專利名稱：：肝芽干細胞及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學
技術領域：
，具體涉及肝芽干細胞，及其制備方法和用途。
背景技術：
：近年來干細胞生物學得到了迅猛的發展。所謂干細胞，是指那些處于分化過程之中，具有分裂增殖能力，可自我更新，有多向分化潛能，即能分化產生一種以上"專業"細胞的原始細胞。干細胞依其分化潛能的大小可分為①胚胎干細胞,即具有分化為機體任何一種組織器官潛能的細胞，如囊胚內細胞團細胞。②成體干細胞，即具有自我更新能力,但通常只能分化為相應(或相鄰)組織器官組成的"專業"細胞，它是存在于成熟個體各種組織器官中的干細胞，如造血干細胞、神經干細胞、肌肉干細胞、角膜干細胞、胰腺干細胞、皮膚干細胞、肝臟干細胞等。在成體干細胞向終末成熟細胞分化的進程中，其分化潛能進一步限定，從而產生相應的祖細胞。肝干/祖細胞的分離培養及其深入研究對于肝臟發育、肝臟腫瘤和肝臟再生的發生機理以及多種肝臟疾病的防治都具有十分重要的價值。一般意義上的肝干/祖細胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化為成熟肝細胞和膽管上皮細胞的肝臟原始細胞。由于肝干細胞在肝臟中存在的數量極少，再加上其分離培養的技術條件又十分特別等因素的緣故，目前成功培養的肝干/祖細胞系是十分有限的。而在成功培養的這些肝干/祖細胞系中，它們則主要來自大鼠或小鼠。對于人的肝干細胞的研究則相對少得多。目前僅見有來源于人成體肝臟(HerreraMB等，2006)，或晚期胚胎肝臟的干細胞(DanYY等，2006;MalhiH等，2002)，而尚未見有來源于早期胚胎肝臟的干細胞。肝原基于人胚發育的第4周開始出現，第6周肝臟開始造血。大概90%的成體肝臟結構在胚胎發育的第8周可見。如果能從早期人胚肝芽組織中分離得到多潛能的干細胞，將為肝干細胞生物學的研究提供一個理想的細胞模型，也有可能為各種因素所致肝臟疾病的細胞治療、藥物的篩選、組織工程等多個領域的研究提供一種理想的細胞來源。
發明內容本發明的目的是提供一種從人早期胚胎肝芽組織中分離培養多潛能干細胞的方法，本發明的另一目的是提供根據上述方法制得的肝芽干細胞及其應用。本發明的一種從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞的方法，由以下步驟組成的A、原代培養物的建立取胎齡4.5至6周的流產人胚胎，以PBS充分洗滌后在解剖顯微鏡下分離出完整的胚胎肝臟，置于96孔板內以0.05%Trypsin/EDTA消化約5分鐘，然后加入改良IF培養液終止消化，靜置后取懸液，置于鋪有0.2。^明膠的培養皿內，37°C、5%C02、95%濕度條件培養；待3-4小時細胞貼壁后換液，以后隔天換液，每次均以PBS洗滌2-3次；改良IF培養液是以IMDM培養基HAMF12培養基=1:1為基礎培養基，添加2.5%胎牛血清、5)ig/ml胰島素、20ng/ml表皮細胞生長因子、1%非必需氨基酸、lmMGlutamaxTM和1°/。青/鏈霉素配制而成；B、細胞傳代培養在原代培養物生長兩周以后，一種小三角形細胞出現優勢克隆樣生長，以無菌細胞刮去除其他形態的細胞，PBS充分洗滌后，用0.05。/。Trypsin/EDTA消化至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養液終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液，計數后以1X104/cm2的密度接種至另一鋪有0.2%明膠的培養瓶/皿中繼續培養；每45天傳代一次；C、培養細胞的凍存與復蘇a)細胞的消化與凍存細胞長至約90%匯合時，PBS充分洗滌，用0.05%Trypsin/EDTA消化，至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養基終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液，1000r.p.m離心6分鐘，棄去上清液，以1()7個細胞/ml的比例加入凍存液，充分混勻后置于凍存管中密封,先置于4。