌癥殺手。根據世界衛生組織(WHO)定期公布的資料，肺癌的發病率和死亡率在世界各國尤其是發達國家呈明顯的上升趨勢，已經成為許多發達國家最常見的腫瘤，位列男性常見惡性腫瘤第一位和女性常見惡性腫瘤第二位，并且成為惡性腫瘤中最常見的死亡原因。在我國，男性肺癌年齡標準化發病率為47.51/10萬，女性肺癌年齡標準化發病率為22.69/10萬，并且呈逐年增加的趨勢，參見，She J, Yang P, Hong Q,等人Lung cancer inChina: challenges and interventions [J].Chest.2013，143 (4): 1117-1126。預計到 2025年，我國每年僅死于肺癌的人數就將接近100萬，成為世界第一肺癌大國。
[0003]根據肺癌細胞的分化程度和形態特征，臨床上將其分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small lung cancer, NSCLC)兩類，其中非小細胞肺癌占到85%左右。根據預后情況，幾種非小細胞肺癌又可以歸為三類:鱗狀細胞癌、肺腺癌和大細胞肺癌。盡管診斷方法和治療手段都有了很大的進步，70%的NSCLC患者在初次確診時大多已處于III B/ IV期，其中約40%的患者失去手術治療的機會，5年生存率往往低于5%，參見MolinaJ R, Yang P,Cassivi S D,等人 Non-small cell lung cancer: epidemiology, riskfactors, treatment, and survivorship [J].Mayo Clin Proc.2008，83 (5): 584-594。因此，針對該疾病分子起源和疾病發生發展過程的研究，對其預防和治療具有重要意義。
[0004]與其他類型的癌癥相似，NSCLC的發病機制也是十分復雜的。盡管人們投入了大量的人力和財力嘗試從不同角度去解釋NSCLC的發生發展，但是到目前為止，NSCLC和其他腫瘤一樣被認為沒有一個單一的致病機理，它往往是遺傳和環境等多個因素復雜作用的結果。目前對于NSCLC的研究以遺傳層面最為深入。人們對NSCLC的致病機理在分子和細胞層面上進行了大量的研究，逐步闡明了該疾病的分子起源和發生發展過程。總結起來，NSCLC的發生主要是由于一些細胞信號通路的改變，包括細胞生長促進基因的過度激活和細胞生長抑制基因的失活。NSCLC的四種主要致病突變為，EGFR突變、K-RAS突變、p53突變、MET突變。
[0005]在錯過手術治療的機會后,化療成為NSCLC治療的一種傳統方法。然而化療不僅給患者帶來很大的痛苦，更重要的是它并不能從實質上改變大多數NSCLC患者的最終結局。近年來，隨著對NSCLC致病機理研究的深入，人們開始發展以細胞受體、關鍵基因和調控分子為靶點的分子靶向治療。目前，全球有80余種靶向治療的藥物正在研究中，其中以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和腫瘤血管內皮生成因子受體(vascular endothelial growth factor, VEGFR)為作用革巴點的藥物占 60% 以上。
[0006]EGFR是I型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，定位于細胞膜，分為胞外區、跨膜區、胞內區3個部分。胞外區為配體結合區，跨膜區為一個單獨的螺旋，胞內區包括一個酪氨酸激酶區及幾個酪氨酸磷酸化的羧基末端。EGFR與配體結合后，將它們的酪氨酸激酶區域緊密連接，介導羧基端磷酸化位點磷酸化，引發細胞內信號傳導，從而促進細胞的增生、分化、粘附、血管生成和抑制細胞凋亡。目前以EGFR為靶點的藥物分為2類:一類為小分子的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI),其通過競爭性結合酪氨酸激酶區的磷酸化位點來抑制該位點的磷酸化以實現阻斷EGFR信號傳導；另一類為單克隆抗體，通過阻斷胞膜外配體結合區而抑制EGFR活化。TKI類藥物主要有吉非替尼和厄羅替尼。吉非替尼是首個針對EGFR酪氨酸激酶的口服藥物，從2003年開始被FDA批準用于I臨床治療肺癌。它能特異性作用于EGFR酪氨酸激酶，阻斷EGFR信號傳導系統，切斷惡性腫瘤的形成過程中最重要的環節，從而起到抗腫瘤的作用，同時具有非細胞毒性和靶向性，對免疫系統無抑制作用，參見羅湘江，馬濤，尹清云.吉非替尼分子靶向治療晚期肺腺癌23例臨床觀察[J]中國腫瘤臨床.2009(12):672-674。厄羅替尼屬于新型低相對分子質量的李哪唑啉復合化物，可與細胞質內位于酪氨酸激酶結構區的三磷腺苷特異性結合，有效抑制酪氨酸激酶活性及下游信號傳導，從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移，降低腫瘤細胞黏附能力，促進腫瘤細胞凋亡，參見Bareschino M A, Schettino C，Troiani T,等人Erlotinib in cancertreatment [J].Ann Oncol.2007, 18Suppl6:135_i41。厄羅替尼還可誘導細胞周期抑制蛋白P27的表達，使癌細胞阻滯于Gl期，體外實驗觀察到用藥后可誘導癌細胞凋亡的發生。除了 TKI類藥物，目前臨床上以EGFR為靶點的藥物還有西妥昔單抗，它是第I個獲準上市的特異性針對EGFR的IgGl單克隆抗體，能與EGFR的胞外配體結合域結合，從而阻斷下游信號傳導通路。研究證實，將西妥昔單抗聯合含鉬化療方案作為表達EGFR的NSCLC患者的一線治療，有明顯療效。
[0007]此外，VEGFR也是NSCLC分子靶向治療的一個主要作用點。血管的生成在肺癌形成、生長和轉移過程 中發揮著重要作用，而在促進血管生成的多種細胞因子和生長因子中血管內皮生長因子(VEGF)及其受體尤為重要。抑制血管生長因子可拮抗腫瘤血管生長，達到抑制腫瘤的目的。目前以VEGFR為靶點的藥物包括:貝伐單抗和重組人血管內皮抑制素。貝伐單抗是一種重組人源化的抗VEGF抗體，是首個進入臨床的抑制血管生長的藥物。它通過與VEGF結合，阻止和減弱VEGF與血管內皮細胞表面受體結合，從而抑制內皮細胞增殖和新生血管生長，起到抗腫瘤作用。作為VEGFR，貝伐單抗的優勢有:靶點直接暴于血液中，便于藥物直接作用；靶點基因表達穩定，不易產生抗藥性；
