專利名稱：：營養組合物在制備促進肝臟干細胞增殖藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種營養組合物的用途，尤其是一種營養組合物在制備促進肝臟干細胞增殖藥物中的應用。
背景技術：
：慢性肝炎、肝纖維化與肝硬化、門脈高壓癥、原發性肝癌、遺傳性及代謝性肝臟疾病等諸多難治性肝病是全世界共同面臨的棘手問題。對于上述各種原因引發的終末期肝衰竭，原位肝移植是目前唯一有效的治療手段。然而，由于供肝的極度短缺、手術及移植本身相關的較高死亡率、終身服用免疫抑制劑及其所帶來的嚴重甚至致命并發癥，使得肝移植在臨床的廣泛應用受到極大限制。隨著干細胞生物學研究的不斷發展，以干細胞為種子細胞的移植治療將為終末期肝衰竭患者帶來新的希望。肝臟干細胞較成熟肝臟細胞的優點在于其易于擴增培養，免疫原性弱，尤其是胚胎組織來源的肝臟干細胞，體外培養條件下易于操作，可通過體外擴增、分化和基因修飾后再進行體內移植。近年來，以供體肝臟干細胞作為載體的直接肝基因治療是肝臟細胞移植基礎與臨床研究的一個熱點，即通過逆轉錄病毒、腺病毒將目的基因體外轉染至分離的供體肝臟干細胞中，再進行肝臟細胞移植，移植后的供體肝臟干細胞就可以在受體中表達目的基因。但是，在機體宏觀與微觀環境沒有得到任何改善的條件下，其自身原有相應干細胞依然處于"休眠"的狀態下，僅僅依靠外援性的干細胞輸送，顯然難以達到預期目的。專利申請號為200710012788.8的專利申請公開了一種"促進造血干細胞增殖與血紅蛋白合成的營養組合物"。該營養組合物的原料及重量比如下核苷酸90110、精氨酸2030、賴氨酸2030、半胱氨酸1020、甘氨酸2535、組氨酸2030、卵磷脂110130、腦磷脂5070、維生素EO.40.6、維生素C57、葉酸0.020.04、維生素B20.050.07、維生素B60.070.08、維生素B120.00010.0002、鐵0.51.5、鋅0.50.7、錳0.40.6、枸杞多糖1416、葡萄籽提取物1416?？擅黠@提高血中血紅蛋白(Hb)、紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)及血小板(Pit)數量；可剌激骨髓造血干細胞的增殖，使造血干細胞明顯增多；明顯提高細胞內線粒體數目；對肝、脾的損傷具有明顯的恢復作用。該營養組合物適用于營養不良性貧血(缺鐵性貧血及葉酸與維生素B12營養不良性貧血)、紅細胞生成減少所致貧血以及紅細胞破壞過多或丟失所致貧血。但是，該專利申請文件并沒有記載該營養組合物具有促進肝臟干細胞增殖的作用。
發明內容本發明是發現了上述營養組合物具有促進肝臟干細胞增殖的作用，提供一種營養組合物在制備促進肝臟干細胞增殖藥物中的應用。本發明的技術解決方案是一種營養組合物在制備促進肝臟干細胞增殖藥物中的應用。本發明的營養組合物在促進造血干細胞增殖與血紅蛋白合成的同時，還能為喚醒休眠的成體肝臟干細胞創造條件，進而可促進成體肝臟干細胞增殖。解決了現有原位肝移植及供體肝臟干細胞移植所存在的種種問題，具有有效、安全、簡便、經濟、不產生免疫排斥等優點。圖1是本發明實施例肝臟干細胞流式細胞儀分析圖。圖2是本發明實施例肝臟干細胞流式細胞儀分析示意圖。圖3是本發明實施例肝臟干細胞免疫組化圖。圖4是本發明實施例肝臟干細胞免疫組化示意圖。具體實施例方式1.建立模型、實驗分組和實驗流程再生障礙性貧血小鼠模型的建立本實驗采用BALB/c小鼠。實驗步驟第1天皮下注射乙酰苯肼100mg/kg，次日X射線2.OGy照射后，于第5天環磷酰胺80mg/kg腹腔注射，第15天重復以上步驟但不給予射線處理。以單純等量生理鹽水相應部位注射為正常對照組。實驗分組根據動物藥理學的藥品劑量和綜合實驗的設計分析，分為①正常對照組；②再障模型組；③高劑量組，以1445.55mg/kg.d營養組合物對再障小鼠灌胃；中劑量組，以963.7mg/kg.d營養組合物對再障小鼠灌胃；⑤低劑量組，以674.59mg/kg.d營養組合物對再障小鼠灌胃。實驗流程首先，按前述再障小鼠模型的建立方法，注射乙酰苯肼、環磷酰胺及X射線照射。