專利名稱：甲苯酚三聚體類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及苯酚三聚體類化合物以及用擴張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006，保藏編號是CCTCC M 2010022)制備甲苯酚三聚體類化合物的方法；本 發明還涉及該類化合物在制備細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
關于甲苯酚三聚體類化合物的研究尚未見報道，有研究者在2007年報道了新穎 的甲苯酚二聚體，他們是從昆蟲致病性真菌Cordyc印s sp. BCC 1861分到該類化合物，顯 示了 良好的細胞毒禾口抗病毒活性(Rukachaisirikul, V ；Kaeobamrung, J ；Panwiriyarat, ff；Saitai, P ；Sukpondma, Y ；Phongpaichit, S ；Sakayaroj, J. New Diphenyl Ethers from the Insect Pathogenic Fungus Cordyceps sp.BCC 1861.Chem. Pharm. Bull. 2007,55(2) 304-307)。而關于甲苯酚三聚體及其生物活性未見任何報道。本發明人研究發現擴張青霉 菌 091006 (Penicillium expansum 091006，保藏編號是CCTCC M 2010022)的液體發酵產 物經超聲破碎后的粗提物有很好的細胞周期抑制活性，遂對其活性成分進行了研究，結果 發現了 6個新的甲苯酚三聚體類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見任何對這6個化合物 的化學結構及細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關的藥物。

發明內容
本發明旨在提供一種結構獨特的具有細胞增值抑制以及直接殺傷癌細胞等抗腫 瘤活性的新化合物。本發明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細 胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。本發明首次從發酵物中發現了結構新穎的甲苯酚三聚體類化合物，如式I、式II、 式III所示 其結構特征是式I、式II、式III化合物的基本骨架為甲苯酚三聚體，其中隊為 氫、烴基、酰基，r2、R3為氫、烴基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。優選的本發明化合物是所述的式I化合物1 4及式II化合物5、6的Ri、R2均為 氫，R3分別為
上述發明中最優選的化合物是由紅樹植物(海漆)共生真菌一擴張青霉 091006 (Penicillium expansum091006)的液體發酵物經硅膠柱層析，以石油醚、石油 醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫。氯仿-甲醇98 2的洗脫物，再經S印hadex LH-20(氯仿-甲醇1 1)，再經制備HPLC，以甲醇-水85 15洗脫分別得到化合物1 6。本發明采用MTT法測試了式I、式II化合物對HL-60、和A549細胞株的抗腫瘤活 性。實驗證實，式I、式II化合物對HL-60腫瘤細胞有較好的增殖抑制作用，對A549也有一 定增殖抑制作用。因此本發明的式I、式II、式III化合物可用作細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷 劑。式I、式II、式III化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗 腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。式I、式II、式III化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用于生命科學 研究，作為探針應用時，式I、式II、式III化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二 甲基亞砜的含水溶液中加以應用。本發明的式I、式II、式III化合物可通過微生物發酵培養，然后從發酵物中分離 純化而得到；也可由上述優選化合物經本領域技術人員熟知的化學修飾方法合成獲得。需要特別說明的是，經發酵微生物制取本發明式I、式II、式III化合物的方法 可采用其它任何能生產該類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可作為 生產菌用于制備式I、式II、式III化合物。本發明的實施例中列舉了利用擴張青霉菌 (Penicillium expansum)091006制備本發明式I、式II、式III的優選化合物的實例，但本 發明制備的新化合物不只局限于本實施例中該化合物的制備方法和應用實例。該擴張青霉菌(Penicillium expansum)091006系從海南文昌頭苑紅樹植物海漆 的根部分離得到的一株共生真菌，并經分類學研究鑒定為擴張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)。該菌株已于2010年01月21日保藏在中國典型培養物保藏中心(保 藏編號:CCTCC M 2010022)。該擴張青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下形態學特征菌落 平坦鋪展，粉狀，略顯絮狀，有時集成殼狀，中間稍突起，12-14天直徑3-4厘米，暗粉色， 漸轉為暗黃綠色，反面淡黃色轉為深褐色；分生孢子梗100-120X500-750微米，壁光滑， 單生，間或有成束的；掃狀枝長而排列不松散，一般在下部分枝1-2次；間枝3-6個，一般 10-15 X 2-3為微米，梗基3-5微米，小梗5-7，3-6微米，一般不做披針形；分生孢子橢圓形， 3-5微米，孢子結成鏈珠狀，長而糾結。