[0008]無需考慮腫瘤組織學特性；可抑制腫瘤轉移；有下游放大效應[38]。重組人血管內皮抑制素(recombinant human endostatin, rh-ET)的作用機制是與VEGFR結合阻止VEGF引發的促血管生成活性，特異性地抑制血管內皮細胞生長增殖，從而阻斷肺癌細胞的營養供應。目前，臨床應用較多的內皮抑素抗腫瘤血管生長藥物是恩度。但其成本較高，臨床應用受限。
[0009]如前文所述，EGFR-TKI是用于NSCLC分子靶向治療的一類重要藥物，其中以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)為代表的EGFR-TKI目前被廣泛用于NSCLC的臨床治療，并且取得了非常好的療效。但是在臨床應用中，大部分患者對EGFR-TKI的治療并不敏感，或開始對該類藥物高度敏感但經過約10-14個月的中位無疾病進展生存期(progression free survival, PFS)后最終產生耐藥參見 Paz-Ares L, MoecksJ, Klughammer B.Reply to Watkins and Rukazenkov(J Cell Mol Med2010)，re-Letter ofResponse to manuscript entitled’Clinical outcomes in NSCLC patients with EGFRmutations:pooled analysis’(Paz-Ares 等人.，J Cell Mol Med.2010; 14(1-2):51-69)[J].J Cell Mol Med.2011，15(5):1225.，使該類藥物的臨床應用受到一定限制。因此，關于NSCLC EGFR-TKI耐藥機制的研究對于選擇性個體化治療、克服或逆轉耐藥具有重要意義。目前認為NSCLC對EGFR-TKI的耐藥性可以分為原發性耐藥和獲得性耐藥。
[0010]原發性耐藥是指TKI在治療初期就對腫瘤細胞無明顯作用，應用該藥物治療后病情未得到緩解，臨床治療未取得明顯療效。EGFR基因在不同種群中表現出不同的突變率，在亞洲NSCLC患者中其突變率為20%_30%，而在高加索NSCLC患者中為10%_15%參見SequistL V, Bell D W，Lynch T J, et al.Molecular predictors of response to epidermalgrowth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer[J].J ClinOncol.2007, 25(5): 587-595。研究表明，吉非替尼或厄洛替尼對EGFR突變的NSCLC患者的治療有效率為70%-80%，而對野生型患者的有效率僅10%-20%參見Mitsudomi T, YatabeY.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes asdeterminants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitorssensitivity in lung cancer [J].Cancer Sc1.2007，98 (12): 1817-1824。顯然，NSCLC 患者對EGFR-TKI具有原發性耐藥。研究顯示某些EGFR突變可以引起NSCLC對EGFR-TKI耐藥，如治療前存在EGFR20外顯子插入突變可導致原發性耐藥參見Greulich H, Chen T H, Fengff, et al.0ncogenic transformation by inhibitor-sensitive and—resistant EGFRmutants [J].PLoS Med.2005, 2(11): e313。其機制可能是由于突變形成了空間位阻，使吉非替尼及厄洛替尼無法與TKs區結合，大大地降低了藥物的敏感性。此外，K-Ras突變也可能與這種原發性耐藥有關。BR.21安慰劑對照試驗對K-Ras與EGFR基因型厄洛替尼治療效果的影響進行了評估。結果顯示，K-Ras野生型患者(HR=0.69，P=0.03)可從厄洛替尼治療中獲得統計學意義上的生 存益處，而KRAS突變型(HR=L 67，P=0.31)則沒有，參見Zhu C Q, DaCSG, Ding K, et al.Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinibin National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group Study BR.21[J].JClin Oncol.2008，26(26):4268-4275.。此外，有數據表明 Met 激活與 EGFR-TKI 原發性耐藥有關，與MET原癌基因擴增是相互獨立的。
[0011]EGFR-TKI獲得性耐藥產生的機制主要包括EGFR基因的二次突變和MET基因的擴增。2005年Kobayashi等提出EGFR 二次突變可能是引起EGFR-TKI獲得性耐藥的主要原因，參見 Kobayashi S，Boggon T J, Dayaram T, et al.EGFR mutation and resistance ofnon-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med.2005，352(8):786-792。這一理論目前在國際上已經被廣泛認可。該研究發現，EGFR基因的第二次突變發生在20號外顯子，為T790M突變，即酪氨酸激酶活性結構域上790位的蘇氨酸殘基被甲硫氨酸取代，從而形成空間位阻，增加了 EGFR與ATP之間的親和力，同時減弱了與EGFR-TKI的親和力，致使吉非替尼和厄洛替尼不能有效抑制EGFR。原癌基因MET擴增也是導致EGFR-TKI獲得性耐藥性的一個重要原因。