C30-60分鐘，后置于-70°C10-14小時，最后置于液氮罐中保存；凍存液是以凍存原液和步驟A中配制的改良IF培養液各一份混勻而成，凍存原液是以改良IF培養液:胎牛血清二甲亞砜二3:1:1配制而成；b)凍存細胞的復蘇將凍存管從液氮罐中取出，置于37T水浴箱中解凍；1000r.p.m離心6分鐘，棄去凍存液，置于鋪有0.2%明膠的培養皿中，加入改良IF培養液，37°C、5%C02、95%濕度條件培養。由于本發明提供的改良IF培養液，才使從人胚肝芽組織中分離出的肝芽干細胞被成功建系。而且本發明提供的凍存液又較好地保持了肝芽干細胞的生物學特性。本發明還提供了根據上述分離培養方法得到的人肝芽干細胞，它具有以下特點1、獨特的形態學特征體積較小，細胞核較大，呈小三角形，既不同于上皮細胞的鋪路石樣外觀，也不同于成纖維細胞的長梭形外觀。電鏡下可見細胞核質比極大，胞質內細胞器極少。2、強大的增殖能力hLBSC傳至第5代時繪制生長曲線。根據公式TD=tlog2/log(N/N0)計算倍增時間為28.1小時。以1X104/cm2的密度接種細胞，大約每45天傳代一次。目前已經在體外培養長達數年，傳代超過25代(約90個倍增時間)而細胞的增殖保持穩定。3、hLBSC是正常細胞核型分析和致瘤性實驗結果顯示hLBSC核型正常，且不會在SCID小鼠體內形成腫瘤，表明hLBSC是正常細胞。4、hLBSC表達多種不同類型的分子標志RT-PCR檢測和流式細胞分析結果顯示hLBSC表達肝干細胞相關的分子標志(如ALB、CYP1B1、CK18、CK19、GGT、DPPIV、c-Met、Thy-l和c-kit等)，而且還表達間質細胞的部分分子標志(如CD44、CD29、SDF-1等)，但不表達造血細胞的標志(如CD34和CD45)。另外還檢測到0ct4、Nanog等多能性干細胞標志。本發明的所提供的人肝芽干細胞具有多向分化潛能在體外特定的誘導條件下，可以分別分化為內胚層的成熟肝細胞、膽管細胞和胰e細胞；外胚層的神經細胞和中胚層的脂肪細胞及成骨細胞；能夠參與SCID小鼠損傷肝臟的修復。本發明所提供的人肝芽干細胞具有廣泛的用途。其特征在于可能為相關臟器疾病的細胞治療以及組織工程提供理想的細胞來源，為相關臟器疾病的基因治療提供一種理想的細胞載體，并為體外研究肝臟的發育及其損傷修復提供一種理想的細胞模型。圖1為解剖顯微鏡下的4.5周人胚圖，顯示肝芽所處的部位。圖2為倒置相差顯微鏡下人肝芽干細胞的形態圖。圖3為人肝芽干細胞的生長曲線圖。圖4為人肝芽干細胞表達的分子標志圖。其中A為RT-PCR檢測結果，顯示hLBSC表達ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit等肝干細胞相關分子標志，而不表達TAT和HNF;B為流式細胞儀分析結果，顯示hLBSC不表達造血系標志CD34、CD45，而表達CD44、CD29等間質細胞標志，以及Thy-l;C為RT-PCR結果，顯示hFLSC表達SDF-1等間質細胞的分子標志；D為RT-PCR結果，顯示hFLSC表達0ct4、Nanog等多能性干細胞標志。其中P4、P9、P12分別代表第4代、第9代、第12代的hFLSC。圖5為人肝芽干細胞分化為成熟肝細胞的圖。其中A為光鏡下細胞形態的改變，B、C為超微結構的變化，D顯示hLBSC在丁酸鈉作用下PAS反應呈陽性，E為RT-PCR檢測結果，顯示在丁酸鈉誘導下肝細胞標志和膽管細胞標志的表達均上調。