從第7天開始，營養組合物高、中、低劑量組分別以相應劑量對再障小鼠進行灌胃，每天一次，直至第49天，拉頸處死小鼠，采樣進行檢測。2.實驗方法2.l流式細胞儀分析將細胞用PBS緩沖液洗滌三次，離心(1000r/min，5min)收集細胞，用PBS重懸為lX106/ml的細胞懸液，分別取200ii1轉移至Eppendorf管中，離心(1000r/min，5min)，棄上清，沉淀加入5%脫脂奶粉371:封閉0.5小時。PBS洗滌一次，加入1:200免抗小鼠CD90多克隆抗體，37t:孵育2小時。然后PBS洗滌一次，除去未結合的一抗。加入標記熒光素的羊抗免IgG，工作濃度l:1000，37t:避光孵育0.5小時，PBS洗滌二次(1000r/min，5min)，用流式細胞儀檢測表達CD90陽性細胞數量變化，以標記抗體呈陽性的細胞百分率作為表達CD90蛋白(肝干細胞標志物)的計量標準。同時以只加標記熒光素的羊抗免IgG和不加一抗、二抗的細胞作陰性對照。2.2免疫組化(SP法)染色石蠟切片脫蠟、水化；PBS洗23次各5分鐘；3%H202(80%甲醇)滴加在玻片上，室溫靜置10分鐘；PBS洗23次各5分鐘；抗原修復；PBS洗23次各5分鐘；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，滴加一抗50iil，4t:過夜。過夜后需在37"復溫45分鐘。PBS洗3次各5分鐘；滴加二抗4050y1，室溫靜置，或37°C1小時；PBS洗3次各5分鐘；DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10分鐘；蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；自來水沖洗1015分鐘；脫水、透明、封片、鏡檢。2.3統計學分析所有數據均用SPSS12.0軟件進行統計分析。每一項分析至少有三次結果。數值用均數±SD表示，采用t檢驗。P<0.05認為有顯著性差異，并在統計學上有意義。3.實驗結果3.1流式細胞儀檢測肝干細胞肝干細胞表面標志物很多，但其敏感和特異性均不滿意。CD90是一種細胞表面糖蛋白，是新近發現的特異性較強的肝干細胞表面標志物，本實驗選用CD90作為標志物，用流式細胞儀檢測再障小鼠肝干細胞標志物CD90的表達，結果顯示，與正常對照組相比，再障模型組小鼠肝干細胞數量明顯減少；營養組合物處理再障小鼠后，小鼠肝干細胞的含量隨營養組合物劑量增加而增加，表明營養組合物可促進再障小鼠肝干細胞的增殖(見圖1、2)，具體數值見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>#P<0.05再障組與對照組*P<0.05營養組合物組對再障組3.2免疫組化分析肝于細胞(CD90，400倍)結果顯示，與正常對照組相比，再障模型組小鼠肝干細胞數量明顯減少，營養組合物處理再障小鼠后，小鼠肝干細胞的含量隨營養組合物劑量增加而增加，表明營養組合物可促進再障小鼠肝干細胞的增殖(見圖3、4)，具體數值見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>#P<0.05再障組與對照組*P<0.05營養組合物組與再障組結論營養組合物能促進再生障礙性貧血小鼠肝干細胞的增殖，可在制備促肝臟干細胞增殖藥物中的應用。權利要求一種營養組合物在制備促進肝臟干細胞增殖藥物中的應用。全文摘要本發明公開一種營養組合物在制備促進肝臟干細胞增殖藥物中的應用，所述營養組合物在促進造血干細胞增殖與血紅蛋白合成的同時，還能為喚醒休眠的成體肝臟干細胞創造條件，進而可促進成體肝臟干細胞增殖。解決了現有原位肝移植及供體肝臟干細胞移植所存在的種種問題，具有有效、安全、簡便、經濟、不產生免疫排斥等優點。文檔編號A61K33/30GK101780183SQ201010129030公開日2010年7月21日申請日期2010年3月22日優先權日2010年3月22日發明者吳文國,李恕,董鋒申請人:珍奧集團股份有限公司