MET是肝細胞生長因子(HGF)/分散因子的一種高親和力的酪氨酸激酶受體，被激活后發生自身磷酸化，引起多種底物蛋白磷化和細胞內一系列信號傳導，激活MAPK-ERKI /2及P13K_Akt等信號通路，促進多種瘤細胞的生長、侵襲和轉移。2007年Engelman等發現MET擴增可以通過ErbB3使PI3K通路持續激活，從而繞過受抑制的EGFR祀點而產生耐藥性，參見Engelman J A, Zejnullahu K, MitsudomiT, et al.MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer byactivating ERBB3signaling[J].Science.2007，316 (5827): 1039-104.。TKI 獲得性耐藥的NSCLC患者中，約30%-40%既無繼發突變，也無MET擴增，這部分患者的耐藥機制正在進一步研究。可能的機制包括=EGFR-TKI誘導NSCLC細胞膜表面EGFR/IGF1R異源二聚體化進而激活膜島素樣生長因子I受體(insulin-like growth factorlreceptor, IGF-1R)及其下游信號通路MAPK和P13K/AKT的轉導，并能刺激mTOR介導的survivin蛋白合成引發抗凋亡效應，從而引起肺癌患者對TKI耐藥，參見Morgillo F，Kim W Y，Kim E S，等人.Implication of the insulin-like growth factor-1R pathway in the resistanceof non-small cell lung cancer cells to treatment with gefitinib[J].Clin CancerRes.2007, 13(9):2795-2803 ;PTEN基因表達喪失可活化PI3K/Akt/mT0R信號通路，導致凋亡抵抗，促進癌癥的發生，進而對EGFR-TKI產生耐藥，參見Sos M L, Koker M, Weir B A，等A.PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer byactivation of Akt and EGFR[J].Cancer Res.2009，69(8):3256-3261。
[0012]NSCLC治療過程中EGFR-TKI的原發與獲得性耐藥問題已經極大地限制了其在該疾病治療中的應用。因此對其耐藥機制的深入研究，尋找克服耐藥的治療方法，已經成為NSCLC研究領域的迫切任務。隨著基礎研究和臨床實驗的不斷深入，EGFR-TKI藥物耐藥機制逐漸清晰，越來越多的針對腫瘤耐藥機制或作用于其它相關信號通路的靶向藥物逐漸進入臨床，并取得一定療效。
[0013]目前，用于克服EGFR-TKI耐藥的策略主要有2種:一是研發第二代TKI，如不可逆的EGFR抑制劑；二是聯合應用或者單用多靶點藥物，同時阻斷多種信號通路。
[0014]EGFR-TKI耐 藥性NSCLC患者的臨床治療應該采取多種治療方案相結合，以求達到最優的治療效果。例如，隨著對EGFR-TKI原發性和獲得性耐藥機制的不斷深入探討，與EGFR-TKI療效有關的分子生物標記及其之間的相互關系已經越來越明了，臨床上可以根據這些分子標記物選擇適合的患者接受TKI治療，進一步提高NSCLC的療效和生存，最大限度地避免無效的治療。
[0015]強心苷是一類從被子植物中提取的有機化合物。早在1500多年前，富含該類化合物的植物就被人們用于墮胎、催吐、利尿、心臟滋補等醫療目的。1775年，英國生理學家William Withering發現毛地黃的提取物可以顯著改善充血性心力衰竭病人的癥狀,并證明該提取物中所含的強心苷如歐夾竹桃苷和地高辛可以提高心臟收縮并控制心房顫抖。從此，強心苷作為一種藥物正式用于現代醫療。
[0016]實際上，強心苷的抗腫瘤作用在體內也得到證實。早在十幾年前，Inada就首先在DMBA與TPA誘導的小鼠皮膚瘤和4NQ0與甘油誘導的小鼠肺癌中證明，洋地黃毒苷可以抑制月中瘤的形成，參見 Inada A, Nakanishi T, Konoshima T, et al.Ant1-tumor promotingactivities of natural products.11.1nhibitory effects of digitoxin on two-stagecarcinogenesis of mouse skin tumors and mouse pulmonary tumors[J].Biol PharmBull.1993，16(9):930_931。與此同時，在Afaq等人關于夾竹桃苷對皮膚瘤抑制作用的研究中，夾竹桃苷在TPA誘導前半小時使用可以時間依賴型地抑制腫瘤的生成，參見Prassas
I,Diamandis E P.Novel therapeutic applications of cardiac glycosides[J].Nat RevDrug Discov.2008，7(11):926_935。Svensson 證明地高辛是 SH-SY5Y 和 Neuro_2a 細胞系小鼠移植瘤的特異抑制劑。Han等人研究了蟾毒靈在人肝癌細胞裸鼠移植瘤上的作用，發現無毒性濃度的蟾毒靈可以誘導移植腫瘤細胞的凋亡。這些體內研究不斷增強著我們將強心苷用于癌癥治療的信心。令人鼓舞的是，基于強心苷的抗癌藥物也已經開始臨床試驗。
[0017]本實驗室采取藥物篩選的策略，對一個所含藥物大部分已獲FDA批準的藥物文庫進行篩選，希望得到可以提高NSCLC吉非替尼敏感性的藥物。這不僅避免了現有聯合應用多靶點藥物的偏向性，更重要的是，由于篩選出的藥物在安全性、毒理和作用機制方面都比較清楚，將可以大大減少研發投入和研發時間。經過前期篩選，初步確定強心苷藥物吉妥辛可以提高NSCLC耐藥性細胞系H1975的吉非替尼敏感性。