圖6為人肝芽干細胞分化為脂肪細胞的圖。其中A為油紅染色結果，B為脂肪特異性標志PPARy2的RT-PCR檢測結果，M:分子量標準；1.未加誘導條件的對照細胞；2.誘導10天后的細胞;3.誘導14天的細胞(PPARy_2:351bp;P-actin:516bp)圖7為人肝芽干細胞向成骨細胞的誘導分化圖。其中A為光鏡下形態的變化，B為經成骨誘導后堿性磷酸酶染色結果，C為經成骨誘導后I型膠原的RT-PCR檢測結果M:分子量標準；1.RT(—)；2.未加誘導條件的對照細胞；3.誘導14天的細胞。圖8為人肝芽干細胞向神經樣細胞的誘導分化圖。其中A為光鏡下細胞形態的改變，B為經ATRA誘導后Nestin的RT-PCR檢測結果M:分子量標準；1.RT(一)；2.未加誘導條件的對照細胞；3.誘導6天的細胞圖9為人肝芽干細胞在SCID小鼠損傷肝臟中植入后熒光顯微鏡下受體SCID小鼠肝臟綠色熒光分布情況圖。A.移植后2天小鼠肝臟未見綠色熒光；B.C.移植后10天，肝臟冰凍切片見散在綠色熒光；D.E.移植后17天，EGFP陽性細胞較為均勻的散布于肝臟中，通常67個細胞一團，甚至更多。圖10為人肝芽干細胞在SCID小鼠損傷肝臟中植入后受體SCID小鼠肝臟中綠色熒光的分布及對應的組織結構圖。A:熒光視野；B:對應HE切片的可見光視野，矩形框示發出綠色熒光的細胞位置。具體實施例方式現結合附圖和實施例對本發明作詳細描述。實施例1.從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞1.1培養器皿的預處理以0.2%明膠覆蓋培養瓶/皿/板的底壁，室溫下放置30分鐘后，將0.2%明膠吸出，室溫晾干后備用。1.2配制培養用液-改良IF培養液IMDM醒FBS胰島素EGFNEAA200raM青/鏈霉素F12(100X)GlutamaxTM(ioox)100ml100ml5ml5ug/ml20ng/ml2mllml2nd其中IMDM和HAMF12培養基、NEAA、GlutamaxTM、青/鏈霉素為GibcolBRL公司產品，FBS為Hyclone公司產品，胰島素、EGF為Sigma公司產品。凍存原液的制備改良IF培養液7.5ml胎牛血清2.5ml二甲亞砜2.5ml混勻，4。C保存備用。1.3人胎肝細胞的分離及接種培養取胎齡4.5周的流產人胚胎置于解剖顯微鏡下(圖l)，可見肝芽位于胚胎腹側，心包的下后方，如圖中L所示。以PBS充分洗滌后小心分離出完整的胚胎肝臟，置于96孔板內以0.05%Trypsin/EDTA消化約5分鐘，然后加入改良IF培養液終止消化，并用吸頭反復吹打幾次，靜置幾分鐘后取懸液，置于鋪有0.2%明膠的35,—次性培養皿內，37°C、5%C02、95%濕度條件培養。待3-4小時細胞貼壁后換液，以后隔天換液，每次均以PBS輕輕洗滌2-3次。分離的胎肝細胞很快貼壁，極少細胞懸浮。貼壁細胞形體較大，形態混雜。這些細胞在兩周后生長停滯，而代之以一種小梭形或三角形細胞的優勢生長。1.4細胞傳代培養在原代培養物生長兩周以后，一種小三角形細胞出現優勢克隆樣生長，以無菌細胞刮去除其他形態的細胞，用吸管吸去舊培養液，PBS充分洗滌后，用0.05%Trypsin/EDTA消化至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養液終止消化，用吸管輕輕吹打成單細胞懸液，計數后以1X104/cm2的密度接種至另一鋪有0.2%明膠的培養瓶/皿中繼續培養。傳代培養物為形態均一且增殖穩定的小三角形細胞，如圖2所示。每4~5天即傳代一次。1.5培養細胞的凍存與復蘇1)凍存液的配制先配制凍存原液(改良IF培養液胎牛血清二甲亞砜=3:1:1)，臨用前取凍存原液和改良IF培養液各一份混勻，即為凍存液。