該擴張青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下生理生化特征菌株 可以同化葡(萄)糖胺、D-樹膠醛醣、樹膠醛醣、楊梅苷、赤藻糖醇、葡(萄)糖酸、葡萄糖 磷酸鹽、葡(萄)糖醛酸、丙三醇、葡(萄)糖酸、L-鼠李糖、核糖、柳醇、D-戊醛糖、氨基-丁酸、羥基丁酸、羥基丁酸、對羥苯基乙酸、金雞納酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、 L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天(門)冬氨酸、L-谷氨酸、L-鳥氨酸、 L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、2-氨基乙醇。該擴張青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下分子生物學特征其 18S rRNA基因序列信息為(基因的GenBank號為DQ401105)CTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCAGACCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAATGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGGGTCATCATAGAATCCCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTATCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGATTCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCGTTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCTGAAGTCGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCCTTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTAAT(KBr)vmax :3300、2960、2850、1600、1580、1508、1460、1380、1285、1100、1015、985、 840cm—1 ；1H及13C NMR數據分別見表1和表2。化合物4，無色油狀物，HRESIMS :m/z 469. 2357 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm(log e ) 272(4. 15)nm ；IR(KBr) vmax :3300、2958、2850、1590、1500、1445、1385、255、1165、1072、980、 845CHT1 ；1H及13C_NMR數據分別見表1和表2。化合物5，無色油狀物，HRESIMS :m/z 469. 2351 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm (log e ) 272(3. 56) ；IR(KBr)vmax :3360、2980、2850、1600、1505、1430、1385、1255、1160、1005、950、 840CHT1 ；H及13C-NMR數據分別見表1和表2。化合物6，無色油狀物，HRESIMS m/z 469. 2350 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm(log e ) 272(3. 88) ；IR(KBr)vmax :3350、2960、2910、1595、1500、1440、1380、1287、1166、1019、980、 850cm"1 ；1H及13C-NMR數據分別見表1和表2。
表1.化合物1 6的1H NMR婁t據(600MHzin CH3COCH3"d6)
aRecorded inCDC13
表2.化合物1 6的13C匪Ri改據(150MHzin CH3COCH3"d6)
Recorded in CDC具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物的化學結構是(結構式中的阿拉伯數字是化學 結構中碳原子的標位)式I、式II化合物，其中氏為氫、烴基、酰基，R2、R3為氫、烴基、氨基、 羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
式I式II其中式I化合物1 4和式II化合物4、5的禮、R2均為氫，R3分別為實施例1化合物1 6的發酵生產及分離精制1發酵生產生產菌的發酵培養按培養微生物的常規方法，擴張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)適量，接種到PDA斜面培養基上，在28攝氏度培養箱中培養4天。取斜面培養4天的擴張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)適量，接 種到裝有150mL培養液(培養基組成甘露醇2.0%、麥芽糖2.0%、葡萄糖1.0%、KH2P04 0. 05%,MgS047H20 0. 03%、酵母膏 0. 3%、味精 1. 0%、玉米漿0. 1%、海水素 3. 3%、pH 6. 5) 的500mL錐型瓶中，在28°C、120轉/分條件下搖床培養48小時，獲得種子培養液。將該種 子培養液按5%接種量分別接種于裝有300毫升生產培養液(培養基組成同上)的1000mL 三角燒瓶中，于25°C靜置，進行為期30天的生產發酵，獲得菌絲體和發酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮， 所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發酵液減 壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發酵液的浸膏，共20克。3化合物的分離精制浸膏(20克)甲醇溶解后，加60克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產 品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進 行梯度洗脫，分為9個流份。組分5 (氯仿-甲醇98 2洗脫物)，經S印hadex LH-20 (氯 仿-甲醇1 1)，再經HPLC，以甲醇-水85 15洗脫得化合物1 6。化合物1，無色油狀物，[a ]2°D+4. 3(c 0. 