[0018]本研究首先對前期的篩選結果在多個耐藥性NSCLC細胞系中進行了驗證。同時，考慮到強心苷藥物在腫瘤抑制方面的作用，本研究還評價了強心苷中的其他化合物對NSCLC細胞吉非替尼敏感性的影響。結果顯示，強心苷中的吉妥辛(Gitoxin)和洋地黃毒苷(Digitoxin)可以顯著提高NSCLC的吉非替尼敏感性。同時，我們對吉妥辛/洋地黃毒苷與吉非替尼在H1975和H1650中的藥物相互作用進行了評價，發現這兩種藥物都可以和吉非替尼協同性地抑制耐藥性NSCLC細胞的生長，并促進其凋亡。此外，我們對其分子機制進行了初步研究，發現吉妥辛/洋地黃毒苷與吉非替尼對NSCLC的協同性抑制可能是通過協同性抑制Erk信號通路實現的。
[0019]最后，在研究中，我們發現相同濃度強心苷藥物吉妥辛可以比吉非替尼更有效地抑制NSCLC耐藥細胞的生長并促進其凋亡。而且，小鼠移植瘤實驗顯示，吉妥辛可以有效抑制小鼠移植瘤的生長。由于強心苷是目前臨床上用于治療心臟病的藥物，而且其抑癌作用的濃度在治療心臟病生 理濃度范圍內，因此，該藥物很有可能作為治療耐藥性NSCLC的替代藥物。

【發明內容】

[0020]本發明提供了一種強心苷化合物在制備用于治療非小細胞肺癌的藥物中的用途。
[0021]具體地，根據本發明的非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、肺腺癌和大細胞肺癌。進一
[0022]步地，本發明提供了強心苷化合物在制備用于治療酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小
[0023]細胞肺癌。
[0024]具體地，根據本發明的酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
[0025]更具體地，根據本發明的用途中所述的強心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
[0026]進一步地，本發明提供了強心苷化合物聯合酪氨酸激酶抑制劑在制備用于治療非小細胞肺癌的藥物中的用途。
[0027]具體地，根據本發明的用途，其中所述非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、肺腺癌和大細胞肺癌。[0028]具體地，根據本發明的用途，其中所述非小細胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細胞肺癌。
[0029]更具體地，根據本發明的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
[0030]更具體地，根據本發明的用途，其中所述的強心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
[0031]進一步地，本發明提供了治療酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細胞肺癌的治療方法，其中包括向有需要的受試者施用治療有效量的強心苷化合物和酪氨酸激酶抑制劑。
[0032]具體地，根據本發明的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼；所述強心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1 A至圖1D:吉妥辛對H1975、H1650、PC9/G和A549細胞吉非替尼敏感性的影響。圖1A、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的H1975生存曲線；圖1Β、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1650生存曲線；圖1C、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的PC9/G生存曲線；圖1D、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的Α549生存曲線。
[0034]圖2Α至圖2D:其他幾種強心苷藥物對Η1975細胞吉非替尼敏感性的影響。圖2Α、用吉非替尼、洋地黃毒苷和洋地黃毒苷+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1975的生存曲線；圖2Β、用吉非替尼、地高辛和地高辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1975的生存曲線；圖2C、用吉非替尼、哇巴因和哇巴因+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1975的生存曲線；圖2D、用吉非替尼，前海蔥苷原A和前海蔥苷原A處理48小時的Η1975的生存曲線。
[0035]圖3Α至圖3D:吉妥辛和吉非替尼在Η1975和Η1650細胞中的相互作用方式。圖3Α、用吉非替尼、吉妥辛和吉非替尼+吉妥辛以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖3Β、基于A的Cl值；圖3C、用吉非替尼、吉妥辛和吉非替尼+吉妥辛以如所示濃度處理48小時的Η1650的生存曲線；圖3D、基于C的Cl值。
[0036]圖4Α至圖4D:、洋地黃毒苷和吉非替尼在Η1975和Η1650細胞中的相互作用方式。圖4Α、用吉非替尼、洋地黃毒苷和吉非替尼+洋地黃毒苷以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖4Β、基于A的Cl值；圖4C、用吉非替尼，洋地黃毒苷和吉非替尼+洋地黃毒苷以如所示濃度處理48小時的Η1650的生存曲線；圖4D、基于C的Cl值。
[0037]圖5Α至圖5F:其他幾種強心苷與吉非替尼在Η1975細胞中的相互作用方式。圖5Α、用吉非替尼，地高辛和吉非替尼+地高辛以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖5Β、基于A的Cl值；圖5C、用吉非替尼，哇巴因和吉非替尼+哇巴因以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖5D、基于C的Cl值；Ε、用吉非替尼、前海蔥苷原A和吉非替尼+前海蔥苷原A以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖5F、基于E的Cl值。