2)細胞的消化與凍存細胞長至約90%匯合時，用吸管吸去舊培養液，PBS充分洗滌，用0.059&Trypsin/EDTA消化，至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養基終止消化，用吸管反復吹打成單細胞懸液，1000r.p.m離心5分鐘，棄去上清液，以107個細胞/ml的比例加入凍存液，充分混勻后置于凍存管中密封。先后置于4。C40分鐘，-70T過夜，最后置于液氮罐中保存。3)凍存細胞的復蘇迅速將凍存管從液氮罐中取出，快速置于37"C水浴箱中完全解凍。1000r.p.m離心6分鐘，棄去凍存液，置于鋪有0.2%明膠的35mm培養皿中，加入改良IF培養液，37°C、5%C02、95%濕度條件培養。實施例2:人肝芽干細胞系生物學特性的鑒定2.1增殖動力學分析參照《細胞培養》(世界圖書出版公司，司徒鎮強、吳軍正主編)繪制生長曲線如圖3所示。根據公式TD=tlog2/log(N/N0)計算倍增時間為28.1小時。以lX10Vcr^的密度接種細胞，大約每45天傳代一次。目前已經在體外培養長達一年以上，傳代超過25代(約90個倍增時間)而細胞的增殖保持穩定。2.2細胞的致瘤性分析-將2X107個hLBSC細胞移植到SCID小鼠(n二4)皮下，每周觀察一次，共觀察14周未見腫瘤發生。證明hLBSC沒有發生轉化、沒有致瘤性。2.3細胞的分子表型檢測(1)RT-PCR分析顯示hLBSC表達ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit等肝干細胞相關分子標志，而不表達TAT和HNF。另外還表達SDF-1等間質細胞的分子標志；以及Oct4、Nanog等多能性干細胞標志，如圖4A、C、D所示。具體做法如下1)細胞總RNA的抽提實驗前將與RNA接觸的玻璃器皿洗凈后置于180。C烘烤8小時，不耐高溫的耗材浸泡于0.1%的DEPC溶液中12小時，7(TC烘烤干燥，然后于12rC高壓滅菌15分鐘，而后烘干。將貼壁培養的細胞消化成單細胞懸液，1500r.p.m.離心5min后，完全棄去上清液，用"EZSpinColumnRNAIsolationKit"試劑盒抽取細胞總RNA。加入水溶解RNA。保存于-70'C。2)逆轉錄反應按下列反應組成調制反應液細胞RNA樣品4plOligodT-AdaptorPrimer3|alRnaseFreedH20700ClOmin冰上驟冷，5XRNAPCRBuffer5nlRnaseFreedH208|aldNTPMixture1.5piRNaseInhibitor0.5plM-應LVReverseTranscriptase1^1混勻后，37t作用l小時。3)RT-PCR反應反應體系為50nl，如下表所示。反應條件95°C5min變性后，進入循環94°C30sec—X°C30sec—72°Clmin循環30次，然后72°C延長10min，于4。C保存。以1.5%的瓊脂糖凝膠，上樣10plPCR產物進行電泳鑒定。RT-PCR反應體系10xRNAPCRBuffer5^1dNTPMixture_0.5pi_TaXaRaTaxi酶0.5nl上游PCR引物0.5pl下游PCR引物0.5pl滅菌蒸餾水42^1RT產物1^1RT-PCR引物列表(由生工生物公司合成)分子名稱引物序列擴增片退火斷大小溫度X(。