09, MeOH) ；HRESIMS :m/z 501. 2636[M+Na]+ ；UV(MeOH)入 max(log e ) :274(3. 55)nm ；IR(KBr)vmax :3380、2950、2850、 1600、1508、1476、1380、1268、1154、1101、980011-1 ；1H 及 13C NMR 數據分別見表 1 和表 2。化合物2，無色油狀物，[a ]2°D+7. 3(c 0. 03, MeOH) ；HRESIMS :m/z 487. 2442[M+Na]+ ； UV (MeOH)入 max(log e ) :272(4. 00) nm ； IR(KBr)vmax :3400、2980、2860、 1595、1500、1470、1385、1287、1100、980、85001^ ；1H and 13C_NMR 數據分別見表 1 和表 2。化合物3，無色油狀物，HRESIMS m/z 469. 2359 [M+Na]+;UV 入 max(Me0H)nm(log ￡ ) 272(3. 76) ；IR
實施例2抗腫瘤活性的測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物1、2、3、 5。準確稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供活性測試。細胞系及細胞的繼代培養活性測試采用A549和HL-60細胞系。各種細胞均用含 10% FBS的RPMI-1640培養基，在37°C通入5%二氧化碳的培養箱中繼代培養。細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。活細胞 線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5_ 二甲基噻唑)-2，5_ 二苯基四氮唑為 藍紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于 formazan的量與活細胞數成正比，所以可根據吸收度求出活細胞的數目，從而了解藥物抑 制或殺傷腫瘤細胞的能力。活性測試時，取對數生長期的A549和HL60細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配制 成密度為每毫升5 X 104個細胞的細胞懸液，按每孔200 u L接種于96孔板中，在37°C下培 養24小時后，每孔加入2 y L不同濃度的樣品溶液，繼續培養72小時。然后加入20y L含 MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養4小時，移出150 y L培養液后加入150 u L DMS0溶 解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR%= (0D s自對照-0D樣)/0D s自對照X 100 % 式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR% )。2實驗結果表3.化合物1 3、5的對人腫瘤細胞的增殖抑制活性(IC5(1，u M) a由于量的原因，化合物4、6未進行活性測試。3 結論化合物1、2、3、5對人來源的癌細胞具有抗腫瘤作用。其中化合物2對HL-60、A549 細胞表現出較強的抑制活性，因此，本發明的式I、式II、式III化合物可作為抗腫瘤劑(即 抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現 象本質的生命科學實驗研究中。
權利要求
式I、式II、式III化合物其中R1為氫、烴基、酰基，R2、R3為氫、烴基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。FSA00000035960800011.tif
2.權利要求1所述的式I化合物，其中化合物1-4的禮、R2均為氧，R3分別為
3.權利要求1所述的式II化合物，其中化合物5、6的禮、R2均為氧，R3分別為
4.權利要求1所述的式III化合物。
5.權利要求2、3、4所述式I、式II、式III化合物的制備方法，其特征是發酵培養擴張 青霉真菌(Penicilliumexpansum) 091006，獲取含有上述式I、II化合物的發酵物，然后從 發酵物中分離純化出式I化合物1 4，式II化合物5、6。
6.權利要求5所述的制備方法，其中將所述發酵物經硅膠柱層析，以石油醚、石油 醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇98 2的洗脫物，再經S印hadex LH-20柱層析，氯仿-甲醇1 1洗脫產物再經制備HPLC分離純化，以甲醇-水85 15洗 脫分別得到化合物1 6。
7.權利要求6所述式I、II、III化合物的制備方法，其中所述甲苯酚三聚體類類化合 物的生產菌是擴張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)，其保藏號為CCTCC M 2010022，其 18S rRNA 基因的 GenBank 號為 DQ401105。
8.權利要求1所述的式I、II、III化合物在制備細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑中 的用途。
9.權利要求1所述的式I、II、III化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
10.權利要求10所述的菌株用于生產權利要求1所述的式I、II、III化合物的用途。
全文摘要
本發明涉及甲苯酚三聚體類化合物及其制備方法和用途。本發明用從紅樹植物海漆根部樣品中分離得到的共生真菌-擴張青霉(Penicillium expansum)091006生產出結構新穎的上述類型的化合物。經實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號A61K31/09GK101875601SQ20101012717
公開日2010年11月3日 申請日期2010年2月22日 優先權日2010年2月22日
發明者付鵬, 劉培培, 盧圳域, 莊以彬, 張志華, 朱偉明, 林海鵬, 洪葵, 王乂 申請人:中國海洋大學;中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所