[0038]圖6Α至圖6D:吉妥辛和吉非替尼聯合使用對Η1975和Η1650細胞凋亡的影響。圖6Α、用DMS0，9 μ M吉非替尼，300ηΜ吉妥辛和9 μ M吉非替尼+300ηΜ吉妥辛處理后由流式細胞儀分析Η1975的凋亡；圖6Β、基于A計算的凋亡比率；圖6C、用DMS0，4 μ M吉非替尼，I μ M吉妥辛和4μ M吉非替尼+1 μ M吉妥辛處理后由流式細胞儀分析Η1650的凋亡；圖6D、基于C計算的凋亡比率。*P〈0.01，與吉非替尼或吉妥辛組比較。
[0039]圖7A至圖7D:洋地黃毒苷和吉非替尼聯合使用對H1975和H1650細胞凋亡的影響。圖7A、用DMS0，9 μ M吉非替尼，40ηΜ洋地黃毒苷和9 μ M吉非替尼+40ηΜ洋地黃毒苷處理后由流式細胞儀分析Η1975的凋亡；圖7Β、基于A計算的凋亡比率；圖7C、用DMS0，4 μ M吉非替尼，30ηΜ洋地黃毒苷和4μΜ吉非替尼+30ηΜ洋地黃毒苷處理后由流式細胞儀分析Η1650的凋亡；圖7D、基于C計算的凋亡比率。*Ρ〈0.01，與吉非替尼或洋地黃毒苷組比較，**Ρ<0.05,與吉非替尼或洋地黃毒苷組比較。
[0040]圖8Α至圖8D:吉妥辛、洋地黃毒苷和吉非替尼聯合使用對Η1975和Η1650細胞中PARP表達量的影響。圖8Α、在用DMS0，9 μ M吉非替尼，300ηΜ吉妥辛和9 μ M吉非替尼+300ηΜ吉妥辛處理后使用蛋白印記雜交測量Η1975中的PARP ;圖8Β、在用DMS0，4 μ M吉非替尼，I μ M吉妥辛和4 μ M吉非替尼+1 μ M吉妥辛處理后使用蛋白印記雜交測量Η1650中的PARP ；圖8C、在用DMS0，9 μ M吉非替尼，40ηΜ洋地黃毒苷和9 μ M吉非替尼+40ηΜ洋地黃毒苷處理后使用蛋白印記雜交測量Η1975中的PARP ；圖8D、在用DMS0，4μΜ吉非替尼，30ηΜ洋地黃毒苷和4μ M吉非替尼+30ηΜ洋地黃毒苷處理后使用蛋白印記雜交測量Η1650中的PARP。
[0041]圖9Α至圖9C:吉非替尼和吉妥辛/洋地黃毒苷/地高辛聯合用藥對Η1975和Η1650細胞信號通路的影響。圖9Α、用如所示的2.25 μ M吉非替尼和75ηΜ吉妥辛處理Η1975細胞12小時；圖9Β、用如所示的I μΜ吉非替尼和250ηΜ吉妥辛處理Η1650細胞12小時；圖9C.用如所示的2.25 μ M吉非替尼，IOnM洋地黃毒苷和IOnM地高辛處理Η1975細胞12小時。通過蛋白印記雜交檢測信號分子。
[0042]圖1OA至圖1OF:Erk信號通路與耐藥性。用如所示濃度的吉非替尼處理。圖10A、HCC827;圖10B、PC9;圖10C、H1975;圖10D、H1650細胞后，通過蛋白印記雜交檢測Erk。如所示處理圖10E、H1975;圖10F、H1650細胞并通過MST分析測量生存率。
[0043]圖1lA至圖1lB:聯合用藥對腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞的影響。圖11A、用所示濃度DMS0、吉非替尼、地高辛和吉非替尼+地高辛處理48小時的癌干細胞和非癌干細胞的生存率。圖11B、側群細胞的百分比。
[0044]圖12A至圖12B、洋地黃毒苷與吉非替尼聯合用藥對小鼠移植瘤生長的影響。圖12A、記錄4周的腫瘤體積。n=7, *P〈0.05,與吉非替尼或洋地黃毒苷組比較。圖12B、如所示各組中腫瘤的照片。
[0045]圖13A至圖13 C:H1975對吉非替尼和吉妥辛的敏感性。圖13A、用吉非替尼和吉妥辛處理48小時的H1975的生存曲線；圖138、用相同濃度的DMSO，300nM吉非替尼和300nM吉妥辛處理后通過流式細胞儀分析H1975的凋亡；圖13C:計算凋亡，*P〈0.01，與吉非替尼組比較。
[0046]圖14 A至圖14 B:吉妥辛對腫瘤生長的影響。圖14A、PBS或吉妥辛處理的腫瘤生長曲線；圖14B、在終止點的小鼠圖片，*P〈0.05，與對照比較。
[0047]圖15 A至圖15B:吉妥辛對H1975細胞中Erkl/2磷酸化的影響。圖15A、用不同濃度的吉妥辛處理的H1975的Erkl/2磷酸化模式；圖15B、在用吉妥辛處理的不同時間點的H1975的Erkl/2磷酸化模式。【具體實施方式】
[0048]材料與方法
[0049]一、實驗材料
[0050]1.細胞
[0051]NC1-H1975 (人非小細胞肺腺癌細胞，EGFR exon20T790M-L858R),NC1-H1650 (人肺支氣管癌細胞，EGFR exonl9Del E746-A750)、HCC827(人非小細胞肺癌細胞，EGFRexonl9DelE746-A750);購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。
[0052]PC9 (人非小細胞肺癌細胞)，由上海市瑞金醫院贈送。
[0053]2.實驗動物
[0054]BALB/c Nude型免疫缺陷小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為:SCXK (京)2012-0001。
[0055]3.主要試劑
[0056](I)細胞培養用試劑
[0057]改良型RPM1-1MO 培養基(SH3O8O9.18, Hyclone)；
[0058]DMEM-高糖培養基(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；
[0059]胰酶消化液(0.05%和0.25%，中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；
[0060]磷酸緩沖液PBS (SH30256.01，Hyclone)；
[0061]胎牛血清FBS (10099-141，gibico)
[0062]青-鏈霉素(SH40003_12，Hyclone)
[0063]動物細胞冷凍保存液(CSM-100，大連普肽生物科技有限公司)
[0064](2)試劑盒