C)c-kit5'-CGTTGACTATCAGTTCAGCGAG-3'5'-CTGGGAATGTGTAAGTGCCTCC-3'360bp55CK195'誦TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC誦3'746bp685，-CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC國3"c-Met5，-GGGTCGCTTCATGCAGGTTGTGGT-3，372bp605，-ATGGTCAGCCTTGTCCCTCCTTCA-3，GGT5'-GGATTCTCCCAGAGATTGCC-3'300bp60.75'-GAAGGTCAAGGGAGGTTACC-3'DPPIV-TACTCTGCTCTGTGGTGGTC-3'772bp525'-AATACTTCGCCTCTTTACTG-3'CK185'-TGCTGCTGATGACTTTAGAG-3'139bp555'-AGCCTCGATCTCTGTCTCC-3'PPARY25'-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3'351bp52.25'-ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3'p-actin5'-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'516bp555'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3'Albumin,5，-CCTTTGGCACAATGAAGTGGGTAACC-3'355bp62.95，-CAGCAGTCAGCCATTTCACCATAGG-3'Oct45，-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG-3z247bp585，-CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC-3'SDF-15'誦ATGAACGCCAAGGTCGTGGTCG國3'202bp555'-TGTTGTTGTTCTTCAGCCG-3'Collagen5'-CTTTGACCAACCGAACATGAC-3'2的bp55Type1-A15'-TTGAGCATTGCCTTTGATTGC陽3'(2)流式細胞儀分析顯示hLBSC不表達造血系標志CD34、CD45，而表達CD44、CD29等間質細胞標志，以及Thy-l，如圖4B所示。具體做法如下取約105106細胞，分別按抗體說明書加入相應檢測量的熒光標記抗體和相應的同型對照抗體，混勻，室溫避光放置20min。加入2mlPBS，1000g離心5min，棄上清，加入300^1PBS重懸細胞。流式細胞儀檢測，以Cellquest軟件獲取細胞，分析陽性細胞百分比。所用的熒光抗體為晶美生物公司產品，包括CD45-PerCP，CD34-FITC，CD90-FITC，CD44-FITC，CD29-PE。實施例3.肝芽干細胞向肝細胞的誘導分化3.1誘導液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.2向肝細胞的誘導將蓋玻片置于60mm的培養皿中，接種細胞2X107CM2，當蓋玻片上的細胞生長至60%匯合時，換誘導液D-10-SB培養基繼續培養。3.3分化過程的形態學觀察每天在倒置相差顯微鏡下觀察并通過顯微攝影記錄細胞形態和生長狀況。光鏡下可見短梭形或三角形的細胞在加入丁酸鈉24小時后即變得扁平而肥大，核質比明顯縮小。誘導后48小時鏡下可見肥大的雙核細胞。IO天后大約有1015%的細胞變為雙核細胞，偶見三核細胞，如圖5A所示。由于成熟肝細胞在體內多為雙核或多核細胞，在丁酸鈉的作用下雙核細胞的出現提示hLBSC變為肝細胞樣細胞。3.4分化細胞超微結構的觀察a)用細胞刮將丁酸鈉誘導第4天的細胞從培養皿刮下，用PBS洗3次，盡可能保留大片的細胞不被打散。1000轉離心5分鐘得到細胞團塊，凝塊，將細胞團塊用4%的多聚甲醛固定4小時，然后用0.1MPBS漂洗5次。b)用1%的鋨酸固定2小時，PBS洗一次。雙蒸水洗一次，然后依次通過30%的乙醇5分鐘，50%的乙醇5分鐘，70%的乙醇10分鐘，90%的乙醇10分鐘，90%的丙酮10分鐘，無水丙酮10分鐘X3次。C)1:1的丙酮包埋劑浸透l小時；1:2的丙酮包埋劑浸透過夜；純包埋劑浸透2小時。包埋劑聚合37°C作用12小時、60°C作用36小時。d)修塊、超薄切片；醋酸鈾染色15分鐘，雙蒸水洗；硝酸鉛染色5分鐘，雙蒸水洗。e)透射電鏡觀察，可見誘導后的細胞胞質內具有豐富的細胞器，包括豐富的線粒體、核糖體、排列整齊的粗面內質網、高爾基體以及大量的糖原顆粒，與誘導前細胞形成鮮明的對比。并可見到細胞間膽管樣結構，腔內有較多絨毛樣突起，其旁有細胞間連接。如圖5B、C所示。3.5分化細胞分子表型的檢測(1)RT-PCR:將誘導4天的細胞抽取總RNA，同前所述體系和條件檢測肝細胞標志ALB、DPPIV及膽管細胞標志CK19、GGT，結果如圖5E所示，可見其表達均有所增強。(2)PAS實驗檢測細胞糖原含量將長有細胞的蓋玻片在第10天取出，10%的中性緩沖甲醛固定20分鐘，蒸餾水洗后，浸入0.5%高碘酸15分鐘，充分水洗后浸入Schiff氏液作用1015分鐘，水洗，晾干，中性樹膠封片，鏡下觀察。結果如圖5D所示，可見誘導后的細胞胞質中糖原顆粒呈紫紅色顆粒狀著色，有的甚至連接成片。在雙核細胞多見。以上光鏡下細胞形態的改變，超微結構的變化，結合分子表型的改變，以及PAS陽性結果，提示hLBSC可以分化為成熟的肝細胞。實施例4.肝芽干細胞向脂肪細胞的誘導分化4.1脂肪誘導培養基的配制DMEM—HG馬血清(Gibco)P/S100X45ml5ml0.5ml4.2向脂肪細胞的誘導:將蓋玻片置于60mm的培養皿中，接種細胞5X107CM2，當蓋玻片上的細胞生長至100%匯合時，換誘導培養基繼續培養，每3天換液，共14天。4.3分化過程的形態學觀察每天在倒置相差顯微鏡下觀察并通過顯微攝影記錄細胞形態和生長狀況。在馬血清作用24小時后，光鏡下可見細胞形態變大，呈長而寬扁的梭形。兩天后有10%的細胞胞質內出現折光率很高、大小不等的黃色脂滴樣物。4.4分化標志的檢測(1)RT-PCR:分別對誘導10天和14天的細胞抽取總RNA，同前所述體系和條件檢測脂肪細胞特異性分子標志PPARy-2的表達。結果顯示誘導10天和14天的細胞均有PPARy—2的表達，且誘導14天的細胞PPARy2的表達有所增強，如圖6B所示。(2)油紅-0特異性染色將生長于飛片上誘導13天的細胞以甲醇于一20。C固定2分鐘，50%乙醇洗滌后，加入油紅工作液染色15分鐘，然后以50%的乙醇洗滌，蘇木精襯染約2分鐘，蒸餾水洗滌后，以甘油明膠封片，鏡下觀察，結果如圖6A所示，可見約90%的細胞胞質內有大小不等的紅色脂滴。由此可見人肝芽干細胞確實具有向脂肪細胞分化的潛能。實施例5.人肝芽干細胞向成骨細胞的誘導分化5.1成骨誘導培養基的配制:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5.2向成骨細胞的誘導:將蓋玻片置于60mm的培養皿中，接種細胞3X107cm2，當蓋玻片上的細胞生長至60%匯合時，換誘導液繼續培養。5.3分化過程的形態學觀察每天在倒置相差顯微鏡下觀察并通過顯微攝影記錄細胞形態和生長狀況。可見誘導第3天后細胞形態發生改變，由三角形變為扁平的立方型或多角形，隨著培養時間的延長，細胞基質中出現折光率很高的鈣化斑，如圖7A所示。5.4分化標志的檢測(1)RT-PCR:對誘導14天的細胞抽取總RNA，同前所述體系和條件檢測I型膠原，結果顯示I型膠原的表達增強，如圖7C所示。(2)堿性磷酸酶顯色反應:將生長于飛片上的細胞以甲醇于一20。C固定2分鐘，緩沖液洗10分鐘，加入BCIP/NBT染液于37。C避光孵育10分鐘(不時觀察直至發色達到滿意程度為止)，蒸餾水洗.甲基綠復染約10分鐘，蒸餾水洗滌后，以甘油明膠封片，鏡下觀察可見，誘導14天后大約30%的細胞堿性磷酸酶染色呈陽性，如圖7B所示。