[0065]Alexa Fluor488Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(Vl3245, Invitrogen)；
[0066]BCA 蛋白質定量試劑盒(PAl 15-01，TianGen)
[0067](3)抗體
[0068]本研究所用抗體均來自Cell Signaling Tech公司。
[0069]4.軟件及統計學分析
[0070]細胞凋亡分析軟件CFlow Plus ；圖標制作軟件Excel ;用SPSS16.0軟件對結果進行統計學分析，多個獨立樣本均數比較采用單因素方差分析。
[0071]二、實驗方法
[0072]1.細胞培養
[0073]遵循本領域技術人員熟知的方法進行細胞培養、復蘇、傳代、凍存以及計數。
[0074]2.MTS法檢測細胞生存率
[0075]原理:MTS/PMS法是一種用比色法來檢測細胞增殖和細胞毒實驗中的活細胞數量的檢測試劑。MTS是一種新型四唑化合物，PMS是一種電子偶聯劑。PMS具有增強的化學穩定性，這使它可與MTS混合形成穩定的溶液。MTS (Owen’ s reagent)被細胞生物還原成為一種有色的甲臜產物，可直接溶解于培養基中。這種轉化很可能是在代謝活躍的細胞中的脫氫酶產生的NADPH或NADH的作用下完成的。在490nm處檢測到的甲臜產物的量與培養中的活細胞數成正比。MTS與MTT法相比，操作步驟更少，無需揮發性溶劑來溶解結晶沉淀甲臜產物。[0076]實驗步驟:
[0077](I)接種細胞:用含10%胎牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔5000-7000個細胞接種到96孔板，每孔體積150ul ；
[0078](2)培養細胞:培養24h，待細胞貼壁后更換為含1%胎牛血清的培養基饑餓培養，24h后換為含不同濃度的藥物的RPM1-1640培養基進行處理，每孔100 μ 1，每個濃度4個重復。繼續培養48h;
[0079](3)MTS/PMS溶液的配制:分別融化MTS和PMS，37°C水浴10分鐘。按7ml培養基:1336.4 μ I MTS:63.6 μ I PMS 比例配制；
[0080](4)呈色:棄去培養基，每孔加MTS/PMS溶液120ul，繼續孵育1.5_2h。
[0081](5)用酶標儀檢測490nm波長下的吸光度A，并根據吸光度A計算細胞的生存率。計算公式如下:細胞生存率=(實驗組A/對照組A) X 100%。
[0082]3.Annexin V/PI細胞凋亡檢測法
[0083]原理:在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此，Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。在細胞發生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發生早于細胞核的變化。因為細胞壞死時也會發生磷脂酰絲氨酸外翻，所以Annexin V常與鑒定細胞死活的核酸染料(如PI)合并使用，來區分凋亡細胞與死亡細胞。
[0084]實驗步驟:
[0085](I)細胞按實驗要求接種于12孔板，每孔約1X105個細胞。24h后換為含1%胎牛血清的RPM1-1640培養基對細胞進行饑餓培養24h。
[0086](2)設置相應對照:正常對照，什么染料也不加；凋亡細胞(處理組)，只染AnnexinV ;死亡細胞，可用高濃度的吉非替尼處理正常細胞，只用PI染色；另外有處理對照和各處理組，用Annexin V和PI同時染色。細胞按實驗要求，用不同藥物處理。對不同時間點實驗，在不同時間加藥，同時收集細胞。
[0087](3)吸出培養液，由于有死亡的細胞已經懸起，培養液不能扔掉，一并轉入離心管中(如吸出培養液體積較大，可用離心管保存。離心后同胰酶消化的細胞合并)。
[0088](4)每孔加入200 μ L0.05%胰酶消化，鏡下觀察，當細胞突起開始收縮、細胞開始變圓時，吸出胰酶。
[0089](5)加新完全培養液終止消化，吹打下細胞，轉入離心管，200g離心5min收集細胞，PBS洗兩次，重懸細胞于IOOul的結合緩沖液中。
[0090](6)加入5μ I的Annexin V和I μ I的PI輕輕混勻，避光染色15min。用400目細胞篩過濾后上機檢測。使用Accurie軟件對結果進行分析，得到細胞的凋亡率。
[0091]4.細胞總蛋白提取
[0092](I)用PBS將要收集的細胞洗一遍，加入含有cocktail的RIPA蛋白裂解液，放在冰上，用細胞刮將培養板上的細胞迅速刮下，轉移至1.5ml離心管。
[0093](2)在混勻器上于4°C旋轉混勻45min,4°C, 12000rpm離心IOmin,將上清轉移至新的離心管保存于_80°C冰箱。[0094](3)蛋白總濃度測定(BCA蛋白質定量試劑盒法):
[0095]I)配制BCA工作液:依據樣品數量，將試劑A和試劑B按體積比50:1配制BCA工作液，并充分混勻。
[0096]2)分別取25μ1表格中新鮮配置的BSA標準液和待測樣品，加入到96孔板中；每孔中加入200 μ I BCA工作液，并充分混勻；加蓋，37°C孵育30min后冷卻至室溫或室溫放置2h ;用酶標儀于562nm波長處檢測其吸光度；根據標準曲線計算出樣品中的蛋白含量。
[0097]5.蛋白印記雜交(Western blot)
[0098](I) SDS-PAGE:
[0099]I)根據本領域技術人員熟知的方法制備分離凝膠；
[0100]2)灌濃縮膠前要將分離膠上的ddH20倒掉，濃縮膠凝膠速度更快，加入TEMED后要快速混勻后灌膠，再插入適當的梳子，一般用0.75mm厚度。
[0101]3)樣品加入適量的4X loading buffer,沸水浴10分鐘,短暫離心上樣。
[0102]4) 70-90V電泳，大約需要2.5小時。
[0103](2 )蛋白印記雜交檢測:
[0104]I)將合適大小的PVDF膜首先置于甲醇中浸潤5min,然后在IXTransfer Buffer中平衡(即用鑷子夾住膜在Transfer Buffer中反復涮洗30s)后方可應用，如果使用尼龍膜，貝1J直接在I XTransfer Buffer中平衡后即可使用。取下電泳后的膠置于I X TransferBuffer中平衡。
[0105]2)安裝轉膜設備:將轉膜用的塑料夾子的黑色面向下打開后平放于桌上，首先放置一片在I X Transfer Buffer中浸潤過的海面墊,然后放置2層浸潤過的3M濾紙,之后將平衡過的PAGE膠平鋪于濾紙上，再在其上放置平衡過的PVDF膜并用一玻璃試管趕壓所有氣泡，接著再向其上放置2層浸潤過的3M濾紙和另一片在IXTransfer Buffer中浸潤過的海面墊，最后合上塑料夾子并放置于裝滿轉膜液的轉膜槽中(注意電極方向)。
[0106]3)電轉移:對于轉印120KD以下的蛋白質，通常按如下參數設置，I安培恒定電流需要 Ih ；500mA2h ；250mA4h ;或 150mA 過夜。
[0107]4)抗原抗體反應:
[0108]Blocking (封閉):將轉印好的膜卸下(觀察有色Marker是否完全從膠上轉移到膜上)，標記好正面(即蛋白面)，置于Blocking Buffer中室溫搖晃孵育Ih,或37°C 30min,或4°C過夜。
[0109]一抗孵育:將特定的抗體稀釋于Primary Antibody Dillution Buffer中，通常的稀釋比例為1:1000。將膜從Blocking Buffer中取出，稍稍空干一下液體后直接放于稀釋的一抗溶液中，室溫搖晃孵育lh，或37°C 30min，或4°C過夜(對于一些信號較弱的抗體采用4°C過夜效果較好)。
[0110]二抗孵育:將膜取出浙干液體后放于IXTBS中搖晃孵育30min(每隔約5min更換一次液體)。將洗過的膜置于稀釋后的二抗中(通常1:1000倍稀釋)室溫搖晃孵育lh。
[0111]洗膜:將膜從二抗稀釋液中取出，浙干液體后放于IXTBS中搖晃孵育30min(每隔約5min更換一次液體)。
[0112]5)顯色反應(辣根過氧化物酶化學發光法):各取等體積ECL試劑A液、B液混合(按每平方厘米轉印膜0.125mL ECL混合液計算)。將轉印膜輕輕接觸3MM濾紙吸干液體。將膜放入事先混勻的ECL混合液中反應lmin，提起轉印膜，輕輕在3MM濾紙上吸干液體。在Image Quant LAS4000mini突光成像儀上成像。
[0113]6.測定細胞內pH值
[0114]原理:BCECF AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。BCECF AM沒有熒光，進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成BCECF，從而被滯留在細胞內。BCECF在適當的pH值情況下可以被激發形成綠色熒光。最大激發波長和發射波長因PH的不同而有所不同，最大激發波長大致在503nm左右，最大發射波長大致在520nm左右,實際檢測時推薦使用的激發波長為488nm,發射波長為535nm。
[0115]實驗步驟:
[0116](I)接種細胞到12孔板并按實驗要求進行相應處理，收集細胞時，每孔加入200 μ L0.05%胰酶消化，鏡下觀察，當細胞突起開始收縮、細胞開始變圓時，吸出胰酶，完全培養基終止消化并制成細胞懸液。
[0117](2)用HBSS稀釋BCECF AM至5μΜ，取100μ重懸細胞，在室溫避光孵育60min。
[0118](3)用PBS洗細胞兩次，在C6流式細胞儀上檢測熒光強度。
[0119]7.腫瘤干細胞分選
[0120]原理:H0eChst33342是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。當用這種染料給細胞染色時，正常細胞會大量攝取。但是在腫瘤干細胞中存在一種ATP結合轉運體，它可以將腫瘤干細胞攝取的染料重新排出細胞外。因此，一個細胞系中的腫瘤干細胞在染色后往往呈現較低的熒光信號。根據這個原理，我們可以用流式細胞儀將腫瘤干細胞分選出來。同時，在染色時，還需要加入 PI以排除凋亡的細胞。維拉帕米可以特異性地抑制ATP結合轉運體，通常用做對照。
[0121]實驗步驟:
[0122](I) Hoechst33342 的配制
[0123]儲存液:將25mg Hoechst33342粉末，加入25ml蒸餾水，制成lmg/ml的儲存液，零下20度保存。工作液:取Iml儲存液加入9ml蒸餾水，配制成0.lmg/ml的工作液，過濾除菌，4度避光保存.[0124](2) PI 的配制
[0125]儲存液:將IOmgPI粉末加入IOml蒸餾水，制成lmg/ml儲存液，零下20度避光保存。工作液:取Iml儲存液，加入49mlPBS，制成20 μ g/ml工作液，過濾除菌，4度避光
保存，最多可使用8周
[0126](3)分選分成三組，分別為藥物組、對照組和維拉帕米組，三組細胞用PBS洗2次，胰酶消化細胞，加入完全培養基，1000r/分鐘離心10分鐘。然后將其重懸于含2%的胎牛血清1640中，調整細胞濃度成IX 106個/ml，對照組和藥物組加入Hoechst33342，調整濃度至5 μ g/mL,維拉帕米組同時加入維拉帕米100 μ g/mL,避光37度水浴內孵育70分鐘，在期間每15到20分鐘震蕩一次，最后加入2mL冰磷酸緩沖液(PBS)終止反應，1500r/min離心IOmin后棄上清，再用含2%的胎牛血清的PBS洗I次，用2%的胎牛血清的PBS重懸，PI加入至終濃度I μ g/mL的，在進行流式細胞分選、鑒定前細胞4度避光保存。
[0127](4)流式細胞儀檢測分選，350nm(375)波長紫外光激發Hoechst染色，于450/20nm帶通下收集測定藍光，675nm帶通下收集測定紅光。選取線性信號，做Hoechst Red(X軸)和Hoechst Blue (Y軸)二維散點圖,將Hoechst Red及Hoechst Blue弱信號且維拉帕米對照組缺失的區域設定為SP細胞的門，計算百分比。檢測分選參數如下:1)激光器:大功率、488nm紫外激光；2)光電倍增管(PMT)光譜檢測范圍:300——llOOnm、電壓:150 —990V ；3)檢測靈敏度:小于200MESF、CV小于1.5% (2 μ m Beads) CV小于3% ；4)樣本獲取速度:25000個/秒(細胞)；5)分選速度:5000個/秒或以上；6)分選純度:99%7)分選模式:二路米集