初步結果顯示hLBSC可能向成骨細胞分化。實施例6.人肝芽干細胞向神經樣細胞的誘導分化6.1神經誘導培養基的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6.2培養細胞的誘導:將蓋玻片置于60mm的培養皿中，接種細胞3X107cm2，當蓋玻片上的細胞生長至70%匯合時，換IF-BME培養基或IF-ATRA培養基繼續培養。6.3分化過程的形態學觀察每天在倒置相差顯微鏡下觀察并通過顯微攝影記錄細胞形態和生長狀況。發現在BME作用后24小時有較多細長細胞可見，這種細胞胞體兩端各有一支長長的突起，有的突起還有分支，如圖8A所示。6.4分化過程分子表型的檢測用RT-PCR方法分別對誘導4天和8天的細胞抽取總RNA，同前所述體系和條件檢測Nestin和GFAP的表達。如圖8B所示，檢測到Nestin的陽性表達，而GFAP表達呈陰性。實施例7.人肝芽干細胞植入SCID小鼠損傷肝臟的實驗7.1hLBSC體外標記EGFP報告基因1)將穩定轉染有pLNCGCl載體DNA的PT67細胞系接種于100mm的培養皿中，待細胞生長至大約60%融合時換新鮮培養液，繼續培養24小時，收獲病毒上清，加入8pg/ml的polybrene，以0.45um的濾膜過濾，通過感染NIH-3T3細胞的方法測定病毒的滴度；2)hLBSC生長至大約40%匯合時，加入收獲的含病毒培養液上清培養20小時，換為新鮮細胞培養液繼續培養2448小時；加入含800ng/mlG418的細胞培養液培養7天，得到穩定表達綠色熒光蛋白的hLBSC-EGFP。7.2SCID小鼠肝損傷模型的建立將CCL4和橄欖油以1:5的比例混合配制成CCL4溶液，于細胞移植前24小時腹腔注射入SCID小鼠體內(100)al/20g體重)。7.3hLBSC-EGFP細胞移植將hLBSCEGFP經脾注射入7只CCL4肝損傷SCID小鼠體內，每只注射細胞數為2.4乂106個，并設三只對照。7.4標記細胞植入的檢測A.分別在移植后的第2天、10天、20天取受體鼠的肝組織做冰凍切片，于熒光顯微鏡下直接觀察，結果發現，在移植后2天，肝臟冰凍切片未見綠色熒光；移植后10天，肝臟冰凍切片見散在綠色熒光；移植后20天，EGFP陽性細胞較為均勻的散布于肝臟中，通常67個細胞一團，甚至更多，如圖9所示。B.連續冰凍切片同時做HE染色，分析綠色熒光蛋白的分布情況，發現綠色熒光所處位置為肝板內的多個成熟肝細胞，如圖IO所示。從而有力的證明了hLBSC細胞可以在損傷肝臟中增殖并分化為肝細胞。具體做法如下1)將冰凍切片于37°(:干燥后，浸入Mayer蘇木精液中數分鐘；2)取出切片，用自來水輕輕沖洗，待細胞染藍色后，用稀鹽酸70%乙醇溶液進行分色，再用自來水沖洗約10分鐘；3)蒸餾水洗后，浸入1%伊紅染液5-IO分鐘；4)用蒸餾水洗去浮色后，經梯度乙醇(70%、80%、90%、95%和100%)脫水，直至胞質與胞核的紅、藍反差鮮明；5)二甲苯透明，樹膠封片，光鏡下觀察。權利要求1、一種從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞的方法，其特征在于該方法是由以下步驟組成的A、原代培養物的建立取胎齡4.5至6周的流產人胚胎，以PBS充分洗滌后在解剖顯微鏡下分離出完整的胚胎肝臟，置于96孔板內以0.05％Trypsin/EDTA消化約2-8分鐘，然后加入改良IF培養液終止消化，靜置后取懸液，置于鋪有0.2％明膠的培養皿內，37℃、5％CO2、95％濕度條件培養；待3-4小時細胞貼壁后換液，以后隔天換液，每次均以PBS洗滌2-3次；改良IF培養液是以IMDM培養基HAMF12培養基＝1:1為基礎培養基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰島素、20ng/ml表皮細胞生長因子、1％非必需氨基酸、1mMGlutamaxTM和1％青/鏈霉素配制而成；B、細胞傳代培養在原代培養物生長兩周以后，一種小三角形細胞出現優勢克隆樣生長，以無菌細胞刮去除其他形態的細胞，PBS充分洗滌后，用0.05％Trypsin/EDTA消化至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養液終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液，計數后以1×104/cm2的密度接種至另一鋪有0.2％明膠的培養瓶/皿中繼續培養；每4～5天傳代一次；C、培養細胞的凍存與復蘇a)細胞的消化與凍存細胞長至約90％匯合時，PBS充分洗滌，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養基終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液，1000r.p.m離心6分鐘，棄去上清液，以107個細胞/ml的比例加入凍存液，充分混勻后置于凍存管中密封，先置于4℃30-60分鐘，后置于-70℃10-14小時，最后置于液氮罐中保存；凍存液是以凍存原液和步驟A中配制的改良IF培養液各一份混勻而成，凍存原液是以改良IF培養液:胎牛血清:二甲亞砜＝3:1:1配制而成；b)凍存細胞的復蘇將凍存管從液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解凍；1000r.p.m離心6分鐘，棄去凍存液，置于鋪有0.2％明膠的培養皿中，加入改良IF培養液，37℃、5％CO2、95％濕度條件培養。2、一種根據權利要求1的從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞的方法制得的肝芽干細胞。3、一種根據權利要求1的從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞的方法制得的肝芽干細胞，其特征在于該肝芽干細胞表達ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit肝干細胞相關分子標志，而不表達AFP、TAT和HNF;還表達SDF-1間質細胞的分子標志；以及Oct4、Nanog多能性干細胞標志；另外，該肝芽干細胞經體外誘導，分化為內胚層的成熟肝細胞、膽管細胞和胰e細胞；外胚層的神經細胞或中胚層的脂肪細胞及成骨細胞。4、一種根據權利要求1的從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞的方法制得的肝芽干細胞作為臟器疾病的細胞治療及組織工程中細胞來源的應用。全文摘要本發明涉及生物醫學
技術領域：
，具體涉及肝芽干細胞，及其制備方法和用途。近年來干細胞生物學得到了迅猛的發展。肝干/祖細胞的分離培養及其深入研究對于肝臟發育、肝臟腫瘤和肝臟再生的發生機理以及多種肝臟疾病的防治都具有十分重要的價值。目前成功培養的肝干/祖細胞系是十分有限的。本發明是從孕4.5～6周的人胚肝芽組織中分離到的一種多潛能的干細胞，對于肝臟發育與再生等相關醫學問題的認識具有重要意義，并為肝干細胞生物學的研究提供一個理想的細胞模型，也有可能為各種因素所致肝臟疾病的細胞治療、藥物的篩選、組織工程等多個領域的研究提供一種理想的細胞來源。文檔編號A61K35/54GK101363010SQ20081004268公開日2009年2月11日申請日期2008年9月9日優先權日2008年9月9日發明者胡以平,娟蘇申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學