[0128]8.動物實驗
[0129](I)動物飼養條件
[0130]所有實驗用小鼠均在SPF級動物房飼養，每5只一籠。室內溫度控制在19_24°C，濕度50%-60%，12小時明暗交替。小鼠飼料、墊料均經高溫消毒處理，飲水經高溫高壓滅菌處理。飼養過程中，密切觀察小鼠生長情況，墊料每周換一次，飼料和飲水每日補充。
[0131](2)小鼠灌胃
[0132]準備灌胃針頭，本研究采用特制8號小鼠灌胃針頭；抓住小鼠，使其頭、頸和身體呈一直線。左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部即可。若小鼠始終在活動中，可放開重新抓，避免強行操作損害小鼠；用Iml的注射器配灌胃針頭。灌胃針頭從小鼠的嘴角進入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內推進，進入食管后會有一個刺空感，待針頭全部沒入后，輕推注射器給藥液；灌胃容積一般是0.1~0.2ml/10g，最大0.35ml/10g,每只小鼠的灌胃最大容積不超過0.8ml。
[0133](3)小鼠移植瘤模型的建立
[0134]SPF級4周BALB/c裸鼠購自維通利華公司，合格證號:SCXK (京)2012_0001，飼養于中國醫學科院基礎醫學研究實驗動物中心。I周后，待小鼠適應環境后開始相關實驗。首先，對每只小鼠右側皮 f 下注射0.2ml含有8X IO6個H1975細胞的RPM1-1640懸液。10天后，當移植的腫瘤長到50~70mm3時，將小鼠隨機分為四組，每組5只。腫瘤體積V的計算公式為V=0.52XLXW2 (長和寬)。將藥物溶于含有0.05%羧甲基纖維素鈉的PBS中，以相應劑量對實驗組小鼠口服灌胃給藥，對照組小鼠口服溶劑，腫瘤體積每四天測量I次。服藥三周后，根據記錄的測量數據制作腫瘤生長曲線。
[0135]實驗結果
[0136]一、強心苷與吉非替尼聯合用藥對耐藥性NSCLC細胞的抑制應用
[0137]1、吉妥辛及其他強心苷對耐藥性NSCLC細胞系吉非替尼敏感性的影響
[0138]首先，對本實驗室前期的藥物篩選結果進行驗證。選取與藥物篩選相一致的細胞系H1975，分別以不同濃度吉非替尼、不同濃度吉妥辛和不同濃度吉妥辛+IyM吉非替尼處理48h，用MTS法檢測細胞的生存率，并做出細胞生存曲線。結果顯示，吉妥辛可以在多個濃度點提高H1975細胞對IyM吉非替尼的敏感性(圖1-Α)。同時，我們在其他幾種耐藥性NSCLC細胞系H1650、PC9/G和A549中對這一結論進行了驗證。結果顯示，吉妥辛可以在多個濃度點提高H1650細胞對I μ M吉非替尼的敏感性(圖1Β)，但是不能改變PC9/G和Α549細胞對I μΜ吉非替尼的敏感性(圖1C-1D)。
[0139]強心苷藥物包括一大類結構和化學性質相似的化合物，其中多種已是目前的臨床用藥。考慮到近年來越來越多的關于強心苷抗癌作用的報道，我們也評價了該類藥物中其他幾種化合物對Η1975吉非替尼敏感性的影響。結果顯示洋地黃毒苷可以在多個濃度點提高H1975細胞對I μ M吉非替尼的敏感性(圖2Α)。而該類藥物中的其他幾種如地高辛、哇巴因和前海蔥苷原A并不改變Η1975細胞對I μ M吉非替尼的敏感性(圖2B-2D)。
[0140]2、強心苷藥物與吉非替尼在耐藥性NSCLC細胞中的相互作用
[0141]上結果表明吉妥辛和洋地黃毒苷可以提高耐藥性細胞系Η1975和Η1650的吉非替尼敏感性。為了了解這兩種強心苷與吉非替尼的相互作用，我們采用了目前藥物研究領域廣泛用于評價藥物相互作用的Chou-Talalay模型。根據該模型，我們首先確定了各種藥物在Η1975和Η1650中的半數抑制濃度IC5tl (表1)。其次，根據固定的IC5tl比設計下列三組濃度，吉妥辛組:1C50/16、IC50/8、IC50/4、IC50/2、IC50,2X IC50,4X IC50,8X IC50,16X IC50 ;吉非替尼組:1C50/16、IC50/8、IC50/4、IC50/2、IC5(1、2X IC5(1、4X IC5(1、8X IC5(1、16X IC50 ;聯合用藥組:各個濃度兩種藥物對應聯合。
[0142]表1各藥物在H1975和H1650中的IC5tl
【權利要求】
1.強心苷化合物在制備用于治療非小細胞肺癌的藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、肺腺癌和大細胞肺癌。
3.根據權利要求1所述的用途，其中所述非小細胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細胞肺癌。
4.根據權利要求3所述的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
5.根據權利要求1至4任一項所述的用途，其中所述的強心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
6.強心苷化合物聯合酪氨酸激酶抑制劑在制備用于治療非小細胞肺癌的藥物中的用途。
7.根據權利要求6所述的用途，其中所述非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、肺腺癌和大細胞肺癌。
8.根據權利要求6所述的用途，其中所述非小細胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細胞肺癌。
9.根據權利要求8所述的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
10.根據權利要求6至9任一項所述的用途，其中所述的強心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
【文檔編號】A61K31/7048GK103536925SQ201310516219
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】鄭直, 王超, 薛毅博 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所